Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Taiwan (Ministerium für Wissenschaft und Technologie, 100-2923-B-002-002-MY3 und 106-2313-B-002-011-MY3, H.J.L.), der Tschechischen Republik (gewähren Agentur der Südböhmischen Universität, GAJU gewähren Y.H.L 065/2017/P), und Spanien ( Gewähren Sie spanischen Wirtschaftsministerium und Wettbewerbsfähigkeit, räumt CGL2012-36251 und CGL2015-64727-P X.B. und der katalanischen Regierung 2014 SGR 619 X.B.); Es erhielt auch finanzielle Unterstützung aus dem Europäischen Fonds für wirtschaftliche und Regionalentwicklung (FEDER Mittel zu X.B.).

(1) Synthese und Vorbereitung der dsRNA
<ol><li>DsRNA-Ziel-Sites in der 3' untranslatierten Region der Zielgene zu identifizieren. Die DsTub dient zur Ausrichtung auf das α-Tubulin (Wanne) Gen (GenBank Zbl-Nummer: KX228233), und DsEGFP wie ein negativer DsRNA-Steuerelement aus der Abfolge von konzipiert ist grüne Fluoreszenz-Protein (EGFP; GenBank Zbl-Nummer: LC311024).</li>
	<li>Führen Sie standard PCR Verstärkung um die DsRNA-Vorlagen mit Gen-spezifische Primer, enthält die T7 promotorsequenz synthetisieren (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 "). Die PCR-Amplifikation Zustände und Primer-Informationen verwendet sind die gemeldeten Lin Et Al. (2017) 12 (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fahren Sie mit DsRNA Vorbereitung mit einer T7 Transkription Kit (siehe Tabelle der Materialien), nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Hohe Quantität DsRNA, mischen zwei Reaktionen in einem Rohr (in insgesamt 40 µL), und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL DNase (siehe Tabelle der Materialien) in DsRNA Proben für 15 min bei 37 ° C zu verdauen DNA-Vorlagen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.</li>
	<li>Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min, dann Aufschwemmen Sie DsRNA mit RNase-freies Wasser.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Menge der gereinigten DsRNA mit einem Mikro-Volume UV-Vis Spektralphotometer (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers und Anpassung an die gewünschte Konzentration (z.B., 0,25 µg/µL für Zubereitung von DsRNA Lipoplexes).</li>
	<li>Speichern Sie die DsRNA Proben bei-20 ° C für bis zu 3 Monaten.</li>
</ol>2. Vorbereitung des DsRNA Lipoplexes
<ol><li>Verdünnen Sie 4 µL des Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung verdünnt werden. Verdünnen Sie 4 µL DsRNA (1 µg) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung.</li>
	<li>Hinzufügen der verdünnten Liposomen Reagenzlösung unmittelbar in die verdünnte DsRNA-Lösung auf einmal. Vortex kurz zu vermischen, dann 15 Minuten bei 25 ° c inkubieren Hinweis: Verwechseln Sie nicht die Lösungen in umgekehrter Reihenfolge.</li>
	<li>DsRNA Lipoplexes sind einsatzbereit. Innerhalb von 1 Stunde Vorbereitung, und verwerfen nach 1 Stunde. Hinweis: Nach den Anweisungen des Herstellers sollte so bald wie möglich den Lipoplexes verwendet werden.</li>
</ol>3. Sammlung von extrazellulären Enzyme vom Hämolymphe und Mitteldarm Saft
<ol><li>
Insekt-saline-Puffer (10 X verfügbar)
	<ol>
<li>Mischen Sie 900 mL mit 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl und 6,3 g CaCl28,3 g MgCl2·6H2O. Doppeltes destilliertes Wasser</li>
		<li>Passen Sie pH-Wert auf 6,8 an, und füllen Sie bis zu 1.000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hämolymphe Sammlung
	<ol>
<li>Betäuben Sie die Kakerlaken auf Eis, bis sie sich 3 Minuten lang nicht bewegen.</li>
		<li>Halten Sie die Schabe mit zwei Fingern (Daumen und Zeigefinger) und auftauchen Sie der Bauchseite die Schabe.</li>
		<li>Verwenden Sie die sezierenden Scheren aus der Spitze von einer Coxa ein Hinterbein abgeschnitten. Hinweis: Schneiden Sie die angeschlossenen Schnittpunkt zwischen Coxa und Trochanter. Die Exzision des anderen Teils Coxa war weniger effizient, Hämolymphe zu sammeln.</li>
		<li>Drücken Sie den Bauch sanft mit Mittelfinger und sammeln Sie die Hämolymphe Blutungen aus der Schnitt mit einer 10 µL Mikropipette.</li>
		<li>Die Hämolymphe aus mehreren Kakerlaken (5 Personen) in einem Microcentrifuge Schlauch zu bündeln. Hinweis: Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, Melanization zu verhindern. Das durchschnittliche Volumen der Hämolymphe erhalten von einem männlichen Schabe ist ca. 2-3 µL.</li>
		<li>Spin-down der Hämolymphe kurz mit einem Benchtop-Zentrifuge für 10 s.</li>
		<li>Übertragen Sie gewünschte Lautstärke der Hämolymphe (d.h. 10 µL) zu, und mischen Sie es mit 50 µL 1 X Insekt saline Puffer.</li>
		<li>Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, unten Hemocytes zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A28015zu quantifizieren.</li>
		<li>Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitteldarm Saft Sammlung
	<ol>
<li>Die Kakerlaken auf dem Eis zu betäuben. Repariere die Kakerlaken Bauchseite auf der Dissektion Platte mit kalten 1 X Insekt saline Puffer mit Insekt Pins.</li>
		<li>Zerlegen Sie den Bauch mit einer feinen Pinzette. Gesamte Darm (einschließlich des vorderen Mitte und Hinterbeinen Darms) auf einen frischen Teller mit 1 x Insekt saline Puffer zu entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie den vorderen und hinteren Darm und schnelle Übertragung der Mitteldarm zu einem Microcentrifuge Schlauch, der 100 µL Insekt saline Puffer enthält.</li>
		<li>Bündeln Sie die Midguts von sechs Kakerlaken im gleichen Rohr und Wirbel für 10 s.</li>
		<li>Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, die Hemocytes und Darm Gewebe zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A28015zu quantifizieren.</li>
		<li>Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DsRNA Abbau Assay
<ol><li>Frisch bereiten Sie 4 µL des nackten DsRNA oder DsRNA Lipoplexes (1 µg zu).</li>
	<li>Mischen Sie DsRNA Lösungen mit 10 µL Insekt saline Puffer (Kontrolle), extrahiert Enzyme vom Hämolymphe oder Mitteldarm Saft.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL RNase-freies Wasser oder EGTA (20 mM), Proben als Steuerelemente für die Hemmung der Enzym-Aktivitäten zu trennen.</li>
	<li>1 Stunde oder länger (6, 12 oder 24-Stunden) bei 25 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.</li>
	<li>Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.</li>
	<li>Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min. Aufschwemmen DsRNA mit 10 µL RNase-freies Wasser zu entfernen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Integrität der behandelten DsRNA per Gelelektrophorese auf einem 1,5 % Agarose-Gel.</li>
</ol>(5) die orale Verabreichung von dsRNA
<ol><li>Kakerlaken auf eine Ad Libitum Ernährung Trockenfutter (Hund Chow) zu erhalten. Wasserversorgung von den Kakerlaken DsRNA Einnahme Experimente am Vortag zu berauben.</li>
	<li>Halten Sie eine Kakerlake, packte seine Flügel mit der flexiblen Zange (Abbildung 1, Schritt 5). Hinweis: Berühren Sie nicht die Körperteile von Kakerlaken.</li>
	<li>Vorbereiten der DsRNA Lipoplexes sowie nackt DsRNA, Fütterung, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Hinweis: DsRNA Lipoplexes sollte vor der Fütterung frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Futter 4 µL DsRNA Lipoplexes oder nackt DsRNA (250 ng) mit einer Mikropipette.</li>
	<li>Langsam pipettieren der Tropfen der DsRNA-Lösung die Mundwerkzeuge der Kakerlaken in der Nähe und lassen Sie die Kakerlaken aufnehmen des tröpfchens komplett.</li>
	<li>Durchführen Sie zweimal täglich (1 h nach Lichter auf und 1 h vor dem Licht aus) die Einnahme Experimente, für 8 oder 16 Tage kontinuierlich. Hinweis: Alle Kakerlaken erworben Wasser nur durch manuelles zuführen mit DsRNA Lösung oder Kontrolle Reagenzien (z. B.Nuklease freies Wasser, Glukoselösung und Liposomen Reagenz) während der Einnahme Experimente.</li>
	<li>Die Kakerlaken ermöglichen Sie Wasserflaschen nach 16 Tagen der Einnahme von DsRNA Experimente.</li>
</ol>6. beurteilen Knockdown
<ol><li>Gewählten Zeitpunkt Punkte (2, 9 und 17 Tage nach DsRNA Einnahme Assay), die DsEGFP und DsTub-behandelten Insekten sammeln und sezieren die gewählten Gewebe (z.B. Mitteldarm).</li>
	<li>Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR). Die qRT-PCR-Amplifikation Bedingungen und Primer-Informationen wie Lin Et al.berichtet. (2017) 12.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Kontrolle und DsRNA-behandelte Insekten täglich Sterblichkeit zu überprüfen und entfernen die Kakerlaken, die nicht mehr in Bewegung sind.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicing+and+slicing:+The+core+machinery+of+the+RNA+interference+pathway.">Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway.</a> FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).</li><li>Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll stellt eine Methode für wirksame RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA Lipoplexes, denen Schutz gegen Ribonuklease Verdauung in den Mitteldarm Saft der deutschen Schabe. Wie in anderen Studien in verschiedenen Insektenarten gezeigt, der Armen RNAi-Effekt durch mündliche Lieferung von DsRNA vor allem durch den Abbau von DsRNA8,9,10entfallen. Dieses Protokoll produziert Liposomen, die als schützende Fahrzeuge in mündlichen Lieferung von DsRNA gegen Abbau im Darm dienen. Darüber hinaus ist die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes einfach und leicht anwendbar als mündliche RNAi, insbesondere für Insekten mit starken Ribonuklease-Aktivität im Darm.
Im Vergleich zu anderen Studien, die relativ große Mengen an nackt DsRNA in verschiedenen Insekten10,18,19 Feed, dieses Protokoll verwendet oralen Verabreichung eine relativ geringe Menge an DsRNA (0,5 µg pro Tag), wodurch eine signifikante Erschöpfung der Ziel-gen-Expression in den Mitteldarm von B. Germanica. Wesentliche Aspekte des Protokolls sind die genaue Fütterung Methode und kumulierte Einnahme von geringen Mengen an DsRNA. Erstens die Fütterung Technik eignet sich für eine kontinuierliche Einnahme-Assay und minimiert die Variation der aufgenommenen DsRNA Menge pro einzelne Insekt. Zweitens war die Erschöpfung Wirkung der Wanne Ausdruck in den Mitteldarm gezeigt, Steigerung von 40 % am Tag 9 bis 60 % am Tag 17 mit kontinuierliche orale Verabreichung von DsTub Lipoplexes(Abbildung 3). Obwohl die nackten DsRNA mit ex Vivo Inkubation der Mitteldarm Saft innerhalb von 1 h (Abb. 2A) schneller abgebaut wurde, führte die kontinuierliche Fütterung nackt DsRNA für 16 Tage auch eine bedeutende Entleerung der Wanne Ausdruck in den Mitteldarm(Abbildung 3). Darüber hinaus ist die längere kontinuierliche Beschickung der DsRNA Lipoplexes für 16 Tage eine Anforderung, eine auffällige tödliche Wirkung von RNAi verursachen.
Obwohl die Liposomen-Träger (siehe Tabelle der Materialien) verwendet hier waren ursprünglich für in-vitro- Transfektion von DNA in Insektenzellen, gab es kein Problem diese Liposomen-Reagenz als Vehikel der DsRNA für mündliche Lieferung in unserem Insekt Modell anwenden. Viele Studien belegen auch erfolgreich zur Verbesserung der RNAi zum Schweigen zu bringen, in anderen Insektenarten mit verschiedenen Liposomen Reagenzien, die für entweder DNA oder RNA Moleküle17,20,21ausgelegt sind. Dennoch, der Mechanismus der DsRNA Aufnahme im Insekt Darm ist noch nicht vollständig untersucht und die Liposomen-Delivery-System könnte die Aufnahme von DsRNA in die Zellen aufgrund seiner Biokompatibilität mit Phospholipid Struktur22erhöhen. Daher könnte die mündlichen Lieferung von DsRNA in Liposomen verkapselt eine geeignete Strategie zur effizienten RNAi aufgrund der Verzögerung des Abbaus von RNases (Abbildung 2) zu erreichen.
Ein Nachteil dieses Protokolls möglicherweise die kleine Menge von DsRNA in den Liposomen-Trägern und somit erfordern längere kontinuierliche Beschickung. Die Beschränkung von einem solchen besonderen Verhältnis zwischen DsRNA, Liposomen (0,25 µg:1 µL) ist aufgrund des Designs des kommerziellen Liposomen Reagens, nach Empfehlung des Herstellers. Die Formulierungen in der Vorbereitung von Liposomen Nanopartikeln mit größeren Durchmesser und unterschiedlicher Ladung auf der Oberfläche Lipoplexes sind berichtet, die Verkapselung von SiRNA und RNAi-Stummschaltung-Effizienz23,24zu erhöhen. Daher die verschiedenen Liposomen-Nanopartikel auch einsetzbar, Fütterung Verfahren zu verbessern.

RNAi ist durch einen Mechanismus eines Posttranskriptionale stummschaltungs-Signalwegs, ausgelöst durch DsRNA Moleküle in viele Eukaryonten1als eine wirksame Methode, Knockdown Genexpression nachgewiesen. Im letzten Jahrzehnt Studie geworden RNAi ein nützliches Werkzeug, um die Funktionen von Genen aus Entwicklung, Verhalten zu studieren, durch Abbau der Expression bestimmter Gene mittels Injektion und/oder Fütterung von DsRNA in verschiedenen Taxa Insekten2,3. Aufgrund der Spezifität und Robustheit der abbauende Wirkung ist die Anwendung der RNAi derzeit als mögliche Strategie zur Pest Control Management4,5geprüft. Jedoch sehr unterschiedlich die Effizienz der RNAi Insektenarten, je nach den verschiedenen Genen angestrebt und die Versandmethoden. Eine wachsende Zahl von beweisen deutet darauf hin, dass die Instabilität der DsRNA, die durch Ribonuclease abgebaut wird, ein kritischer Faktor bei der begrenzten Wirksamkeit von RNAi5,6 ist. Zum Beispiel hat die geringe Sensitivität der RNAi in Manduca Sexta durch die Tatsache erklärt worden, dass die DsRNA gemischt mit Hämolymphe innerhalb von 1 Stunde7schnell abgebaut wurde. Ebenso ist die Anwesenheit von Alkali Nukleasen in den Mitteldarm die aufgenommenen DsRNA effizient zu degradieren, stark korreliert mit geringe RNAi-Effizienz in verschiedenen Insektenordnungen8,9,10.
Die mündlichen Lieferung von DsRNA ist besonders interessant für die Anwendung der RNAi in einer Pest Control-Strategie, sondern eine Methode, um den Abbau von DsRNA durch Nukleasen in den Mitteldarm verzögern nicht noch entwickelt wurde, die hätten des Potenzials, wirksam sichern RNAi durch Fütterung. Jedoch wurde die Teilnahmslosigkeit der RNAi mündlichen Lieferung von DsRNA berichtet, durch große Menge an DsRNA, z. B. 50 µg in Bombyx Mori, Fütterung oder kontinuierlich füttern für 8 Tage (8 µg DsRNA insgesamt) in der Locust-Spezies. Die Deutsche Schabe, Blattella Germinica, reagiert sehr empfindlich auf RNAi durch die Injektion von DsRNA11,12,13,14, aber ist nicht ansprechend auf DsRNA durch Fütterung. Vor kurzem, Lin Et al. (2017) haben gezeigt, dass die DsRNA mit Liposomen Träger führt zu erfolgreichen RNAi, Zuschlag die α-Tubulin -gen-Expression in den Mitteldarm und Trigger erhebliche Mortalität der deutschen Schabe15gekapselt. Wie der Abbau von DsRNA in den Mitteldarm der limitierende Faktor für mündliche RNAi ist, dienen die Liposomen-Träger als Vehikel DsRNA vor Erniedrigung, zu schützen, die bei anderen Insekten mit starken Nuklease Aktivitäten im Darm leicht anwendbar ist. Der Hinweis, der Grund für die Wahl des bestimmten Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) wir verwendet wie Liposomen Träger in das aktuelle Protokoll ist, dass es für Insekten Zelle Zeile Transfektion mit weniger Toxizität getestet wurde nach dem Anweisungen des Herstellers. Nach dem Vergleich der verschiedenen Liposom Transfection Systeme in Gharavi Et al. (2013) 16, ist die Effizienz der transfecting kleine interferierende RNA (SiRNA) ungefähr gleich zwischen diesem und anderen handelsüblichen Systemen, die für DsRNA-Delivery-Systeme in anderen Insekten17,18 verwendet wurden . Darüber hinaus ist unsere Fütterung Methode vorsichtig genug, um die richtige Menge an DsRNA von jeder Schabe eingenommen wird, und dass die Ergebnisse sind robust und bestätigten zu gewährleisten. Zusammenfassend lässt sich sagen zeigen die dieses Protokolls und die Ergebnisse, dass mit DsRNA Lipoplexes DsRNA Stabilität verbessert und die Tür für das Design der Strategie mündlichen Lieferung von RNAi öffnet, die ist ein vielversprechender Ansatz zur Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1124px;" width="1123">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent</td>
			<td style="width:133px;">SignaGen</td>
			<td style="width:157px;">SL100499</td>
			<td style="width:481px;">for lipoplexes preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blend Taq plus</td>
			<td style="width:133px;">TOYOBO&#160;</td>
			<td style="width:157px;">BTQ-201</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast SYBR Green Master Mix</td>
			<td style="width:133px;">ABI&#160;</td>
			<td style="width:157px;">4385612</td>
			<td>for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">FirstChoice RLM-RACE Kit</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">AM1700</td>
			<td>for 3&#39; UTR identification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">AMB13345</td>
			<td>for dsRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO DNase</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">AM2239</td>
			<td>remove DNA template from dsRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIzol</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">15596018</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RQ1 RNase-Free Dnase</td>
			<td style="width:133px;">Promega</td>
			<td style="width:157px;">M6101</td>
			<td>remove DNA template from total RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C2432</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">I9516</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24102</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Diethyl pyrocarbonate, DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">D5758</td>
			<td>for RNase free water preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">glucose solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">G3285</td>
			<td>for lipoplexes preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">S7653</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P9333</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:352px;">Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">M2670</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">EGTA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">E3889</td>
			<td>enzyme inhibitor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting scissor</td>
			<td style="width:133px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>cockroach dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fine tweezers</td>
			<td style="width:133px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>cockroach dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">flexible tweezer</td>
			<td style="width:133px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>cockroach holding&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipetman</td>
			<td style="width:133px;">RAININ</td>
			<td style="width:157px;">P10</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:133px;">Axygen</td>
			<td>MCT175C, PCR02C</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">pipette tip&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Axygen</td>
			<td></td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">vortexter</td>
			<td style="width:133px;">Digisystem</td>
			<td style="width:157px;">vm1000</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Minispin centrifuge</td>
			<td style="width:133px;">The Gruffin Group</td>
			<td style="width:157px;">GMC 206</td>
			<td>for liquid spin down&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:133px;">ALC</td>
			<td style="width:157px;">PK121R</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">JENCO</td>
			<td style="width:157px;">6071</td>
			<td>for pH adjust</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">micro-volume spectrophotometer</td>
			<td style="width:133px;">Quawell</td>
			<td style="width:157px;">Q3000</td>
			<td>nucleic acid quantitative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">PCR Thermal cycler</td>
			<td style="width:133px;">ABI&#160;</td>
			<td style="width:157px;">2720</td>
			<td>for template PCR or&#160; dsRNA synthesis incubation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quantitative real-time PCR</td>
			<td style="width:133px;">ABI&#160;</td>
			<td style="width:157px;">StepOne plus</td>
			<td>gene expression quantitative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifugal Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:133px;">eppendorf</td>
			<td style="width:157px;">5301</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multipette&#160;</td>
			<td style="width:133px;">eppendorf</td>
			<td style="width:157px;">xstream</td>
			<td>for real-time PCR sample loading&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose I</td>
			<td style="width:133px;">amresco</td>
			<td style="width:157px;">0710</td>
			<td>for nucleic acid electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub gene specfifc forward preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub gene specfifc reverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsTub template forward primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsTub template reverse primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsEGFP template forward preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsEGFP template reverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub qPCR forward primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub qPCR reverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">ef1 qPCR forward primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">ef1 qPCRreverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical use of rna interference: oral delivery of double-stranded rna in liposome carriers for cockroaches

RNA-Interferenz (RNAi) hat für die Aufdeckung der biologischen Funktionen von zahlreichen Genen weit angewendet worden und hat als eine Pest Control Tool betriebliche durch Störung der wesentlichen Genexpression vorgesehen. Obwohl verschiedene Methoden, wie Injektion, füttern und Tränken, für die erfolgreiche Durchführung der doppelsträngige RNA (DsRNA) gemeldet worden sind, ist die Effizienz der RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA hochvariablen unter verschiedenen Insektengruppen. Die Deutsche Schabe, Blattella Germanica, ist sehr empfindlich auf die Injektion von DsRNA, wie von vielen bisher veröffentlichten Studien gezeigt. Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode, um nachzuweisen, dass die DsRNA gekapselt mit Liposomen Träger ausreichen, um den Abbau von DsRNA Mitteldarm Fruchtsaft zu verzögern. Vor allem die kontinuierliche Beschickung der DsRNA deutlich von Liposomen verkapselt reduziert den Tubulin-Ausdruck in den Mitteldarm und führte zum Tod von Kakerlaken. Abschließend könnte die Formulierung und Verwendung von DsRNA Lipoplexes, die DsRNA gegen Nukleasen zu schützen, eine praktische Anwendung der RNAi für Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.

Ein vereinfachtes Schema des Protokolls für die mündlichen Lieferung von DsRNA präsentiert sich in Abbildung 1, wo die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes gezeigt werden.
Um den Schutz von Liposomen Trägern auf DsRNA Abbau in den Mitteldarm Saft B. Germanica, ein ex-Vivo -Test wo DsTub Lipoplexes mit Mitteldarm Saft inkubiert wurden durchgeführt wurde und die Integrität der DsRNA zu untersuchen wurde anschließend auf einem 1,5 % Agarose-Gel analysiert. Abbildung 2 zeigt, dass starker RNA-Nuklease-Aktivität in den Mitteldarm Saft von B. Germanica (Abb. 2A), vorhanden war, während die Liposomen-Träger DsRNA gegen Abbau mindestens für 1 Stunde in der ex Vivo schützen konnten Inkubation (Abbildung 2A, B). Infolgedessen wurde die orale Einnahme von DsRNA Lipoplexes zweimal täglich angewendet, um die Anfälligkeit der Mitteldarm Gewebe für RNAi in den folgenden Experimenten zu erhöhen.
Validierung von RNAi Reaktion durch mündliche Lieferung von DsRNA wurde durch Messung der Wirkung der Entleerung der Wanne mRNA Expression in den Mitteldarm zu verschiedenen Zeitpunkten nach der kontinuierlichen Einnahme von DsRNA(Abbildung 3)beurteilt. Der Wanne Ausdruck in den Mitteldarm war deutlich nach der kontinuierlichen Einnahme von DsTub Lipoplexes für 8 Tage aufgebraucht. Während der kontinuierlichen Beschickung von DsRNA 16 Tage dauerte, war deutlich der Wanne Ausdruck in den Mitteldarm in die nackten DsTub und DsTub Lipoplexes Gruppen erschöpft (etwa durch 24 und 60 %, beziehungsweise) im Gegensatz zu den Steuerelementen. Abbildung 3 B zeigt eine konsistente, signifikante Erhöhung der Sterblichkeit nach der oralen Verabreichung von DsTub Lipoplexes für 16 Tage.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57385/57385fig1.jpg"> Abbildung 1 : Vereinfachtes Schema der mündlichen Lieferung von DsRNA Lipoplexes für Schaben. Die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes werden für die Schritte 1 bis 4 dargestellt. Die Fütterung Technik (Schritt 5) ist auf dem Foto gezeigt. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57385/57385fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57385/57385fig2.jpg"> Abbildung 2: Ex Vivo Abbau von DsRNA von B. Germanica Hämolymphe (Hemo) oder Mitteldarm Saft. (A) 1 µg nackt oder Liposomen-Cojugated DsTub wurde jeweils 1 h mit Kochsalzlösung Puffer und extrahierten Enzyme vom Hämolymphe (Hemo) oder Mitteldarm Saft, inkubiert. Die nackten DsTub, aber nicht Liposomen konjugiert DsTub wurde abgebaut, völlig wenn mit 1 x Mitteldarm Saft inkubiert. Die verschiedenen Verdünnungsfaktoren der ursprünglichen Mitteldarm Saft (1 X) sind angegeben. Der Abbau wurde durch Ionen-Chelat aufgrund der EGTA-Behandlung als Kontrolle gehemmt. (B) zeitabhängig Schutz der Liposomen verkapselt DsTub (1 µg) gegen ex-Vivo Abbau in Hämolymphe oder Mitteldarm Saft. Der Hinweis wurde die Liposomen konjugiert DsTub vollständig abgebaut, wenn mit Mitteldarm Saft nach 24 h inkubiert. Die Hämolymphe und Mitteldarm Saft dienten in der ursprünglichen Konzentration für verschiedene Zeiträume der Inkubation. Die Ergebnisse sind von Lin Et al.angepasst. (2017) 12. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57385/57385fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57385/57385fig3.jpg"> Abbildung 3 : Beeinflussung der RNAi Reaktion durch Einnahme von DsRNA B. Germanica. (A) Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) zur Bestimmung des relativen Wanne Ausdrucks in den Mitteldarm die Deutsche Schabe nach verschiedenen Fütterung Behandlungen. Der Ausdruck Niveaus der verschiedenen Behandlungen wurden auf die Glukose-Gruppe am Tag2 normalisiert. Werte sind der Mittelwert ± SE aus drei unabhängigen Experimenten (n = 3), jeweils mit 3-5 biologischen repliziert. Verschiedene Buchstaben auf den Balken zeigen signifikante Unterschiede bei p < 0,05 (Tukey HSD Post Hoc Test nach ANOVA) unter verschiedenen Behandlungsgruppen. (B) Survivorship von Kakerlaken, die nackte DsTub oder DsTub Lipoplexes für 8 Tage (8d) oder 16 Tage (16 d) aufgenommen (jeder Kohorte von 12-15 Personen; n = 3 unabhängige Experimente). Werte sind der Mittelwert ± SE. verschiedene Buchstaben auf der Behandlungsgruppe zeigen signifikante Unterschiede bei p < 0,05 (Kruskal-Wallis-Test) für die Überlebenden. Die Ergebnisse sind von Lin Et al.angepasst. (2017) 12. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57385/57385fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches at JoVE.com

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben

Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

practical-use-rna-interference-oral-delivery-double-stranded-rna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Aufrufe.  National Taiwan University. Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.

Serie: Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Forschung

Biologie

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Substrat Generation für Endonukleasen der CRISPR / Cas-Systeme

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

Depletion der ribosomalen RNA für Mosquito Gut metagenomische RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA-Katalysator als Reporter für Drogen-Screening gegen RNA-Editing in Trypanosomen

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully annotated genome sequence, transposon-based transgenesis, and effective RNA interference (RNAi). Among these advantages, RNAi-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. T. castaneum show a robust systemic RNAi response, making it possible to perform RNAi at any life stage by simply injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the beetle&#8217;s body cavity.
In this report, we provide an overview of our larval RNAi technique in T. castaneum. The protocol includes (i) isolation of the proper stage of T. castaneum larvae for injection, (ii) preparation for the injection setting, and (iii) dsRNA injection. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides us with quick access to loss-of-function phenotypes, including multiple gene knockdown phenotypes as well as a series of hypomorphic phenotypes. Since virtually all T. castaneum tissues are susceptible to extracellular dsRNA, the larval RNAi technique allows researchers to study a wide variety of tissues in diverse contexts, including the genetic basis of organismal responses to the outside environment. In addition, the simplicity of this technique stimulates more student involvement in research, making T. castaneum an ideal genetic system for use in a classroom setting.

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA interference (RNAi)-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. Here, we provide an overview of our larval RNAi technique in Tribolium castaneum. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides quick access to loss-of-function phenotypes, allowing researchers to study gene functions in diverse contexts.

Larven RNA-Interferenz in das rote Mehlkäfer,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Production of Double-stranded DNA Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ministrings possess a heightened safety profile and also efficiently deliver DNA cargo to targeted cells. Conventional DNA vectors carry undesirable prokaryotic sequences, including antibiotic resistance genes, CpG motifs, and bacterial origins of replication, which may lead to the stimulation of host immunological responses. The bioavailability of conventional DNA vectors is also compromised due to their larger molecular size. Their circular nature may also impart chromosomal integration, leading to insertional mutagenesis.
Bacterial sequences are excised from DNA minivectors, leaving only the gene of interest (GOI) and necessary eukaryotic expression elements. Our LCC DNA minivectors, or DNA ministrings, are devoid of immunogenic bacterial sequences; therefore improving their bioavailability and GOI expression. In the event of vector integration into the chromosome, the LCC DNA ministring will lethally disrupt the host chromosome, thereby removing the potentially dangerous mutant from the proliferating cell population. Consequently, DNA ministrings offer the benefits of &#39;minicircle&#39; DNA while eliminating the potential for undesirable vector integration events. In comparison to conventional plasmids and their isogenic circular covalently closed (CCC) counterparts, DNA ministrings demonstrate superior bioavailability, transfection efficiency, and cytoplasmic kinetics - they thus require lower amounts of cationic surfactants for effective transfection of target cells.
We have constructed a one-step inducible in vivo system for the production of DNA ministrings in Escherichia coli that is simple to use, rapid, and scalable.

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

Die Produktion von Doppelstrang-DNA-Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...