이 작품에서 국립 암 센터, 한국 (1510121) 및 국가 연구 재단, 한국 (아니 K. 수소를 연구 보조금에 의해 지원 되었다. NRF-2015R1A2A2A04007432).

연구 프로토콜은 기관 검토 위원회의 국립 암 센터, 한국 (NCCNCS-12-630)에 의해 승인 되었다.
1. 샘플 준비 (30 분)
<ol><li>HeLa 세포 (CCL 2, ATCC)의 문화에 대 한 100 m m 문화 접시에 10 mL 전체 DMEM 매체 (10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 펜-strep)를 사용 합니다. 혈 청에 굶주린 HeLa 세포를 준비 하려면 품 어 소 태아 혈 청 하지 않고 DMEM에 confluent HeLa 세포 48 시간에 대 한 이전 연구11에 설명 된 대로.</li>
	<li>세포를 분리 하려면 2 mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께 그들을 씻어 하 고 100 m m 문화 접시 당 0.25 %EDTA 트립 신 2 mL를 추가 합니다. 그런 다음 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 2-3 분 동안 품 어</li>
	<li>트립 신, 비활성화 문화 접시에 완전 한 DMEM 매체의 5 mL을 추가 하 고 15 mL 튜브를 분리 된 세포를 전송. 그런 다음에 펠 릿을 형성 하기 위하여 10 분에 대 한 300 x g에서 셀 원심.</li>
	<li>상쾌한, 제거 하 고 10 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 두 번 2 mL 차가운 PBS 가진 펠 릿을 세척.</li>
	<li>상쾌한의 제거 후, 셀 펠 릿을 95% 에탄올의 1 mL을 추가 하 고 vortexing에 의해 셀 펠 릿 에탄올과 혼합 합니다. 셀 블록 준비까지 얼음에 고정된 셀을 계속.</li>
</ol>2. 셀 블록 준비 (1 시간 30 분)
<ol><li>냉동된 플라즈마의 준비에 대 한 aliquots, 건강 한 기증자 혈액에서 EDTA 플라즈마를 수집 하 고 표면에 뜨는 플라즈마를 수집 하는 13000 x g에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 약 200-400 수 µ L 각에 microfuge 관. 사용까지-80 ° C에서 aliquots를 저장 합니다. 냉동된 플라즈마 aliquots 준비가 되 면, 그들을 검색 하 고 5 분 동안 37 ° C에 외피에 의해 플라즈마를 녹여.</li>
	<li>10 분 동안 700 x g에 고정 된 세포를 원심 다음 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>플라즈마, thromboplastin, 2 방울 및 0.025 M 염화 칼슘 2 방울 2 방울 (약 200 µ L) 셀 펠 릿 믹스. 그런 다음 pipetting으로 그들을 믹스.</li>
	<li>그림 2A와 같이 10 분 동안 실내 온도에 셀 응고를 형성 하기 위하여 혼합물을 허용 한다. 그런 다음 세척 PBS와 셀 응고 두 번 붓는 피 펫으로 PBS를 제거 하 여. 대표적인 화이트 셀 응고는 그림 2B에 표시 됩니다.</li>
	<li>포 르 말린와 필터 종이 축 축 하 게을 미리 moistened 필터 종이 셀 응고를 포장. 그런 다음 그림 2C와 같이 조직 카세트에는 pincette와 응고 혼합물을 놓습니다.</li>
	<li>포 르 말린 고정을 위한 4 ° C에서 하룻밤 버퍼링 된 포 르 말린 (10% 포 르 말린 PBS에) 50 mL를 포함 하는 유리 항아리에 조직 카세트 장소.</li>
</ol>3. 조직 처리 및 파라핀 포함 (하룻밤)
<ol><li>포함 하는 포 르 말린 고정 셀 응고 조직 카세트 로드 조직 프로세서에서 앞에서 설명한11하룻밤. 조직 처리 물 제거 및 파라핀 포함 이전에 고정 된 세포의 조절입니다. 조직 처리 없이 연구를 위한 조직 표 1에 표시 된 것 처럼 절차를 처리를 수행 합니다.</li>
	<li>(그림 2D) 온수 포함 역, 및 60 분 후, 검사는 녹은 파라핀 금속 금형에 거기에 설정.</li>
	<li>조직 카세트에서 형성된 된 셀 응고 하 고 금속 금형 내에서 녹은 파라핀에.</li>
	<li>장소는 셀을 포함 하는 금속 금형에 뚜껑 없이 새로운 조직 카세트 녹은 파라핀 중간 응고와 조직 카세트에 그리고 금속 금형에 더 많은 녹은 파라핀을 부 어. 그런 다음 30-60 초에 대 한 차가운 접시에 공고히 파라핀 하자.</li>
	<li>금속 금형에서 조직 카세트를 분리 합니다. 그런 다음 파라핀 셀 블록은 immunocytochemistry에 대 한 준비. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 포함 된 셀 응고 그림 2E에서 화살표로 표시 됩니다.</li>
</ol>4. Immunocytochemistry (1 시간)에 대 한 슬라이드의 준비
<ol><li>파라핀 셀 블록에 셀 응고에 대 한 영역을 확인 하 고는 톰을 사용 하 여 3-4 µ m의 두께와 조각으로 셀 블록을 잘라. 그림 2 층에서 보는 바와 같이 실 란 코팅 된 유리 슬라이드에 파라핀 섹션을 넣어.</li>
	<li>슬라이드에 고착 하는 섹션을 30 분 동안 37 ° C 오븐에 섹션 슬라이드를 놓습니다.</li>
</ol>5. 셀 블록 (6 h) Immunocytochemistry
참고: immunocytochemical 셀 블록 섹션에 얼룩, 다양 한 키트 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 이러한 키트는 다양 한 감도 특이성 그들의 수정에 따라 있다.
<ol><li>크 실 렌 드 paraffinize 4 분의 50 mL에 섹션을 품 어.</li>
	<li>100% 에탄올 탈수에 대 일 분에 두 번 95% 에탄올, 및 2 분 80% 에탄올에 슬라이드를 품 어. 그런 다음, 실행 10 분 동안 물에 에탄올을 제거 합니다.</li>
	<li>항 원 복구에 대 한 병 포함 40 mL 트리 스-EDTA 검색 버퍼, pH 9.0, 슬라이드를 놓고 30 분 동안 솥에 삶아.</li>
	<li>실행 물, 아래 슬라이드를 세척 하 고 95% 에탄올 4 ° c.에서 10 분 동안에 그들을 품 어 다음, 슬라이드에 세포 얼룩 지역 Pap 펜 쉽게 식별을 표시 합니다.</li>
	<li>Tris 버퍼 식 염 수 0.2%를 포함 하는 슬라이드 워시 트윈 20 (TBS-T), 그리고 과산화 수소 블록에서 품 어 ( 재료의 표참조) 모든 나머지 과산화 효소 활동을 제거 하려면 15 분 동안 실내 온도에. 그런 다음 2 분에 대 한 세 번 TBS T에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 단백질 블록에서을 diluting 하 여 희석된 항 체 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조). 예를 들어 기본 항 체 수 CKAP2 희석 배율을 사용, 그리고 기-67 항 체 1: 500. 다음, 1 시간에 대 한 항 체 희석된 솔루션의 100 µ L에서 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척, 후 어둠 속에서 실 온에서 15 분 동안 키트에 기본 항 체 증강에 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>4 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척 후 HRP 폴리머 (이차 항 체 양 고추냉이 과산화 효소와 함께 표시)의 2 방울을 추가 하 고 30 분 동안 실내 온도에 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척, 후 추가 diaminobenzidine (DAB) 솔루션의 100 µ L ( 재료의 표참조), 그리고 3 분에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>씻은 후 TBS T에 두 번, 되며 솔루션 (100 µ L 되며의와 600 µ L의 증류수의 혼합물), 100 µ L을 추가 하 고 1 분에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>TBS-T에서 슬라이드를 한 번 세척 후 2 분에 대 한 95% 에탄올에 잠복기, 95% 에탄올에 담그고 한 번, 그리고 두 번 100% 에탄올에 담그고 탈수. 그런 다음 5 분 동안 유리 항아리 자일 렌 40 mL에에서 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>슬라이드는 크 실 렌에서 건조, 각 coverslips를 탑재 합니다.</li>
	<li>가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 얼룩 패턴을 관찰 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+immunofluorescence+of+cultured+cells.">High-quality immunofluorescence of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).</li><li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+-+Avoiding+the+pit+falls.">Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls.</a> J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li><li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Techniques.">Immunofluorescence Techniques.</a> J Invest Dermatol. 133, e4 (2013).</li><li>Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+the+thromboplastin-plasma+cell-block+technique+for+fine-needle+aspiration+and+serous+effusions.">The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions.</a> Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).</li><li>Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+the+cell+block+method+versus+the+conventional+smear+study+in+pleural+fluid+cytology.">Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology.</a> J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).</li><li>Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+block+cytology:+Improved+preparation+and+its+efficacy+in+diagnostic+cytology.">Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology.</a> Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).</li><li>Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value,+feasibility,+and+validity+of+preparing+cell+blocks+from+fluid-based+gynecologic+cytology+specimens.">Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens.</a> Cancer. 96, 204-209 (2002).</li><li>Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value+of+electron+microscopy+on+paraffin-embedded+cytologic+material.">Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material.</a> Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).</li><li>Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mouse+cytoskeleton-associated+protein,+CKAP2,+with+microtubule-stabilizing+properties.">Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties.</a> Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).</li><li>Hong, K. U., Choi, Y. -. B., Lee, J. -. H., Kim, H. -. J., Kwon, H. -. R., Seong, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+phosphorylation+of+tumor+associated+microtubule+associated+protein+(TMAP)/cytoskeleton+associated+protein+2+(CKAP2)+at+Thr-596+during+early+phases+of+mitosis.">Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis.</a> Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).</li><li>Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -. L., Poojan, S., Hong, H. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CKAP2+(cytoskeleton-associated+protein2)+is+a+new+prognostic+marker+in+HER2-negative+luminal+type+breast+cancer.">CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182107 (2017).</li><li>Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+is+a+prognostic+parameter+in+breast+cancer+patients:+results+of+a+large+population-based+cohort+of+a+cancer+registry.">Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry.</a> Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).</li><li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis.">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).</li><li>Beutner, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining:+The+fluorescent+antibody+method.">Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).</li></ol>

모든 저자는 관심 없음 충돌 선언 하 고 있다.

Immunofluorescent 고정된 경작된 한 세포에 얼룩 현재 형태학 정보1을 유지 하면서 단백질 표정 수준 셀에서의 결정에 대 한 선택의 방법입니다. 그러나, immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 우수한 대안을 수 있습니다. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록와 immunocytochemistry의 준비에 대 한 자세한 절차는이 프로토콜에서 설명 되었습니다 그리고 우리 immunocytochemistry 셀 연구에의 응용을 촉진할 수 있다 바랍니다.
Immunocytochemistry immunofluorescent 얼룩 위에 몇 가지 장점이 있습니다. 하지만 갓 배양된 세포, 필요 immunofluorescent 일반적으로 셀에 대 한 얼룩 파라핀 셀 블록 몇 년13실 온에서 보관 하실 수 있습니다. 또한, immunocytochemistry 셀 블록에 일상적인 immunohistochemistry 인간의 조직4에 사용 된 동일한 항 체를 채용 하 여 세포내 식 패턴을 탐색할 수 있습니다. 또한, 그것은 단백질 수준 또는 posttranslational 수정 미리 다양 한 약물 또는 다양 한 문화 조건11세포 배양 하 여 변화를 탐색할 수 있습니다.
Immunocytochemical 얼룩의 장점, 달리 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록의 준비 시간이 걸립니다 그리고 비용이 많이 드는14. 또한, 대부분 연구소가이 기법에서 경험이 부족 하 고 이러한 상황에서 기술적 오류는 일반적. 가장 일반적인 오류는 세포 형태학의 가난한 보존과 가난한 또는 불규칙 한 immunocytochemical 파라핀 셀 블록 섹션에 얼룩. 이들과 대부분의 다른 최고의 셀 조건 셀 블록을 만들고 충분 한 솔루션을 사용 하 여 셀 혈전을 형성 하 여 피할 수 있습니다.
현재 프로토콜의 데모, 셀 블록 HeLa 세포에 대 한 준비 하 고 두 확산 마커, CKAP2 및 이전에 보고 된11기-67에 대 한 수행 했다 immunocytochemical 얼룩. Immunocytochemistry, 세포가 외피와 소 태아 혈 청 하지 않고 미디어에 의해 조작 및 혈 청 기아의 효과 관찰 될 수 있었다. 많은 슬라이드만 슬라이드 당 4-5 µ m 두께 셀 블록 섹션을 사용 하 여 셀 블록에서 준비 될 수 있다 때문에 항 체의 많은 수에 대 한 이러한 준비 파라핀 포함 된 셀 블록을 사용할 수 있습니다. 따라서, 두 개의 서로 다른 조건에 해당 하는 식이 패턴은 여러 다른 항 체와 평가할 수 있습니다. immunostaining CKAP2에 대 한 패턴 및 조직 이미 되어 암에 기-67 보고9,10,,1112, 그리고 얼룩 결과 immunocytochemical 계산 될 수 쉽게, 때문에 얼룩 패턴 immunohistochemistry에서 그들과 아주 유사 했다.
끝으로, immunocytochemical 파라핀 셀 블록에 얼룩 immunofluorescent 얼룩;에 훌륭한 대안이 될 수 있습니다. 또한, 그것은 사용할 수 있습니다 쉽고 안정적으로 식 형태학 정보를 유지 하면서 셀 라인에서 프로 파일링에 대 한 기초 연구에.

대부분 실험실에서 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 하지 일반적으로 사용 됩니다. 오히려, 배양된 세포를 고정, 파라핀 포함 되지 셀 subcellular 지 방화 연구에서 채택 된다. 그 배양된 세포를 고정, 형광 chromogen 대신 사용 되었습니다. 따라서, immunofluorescent 얼룩 현재 셀 문화1을 채용 하는 연구에서 단백질 식 레벨의 결정에 대 한 선택의 방법입니다. 그러나 슬라이드, immunofluorescent 얼룩이 지기에 대 한 준비는, 비행기 현미경2아래 표시 된 아주 다른 이미지를 표시할 수 있습니다 immunofluorescent 현미경 검사 법에만 관찰할 수 있습니다. 또한, immunofluorescent 얼룩에 대 한 슬라이드의 보존 밝은 빛 으로부터 보호를 요구 하 고 형광 신호 약한 이미징 형광 신호3의 손실로 인해 반복 노출 되. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry의 결과 매우 비슷합니다 immunohistochemistry 파라핀 끼워 넣어진 조직4에서 그리고 그들은 쉽게 임상 정보로 번역 될 수 있다. 따라서, immunocytochemistry는 우수한 대안을 수 있습니다. 그러나, 셀 블록 준비 되지 않았습니다 인기 기초 연구 실험실에서. 이 프로토콜에서 다음, 셀 블록 준비 및 immunocytochemical 얼룩 제공 됩니다 셀-문화 연구의 분야에서이 방법의 사용을 촉진.
셀 블록 준비 및 immunocytochemistry는 독특한 방법, 하지 그리고 그들은 이미 기본 연구4,5임상 진단에서 적용 된. 다양 한 셀 블록 준비 방법 되었습니다 보고4,, 비용 효율적인, 간단 하 고 쉽게 적응할 수 있는6 thromboplastin 플라즈마 방법이입니다. 따라서,이 문서, thromboplastin 플라즈마 방법4,,56,7,에 소개 된 프로토콜8 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록의 준비에 사용 됩니다.
현재 연구에서 두 확산 마커를 사용 하는 immunocytochemistry 메서드 및 thromboplastin 플라즈마 셀 블록의 준비에 대 한 자세한 절차 시연 했다. 한 표시는 골격 관련 단백질 2 (CKAP2), 최근에는 mitotic 마커9,,1011;으로 보고 되었습니다. 다른 하나는 가장 유명한 확산 마커12기-67. 대표적인 구조는 그림 1에 표시 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:844px;" width="844">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">HeLa Cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:291px;">HeLa (ATCC&#160;CCL-2)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Ki-67 Antibody</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RM-9106-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Paraffin</td>
			<td style="width:221px;">Leica</td>
			<td style="width:291px;">39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Xylene</td>
			<td style="width:221px;">Fisher SCientific</td>
			<td>1330-20-7,100-41-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Ethenol</td>
			<td style="width:221px;">GD Chem</td>
			<td style="width:291px;">DJ16016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:221px;">Agilent</td>
			<td style="width:291px;">10118581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">DAB Quanto Kit</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">TA-125-QHDX, QHCX 170405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Ultravision LP detection Kit</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">PBQ141209, LPB141209, LPH141210</td>
			<td>Kit for immunocytochemistry; contains protein block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">TintoRetriever Pressure Cooker</td>
			<td style="width:221px;">Bio SB Corporation</td>
			<td>BSB 7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Tris-buffered saline</td>
			<td style="width:221px;">iNtRON Biotechnology</td>
			<td style="width:291px;">IBS-BT008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Tween 20</td>
			<td style="width:221px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:291px;">115106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Thromboplastin</td>
			<td>Neoplastin Cl Plus</td>
			<td>NC0591432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Tris-EDTA retrival Buffer</td>
			<td style="width:221px;">Dignostic Biosystem</td>
			<td style="width:291px;">E625-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal&#160;bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone Laboratories Inc</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone Laboratories Inc</td>
			<td style="width:291px;">SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:261px;">Ultra vision peroxide block H2O2</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">02Q141212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">363313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Pap-Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:291px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Filter Paper</td>
			<td style="width:221px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:291px;">1001-0155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:291px;">21115-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:221px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:291px;">H21-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Formalin</td>
			<td style="width:221px;">Daejung</td>
			<td style="width:291px;">50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">15 ml tube</td>
			<td style="width:221px;">SPL Life Sciences</td>
			<td style="width:291px;">50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">tissue processing cassette</td>
			<td style="width:221px;">Simport</td>
			<td style="width:291px;">M492-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:291px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:221px;">Muto Pure Chemicals</td>
			<td style="width:291px;">140712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:221px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:291px;">2262817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Glass Zar</td>
			<td style="width:221px;">Hyunil Lab-Mate</td>
			<td style="width:291px;">HIP-1027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Class II Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">1300 series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:261px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Tissue Processor</td>
			<td style="width:221px;">Leica BioSystem</td>
			<td style="width:291px;">TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microtome</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">HM340E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Microscope</td>
			<td style="width:221px;">Olympus</td>
			<td style="width:291px;">CX-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Paraffin embedding station</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:291px;">EC 350-1, EC 350-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Tissue Section Bath (Round)</td>
			<td style="width:221px;">CellPath</td>
			<td style="width:291px;">HCP-JAW-0100-00AEU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:261px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:221px;">Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.</td>
			<td style="width:291px;">FH-150</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of protein expression level in cultured cells by immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks

Immunofluorescent 얼룩 때 현재 단백질 표정 수준 결정에 대 한 선택의 방법 세포 배양 시스템에 형태학 정보도 필요 하다. Immunocytochemical 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록, 여기 제시에 얼룩의 프로토콜 파라핀 포함 된 고정된 셀에 immunofluorescent 얼룩에 우수한 대안 이다. 이 프로토콜에서 HeLa 세포에서 파라핀 셀 블록 thromboplastin 플라즈마 메서드를 사용 하 여 준비 하 고 immunocytochemistry 두 확산 마커, CKAP2 및 기-67의 평가 위해 수행 되었다. 핵 및 HeLa 세포의 세포질 형태학 셀 블록 슬라이드에서 잘 보존 했다. 같은 시간에는 immunocytochemistry에서 CKAP2와 기-67 얼룩 패턴 immunohistochemical 파라핀 암 조직에 얼룩에 아주 유사 했다. 혈 청 무료 조건 HeLa 세포의 사전 부 화를 포함 하 여 수정된 세포-배양 조건, 효과 아키텍처 정보를 유지 하면서 평가 수 있습니다. 결론적으로, 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry immunofluorescent 얼룩에 우수한 대안 이다.

파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 (그림 3AB)에서 되며 후 오신 스테인드 슬라이드, 세포의 세포질과 핵의 대부분은 그대로, 형태 보존은 현재 프로토콜 (우수 제안 그림 3A)입니다. Immunocytochemical 얼룩에 긍정적인 CKAP2 얼룩이 관찰 되었다 압축된 chromatin, mitotic 스핀 들 및 세포질 (그림 4)에서 이전에 보고 된10. 기-67 얼룩 예상된 (그림 4)로 세포 핵에서 관찰 되었다. 만 셀 CKAP2 압축된 chromatin에서 얼룩 mitotic 세포 했다 ( 그림 4AB화살표 참조). 많은 CKAP2 양성 세포는 완전 한 매체 (그림 4A)에서 부 화 후 준비 된 했다 높은 mitotic HeLa 세포에 표시 했다. 비교에서는, 혈 청에 굶주린 HeLa 세포 (그림 4B)에서 몇 CKAP2-긍정적인 세포 있었습니다. 높은 mitotic는 HeLa 세포의 대부분이 기-67 긍정적인 (그림 4C). 반면, 혈 청에 굶주린 HeLa 세포에서 기 67 양성 율 50% (그림 4D)로 높은 유지. 이러한 결과 매우 그는 이전 보고서11, CKAP2은 보다 안정적인 확산 마커 암 세포에서 보다 기-67의 비교.
제대로 준비 된 셀 블록, 핵, 세포질에서 분리 하 고이 또한, 릴리스할, 불 쌍 한 형태 론 적. 냉장고에 고정된 셀의 하룻밤 보다 더 이상 보육 같은 가난한 결과 발생할 수 있습니다. 또 다른 중요 한 문제는 셀은 우수한 형태에도 불구 하 고 immunocytochemistry에 의해 잘 스테인드 하지. 이 문제는 셀 응고 작을 때 더 자주 발생 합니다. 일반적으로, 착 색 강도 그림 3B;에서 같이 일반 하지만 셀 응고 크면, 불규칙 한 얼룩의 더 적은 기회. 따라서,이 프로토콜에 우리는 큰 셀 응고를 형성 하기 위하여 플라즈마, thromboplastin, 및 염화 칼슘의 볼륨 증가.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig1.jpg"> 그림 1: 셀 블록 준비 계획. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig2.jpg"> 그림 2: 파라핀 셀 블록 준비의 그림. (A) thromboplastin 플라즈마 튜브에서 셀 병. (B) TP 셀 응고 PBS 세척 후. (C) 셀 moistened 필터 종이에 응고. (D) 조직을 포함 한 녹은 왁 스로 역. 금속 몰드 (화살표)에 녹은 왁 스 응고에 대 한 보유 하고있다. (E) 파라핀 포함 셀 응고 (화살표) 파라핀 또는 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 포함 된. (F) 얇은 파라핀 코팅된 슬라이드의 중간 부분에 섹션. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig3.jpg"> 그림 3: 셀 블록 준비 및 확인 되며 오신 및 immunostaining 품질. (A) 되며-및-오신-스테인드 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 섹션에 HeLa 세포의 이미지. (B) 불규칙 착 색 기-67의 저조한에 immunocytochemistry에 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 섹션 준비. 스케일 바는 (A) 100 및 (B) 200 μ m. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig4.jpg"> 그림 4: Immunocytochemical 헬러 셀 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 얼룩. (A) CKAP2 높은 mitotic 조건 하에서 얼룩. (B) CKAP2 혈 청 공 복 상태에서 얼룩. (C) 기-67 높은 mitotic 조건 하에서 얼룩. (D) 기-67 혈 청 공 복 상태에서 얼룩. 100 μ m 스케일 바 표시 됩니다. 화살촉 표시 CKAP2-긍정적인 세포. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>절차</td>
			<td>단계</td>
			<td>솔루션</td>
			<td>시간/온도</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">탈수</td>
			<td>1</td>
			<td>70% 알코올</td>
			<td>15 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>80% 알코올</td>
			<td>15 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>95% 알콜</td>
			<td>15 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>100% 알코올</td>
			<td>15 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">지우기</td>
			<td>1</td>
			<td>크 실 렌</td>
			<td>60 분/4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>크 실 렌</td>
			<td>10 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>크 실 렌</td>
			<td>10 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>크 실 렌</td>
			<td>10 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>* RT, 실내 온도</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 조직 처리 절차입니다.

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Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 의해 경작된 한 세포에 단백질 표정 수준 결정

현재, 고정된 셀에 immunofluorescent 얼룩 때 단백질 식 레벨의 결정에 대 한 선택의 방법 형태학 정보도 필요 하다. 여기에 소개이 프로토콜 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry의 다른 방법을 제공 합니다.

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

determination-protein-expression-level-cultured-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.4K 조회수.  National Cancer Center. 현재, 고정된 셀에 immunofluorescent 얼룩 때 단백질 식 레벨의 결정에 대 한 선택의 방법 형태학 정보도 필요 하다. 여기에 소개이 프로토콜 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry의 다른 방법을 제공 합니다.

비디오: Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their relative distribution and their localization in the tissue. This technique has been extensively applied to study the immune infiltrate in various tumor types. The tumor microenvironment is infiltrated by immune cells that are attracted to the tumor site. Different immune cell populations have been found to play different roles in the tumor microenvironment and to have a different impact on the outcome of disease. This manuscript describes the use of multiparameter fluorescence IHC on oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC) as an example. This technique can be extended to other tissue samples and cell types of interest. In the presented study, we analyzed the intraepithelial and stromal compartment of a large OPSCC cohort (n = 162). We focused on total T lymphocytes (CD3+), immunosuppressive regulatory T cells (Tregs; i.e., FoxP3+), and T helper 17 (Th17) cells (i.e., IL-17+CD3+) using a nuclear counterstain to distinguish tumor epithelium from stroma. A high number of T cells was found to be correlated with improved disease-free survival in patients with a low number of intratumoral IL-17+ non-T cells. This suggests that IL-17+ non-T cells may be correlated with a poor immune response in OPSCC, which is in agreement with the correlation described between IL-17 and poor survival in cancer patients. Currently, novel multiparameter fluorescence IHC techniques are being developed using up to 7 different fluorochromes and will enable the more precise characterization and localization of immune cells in the tumor microenvironment.

Multiparameter fluorescence immunohistochemistry can be used to assess the number, relative distribution, and localization of immune cell populations in the tumor microenvironment. This manuscript describes the use of this technique to analyze T-cell subpopulations in oropharyngeal cancer.

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum deprivation; chemicals which arrest cells at different cell cycle phases; or the use of mitotic shake-off which exploits their reduced adherence. However, all of these have disadvantages. For example, serum starvation works well for normal cells but less well for tumor cells with compromised cell cycle checkpoints due to oncogene activation or tumor suppressor loss. Similarly, chemically-treated cell populations can harbor drug-induced damage and show stress-related alterations. A technique which circumvents these problems is counterflow centrifugal elutriation (CCE), where cells are subjected to two opposing forces, centrifugal force and fluid velocity, which results in the separation of cells on the basis of size and density. Since cells advancing through the cycle typically enlarge, CCE can be used to separate cells into different cell cycle phases. Here we apply this technique to primary acute lymphoblastic leukemia cells. Under optimal conditions, an essentially pure population of cells in G1 phase and a highly enriched population of cells in G2/M phases can be obtained in excellent yield. These cell populations are ideally suited for studying cell cycle-dependent mechanisms of action of anticancer drugs and for other applications. We also show how modifications to the standard procedure can result in suboptimal performance and discuss the limitations of the technique. The detailed methodology presented should facilitate application and exploration of the technique to other types of cells.

This protocol describes the use of centrifugal elutriation to separate primary acute lymphoblastic leukemia cells into different cell cycle phases.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

22C 3를 사용 하 여 반대로 PD L1 항 체 생 검 및 비 작은 세포 폐 암 환자에서 세포학 샘플에 집중

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining but can be visualized through elastic staining. One of the important benefits of elastic staining is that it makes it easy to determine whether tumor cells have invaded beyond the elastic lamina. This helps in examining the extent of peritoneal surface invasion, thereby distinguishing the pT3 and pT4 stages in gastrointestinal cancer. In this study, we present a protocol to identify elastic fibers in the formalin-fixed, paraffin-embedded pT3N0M0 gastric cancer tissue sections. We prepare 5-&#181;m paraffin sections fixed on slides, and then all the slides are deparaffinated and rehydrated during the staining procedure. Subsequently, all the sections are oxidized by potassium permanganate, bleached by oxalic acid, stained by elastic staining, and counterstained by Van Gieson's. Finally, we examine the effect of staining; elastic lamina is stained blue-black and collagen fibers are stained red, while the cancer cells are stained in varying shades of yellow. We also describe in detail the methods used for determining the positional relationship between cancer cells and elastic lamina. This method is simple, low-cost, and widely applicable in the identification of peritoneal surface invasion in gastrointestinal cancer because of its outstanding selectivity for elastic fibers and authentic results.

Here, we present a protocol of elastic staining to identify elastic fibers in pT3N0M0 gastric cancer tissues on formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Subsequently, we describe a method to determine whether tumor cells invade beyond the elastic lamina.

pT3N0M0 위암 조직의 파라핀 내장 슬라이드에 탄성 염색

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as biomarkers with applications in diagnosis, prognosis, classification, state of tumor progression, and cell differentiation state. These analyses of biomarkers are also useful to characterize tumor neurospheres (NS) generated from glioma patients and glioma models. Tumor NS provide a valuable in vitro model to assess different features of the tumor from which they are derived and can more accurately mirror glioma biology. Here we describe a detailed method to analyze biomarkers in tumor NS using immunohistochemistry (IHC) on paraffin-embedded tumor NS.

Neurospheres grown as 3D cultures constitute a powerful tool to study glioma biology. Here we present a protocol to perform immunohistochemistry while maintaining the 3D structure of glioma neurospheres through paraffin embedding. This method enables the characterization of glioma neurosphere properties such as stemness and neural differentiation.

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein and RNA multiplexing by leveraging photo-cleavable oligo-tagged antibodies and probes, respectively. Oligos are cleaved and quantified from specific regions across the tissue to elucidate the underlying biology. Here, the study demonstrates that automated custom antibody visualization protocols can be utilized to guide ROI selection in conjunction with spatial proteomics assays. This specific method did not show acceptable performance with spatial transcriptomics assays. The protocol describes the development of a 3-plex immunofluorescent (IF) assay for marker visualization on an automated platform, using tyramide signal amplification (TSA) to amplify the fluorescent signal from a given protein target and increase the antibody pool to choose from. The visualization protocol was automated using a thoroughly validated 3-plex assay to ensure quality and reproducibility. In addition, the exchange of DAPI for SYTO dyes was evaluated to allow imaging of TSA-based IF assays on the spatial profiling platform. Additionally, we tested the ability of selecting small ROIs using the spatial transcriptomics assay to allow the investigation of highly-specific areas of interest (e.g., areas enriched for a given cell type). ROIs of 50 &#181;m and 300 &#181;m diameter were collected, which corresponds to approximately 15 cells and 100 cells, respectively. Samples were made into libraries and sequenced to investigate the capability to detect signals from small ROIs and profile-specific regions of the tissue. We determined that spatial proteomics technologies highly benefit from automated, standardized protocols to guide ROI selection. While this automated visualization protocol was not compatible with spatial transcriptomics assays, we were able to test and confirm that specific cell populations can successfully be detected even in small ROIs with the standard manual visualization protocol.

Here, we describe a protocol for fine-tuning regions of interest (ROIs) for Spatial Omics technologies to better characterize the tumor microenvironment and identify specific cell populations. For proteomics assays, automated customized protocols can guide ROI selection, while transcriptomics assays can be fine-tuned utilizing ROIs as small as 50 &#181;m.

조직에서 단백질 및 RNA 발현의 공간 프로파일링: 가상 미세 해부를 미세 조정하는 접근 방식

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using three-dimensional (3D) cell-based invasion and migration assays. In this study, we have optimized these 3D assays for live-cell immunocytochemistry. An Antibody Labeling Reagent was used to detect in real-time the expression of the adhesion molecule CD44, on the plasma membrane of migrating and invading cells of a DMG H3K27M primary patient-derived cell line. CD44 is associated with cancer stem cell phenotype and tumor cell migration and invasion and is involved in the direct interactions with the central nervous system (CNS) extracellular matrix. Neurospheres (NS) from the DMG H3K27M cell line were embedded into the basal membrane matrix (BMM) or placed onto a thin coating layer of BMM, in the presence of an anti-CD44 antibody in conjunction with the antibody labeling reagent (ALR). The live-3D-cell immunocytochemistry image analysis was performed on a live-cell analysis instrument to quantitatively measure the overall CD44 expression, specifically on the migrating and invading cells. The method also allows visualizing in real-time the intermittent expression of CD44 on the plasma membrane of migrating and invading cells. Moreover, the assay also provided new insights into the potential role of CD44 in the mesenchymal to amoeboid transition in DMG H3K27M cells.

This study presents a protocol of live-3D-cell immunocytochemistry applied to a pediatric diffuse midline glioma cell line, useful to study in real-time the expression of proteins on the plasma membrane during dynamic processes like 3D cell invasion and migration.

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...