이 작품은 NIH CA109821 (TCC)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 베크 Coulter 아낌없이 간행물 비용을 충당 하기 위해 자금을 제공 하 고 설정 및 elutriation 시스템의 운영 기술 지원. 우리는 제공 하는 초기 기본 모든 문화에 대 한 박사 프레드 Falkenburg 감사 합니다.

참고:이 프로토콜 기본 B-모든 세포 직경 약 8 µ m (G1 단계)에서 13 µ m (G2/M 단계)에서 범위에 대 한 최적화 되었습니다. 따라서, 특정 원심 분리기 속도 펌프 유량 수 없습니다 다른 크기 범위에 있는 셀에 적용. 그럼에도 불구 하 고, 적절 한 elutriation 매개 변수 침전 비율 방정식을 사용 하 여 추정 될 수 있습니다. 셀 설명된 16 10 6 셀/mL x 1-3의 최적의 밀도 정의 된 혈 청 자유로운 매체에 교양. 분수의 얼음 냉각 튜브를 사용 하 여 4 ° C에서 실시 하는 컬렉션, 제외한 모든 단계 실내 온도 및 24의 최대 20 ° C에서 원심 분리기에서 실시 하는 ° C.
 1. Elutriation 버퍼의 준비 및 자료 <ol><li>세포의 응집을 감소, 행 크의 elutriation 버퍼를 준비 하기 위해 &#39; s 균형 소금물 (HBSS) 페 놀 레드 2% 소 태아 혈 청 (보충 FBS), elutriation 프로세스, 부정 청구 셀 외관을 렌더링 하 고 응집 감소 2-naphthol-6,8-disulfonic 산 dipotassium 소금 (NDA)의 1.6 g/L 중 기계적 스트레스 로부터 세포를 보호 하.
	<ol><li>NDA의 1.6 g을 50 mL 원뿔 튜브 추가할.</li>
		<li>살 균 조건 추가 HBSS의 35 mL 1 L 병에서 NDA를 포함 50 mL 원뿔 튜브. 튜브는 NDA 해산 했다 때까지 소용돌이.</li>
		<li>새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 녹아 NDA를 전송 0.2 µ m 필터를 사용 하 여. HBSS 나머지 1 리터에 기밀 엄수 계약서 추가.</li>
		<li>마지막으로 2% (v/v)의 최종 농도를 HBSS 21 mL FBS 추가. 
		참고: elutriation 버퍼 수 준비 되며 만료 날짜는 HBSS 또는 지시자 염료의 황으로 pH에 큰 변화가 있을 때까지 때까지 4 ° C에 저장.</li>
	</ol></li> <li>표시 튜브 1과 2 (W1, W2) 분수 1-20 (F1 ~ F20), 세척 하 고 중지 되도록 50 mL 원뿔 튜브 분수의 컬렉션에 대 한 라벨.
	<ol><li>분수를 수집 하기 전에 미리 얼음이이 튜브를 진정.</li>
	</ol></li></ol> 2. Elutriation 시스템의 조립 <ol><li>첫째, 스트로보 어셈블리는 원심 분리기에 있도록 설치 전원 코드 왼쪽에 있는 포트를 통해 상공에서 먹이. 원심 분리기를 닫을 때 그것은 보기 창 줄 것입니다 그래서 스트로브 플래시 램프는 챔버의 앞에 인지 확인 합니다.
	<ol><li>먼저 각 브라켓의 상단에 두 개의 구멍에 두 개의 십자 머리 나사를 강화 하 고 다음으로 각 브래킷의 하단에 나사를 강화 하 여 장소에 어셈블리 보안.</li>
		<li>스트로브 전원 포트는 원심 분리기의 뒷면에 전원 코드를 꽂습니다.</li>
	</ol></li> <li>다음, 원심 분리기 드라이브 허브에 곧장 회전자를 설정 하 고 T-핸들 육각 렌치로 고정. 
	참고: 경우에 원심 분리기 비 elutriation 목적을 위해 필요 하지 않습니다, 스트로보 어셈블리와 회전자 지켜질 수 있다 실행 사이의 원심 분리기에.</li>
	<li>회전자 확보 되 면 인감 어셈블리와 장착 플레이트를 회전로 터에 elutriation 챔버, 카운터 밸런스, 포함 된 빠른 릴리스 어셈블리를 놓습니다.
	<ol><li>밀어 균등 하 게 한 손으로 elutriation 챔버와 카운터 밸런스에 다른 한편에는 터 볼트 장착 플레이트에 구멍에 스냅 될 때까지.</li>
		<li>는 마지막으로, 회전 씰 어셈블리에 있는 구멍에 케이블의 1 개의 측에 핀을 배치 하 고 왼쪽 o에 브라켓 십자 머리 나사 (2.1.1에 언급 된) 중 하나 케이블의 다른 쪽에 eyehole를 확보 하 여 고정 케이블을 연결 f 챔버.</li>
	</ol></li> <li>다음, 가변 속도 펌프를 사용 하 여 흐름 시스템을 조립 하 고는 elutriation에 펌프 버퍼 튜브 챔버 elutriation 챔버의 흐름으로 버퍼를 수집.
	<ol><li>삽입 크기 16 입력된 튜브 상단에 포트를 통해 변속 펌프에서 오는 왼쪽 원심 분리기 약 실 챔버에 들어가 있도록.</li>
		<li>입력된 튜브의 무료 끝에 피팅을 부착 하 고 회전 씰 어셈블리 측면 입력된 구멍에 피팅을 삽입.</li>
		<li>삽입 크기 16 출력 포트를 통해 튜브와 회전의 상단에 전송 관에 봉인 어셈블리. 
		참고: 흐름 시스템 또한 남아 있을 수 있습니다 elutriation 실행 사이의 조립.</li>
	</ol></li> <li>마지막으로,는 원심 분리기를 설정 하 고 실험에 필요한 사양 설정.
	<ol><li>변경 회전자 id입니다.</li>
		<li>는 원심 분리기 시간 입력 하는 경우, 설정 된 elutriation 실행을 완료 하는 데 충분 한 더 보다는 2 h.</li>
		<li>설정 온도 20 ° c 24의 최대 온도 ° c.</li>
		<li>맥스 가속과 감속을 위해 느리게 설정.</li>
		<li>마지막으로, 867 x g.를 속도 설정</li>
	</ol></li></ol> 3. Elutriation 시스템의 못쓰게 <ol><li>elutriation 시스템 소독, 5% 표 백제를 포함 하는 500 mL 플라스틱 병에 저수지 튜브를 놓고 출력 튜브는 빈 1 L 플라스틱 폐기물 병에 배치 하려면 먼저.
	<ol><li>펌프를 켜고 25 mL/min로 속도 설정 하 고 5% 표 백제 폐기물 병으로 출력 튜브 펌핑은 때까지 줄곧 elutriation 시스템을 통해 흐름을 허용.</li>
		<li>는 원심 분리기를 켜고 거품 및 배 압 순서 속도 (867 x g)를 지정 하는 최대와 서 허용.</li>
		<li>는 원심 분리기를 중지합니다. 로 터 회전 중지, 일단 뚜껑 열고 어떤 누출에 대 한 챔버 검사.</li>
		<li>아무 누출 경우 게 표 백제 솔루션 최소한 5 분에 대 한 시스템을 통해 흐름</li>
	</ol></li> <li>로 표 백제는 수는 세포의 응집으로 이어질 뿐 아니라 세포에 해를 입힐 elutriation 버퍼에서 침전의 형성으로 이어질 수 있습니다 다음, 압력가 마로 소독 물 시스템을 플러시.
	<ol><li>장소 압력가 마로 소독의 1 리터 병으로 저수지 튜브 물 하 고를 통해 적어도 10 분에 대 한</li>
	</ol></li> <li>물으로 홍 조, 후 elutriation 버퍼 시스템에 도입. Elutriation 버퍼 및 셀에 대 한 저수지를 만들 압력가 되었습니다 150 mL 유리병을 사용 합니다.
	<ol><li>Elutriation 버퍼의 100 mL 병에 추가 하 고 튜브 맨 아래에 되도록 유리 병 저수지 튜브 이동.</li>
		<li>는 원심 분리기를 시작 하 고 물 밖으로 플러시 시스템을 통해 흐름에 버퍼가.</li>
		<li>저수지 병 거의 비어 일단 물 시스템에서 완전히 붉 어 지는 출력 튜브 폐기물 병에서 저수지에는 버퍼 시스템을 통해 재활용 되 고 있도록 이동.</li>
	</ol></li> <li>마지막으로 조정 보기 창을 elutriation 챔버 현재 속도로 볼 수 있습니다.
	<ol><li>보도 스트로보 램프 램프 켜 하는 원심 분리기의 외부에 버튼 전원. Elutriation k를 설정노브를 왼쪽 원심 분리기의 외부에도.</li>
		<li>천천히 보기 창을 통해 보고 차례 elutriation 챔버 보기 및 스트로브 빛에 올 때까지 오른쪽 노브는로 터의 회전 시간. 
		참고: elutriation 시스템 남아 있을 수 있습니다이 상태에서 셀 준비 될 때까지.</li>
	</ol></li></ol> 4. 셀 샘플의 준비 <ol><li>수 전지와 여러 50 mL 원뿔 튜브에 aliquot 300 400 백만 성장 매체. 3 분 위한 1210 x g에서 셀 아래로 회전</li>
	<li>25 ml를 위아래로 부드럽게 pipetting으로 elutriation 버퍼의 성장 매체 및 resuspend 세포 aspirate.</li>
	<li>줄이기 위해 세포 응집, 패스는 25 통해 두 번 셀 게이지 바늘.
	<ol><li>10 mL 주사기를 사용 하 여 셀을 그릴 25 게이지 바늘을 연결 하 고 내부에는 셀을 통과 살 균 50 mL 원뿔 튜브의 벽. 이 모든 25 mL 바늘 통과 될 때까지 반복.</li>
		<li>새 바늘과 주사기를 한 번 위의 과정을 반복. 
		주의: 주사기 바늘은 sharps 용기에 배치 되어야 합니다. 
		참고:이 중요 그 셀 올려집니다 바늘을 통해 elutriation 시스템에 그들을 소개 하기 전에 즉시 세포 응집을 최소한 유지.</li>
	</ol></li></ol> 5. Elutriation 시스템 및 분수의 컬렉션에 셀 샘플의 소개 <ol><li>소개 통해 재활용 나머지 elutriation 버퍼는 저수지 탱크에 셀 샘플을 붓는 의해 elutriation 시스템으로 셀 샘플 .
	<ol><li>셀 시스템에 입력 하 고 elutriation 챔버 내에서 평형에 도달 하자. 
		참고:이 과정은 약 5 분 소요 됩니다 그리고 그들이 보기 창을 통해 챔버를 입력으로 셀을 보면서 진행을 추적할 수 있습니다. 모든 셀에에서 있도록 챔버, 걸릴 드롭 eluent의 유리 슬라이드에 놓고 현미경으로 볼. 이 챔버에 그들의 보존을 확인 하는 샘플 그대로 셀의 무료 이면.</li>
	</ol></li> <li>일단 모든 셀 챔버에 입력 한 있는 셀 균형 있는 챔버의 가장 넓은 부분에 뚜렷한 경계가 분수를 수집 하기 시작.
	<ol>출력 관 50 mL 원뿔 관으로 이동 하 여 <li>시작 레이블이 W1. 이 분수, 저수지 탱크에 고 elutriation 버퍼 필요한 경우 보충를 위한 elutriation 버퍼의 50 mL 수집. 
		참고: 모든 셀 시스템에 입력 했습니다 있는지 확인 하기 위해 저수지 탱크를 처음으로 저수지를 채우는 전에 거의 빈 될 수 있습니다. 첫 번째 리필 후 그것 거의 비어 될 저수지에 대 한 기다릴 필요가 되지 않습니다. 또한, 하지 마십시오 있도록 허용 될 빈이 시스템에 거품과 백 프레셔를 만들 것입니다 탱크.</li>
		<li>일단 50 mL가 w 1에 대 한 수집, 동시에 821 x g 속도 변경 표시 W2 원뿔 튜브에 출력 관 고 이동 50 mL이이 속도에서 더 많은 수집.</li>
		<li>계속 속도 변경 하 고 표 1에 표시 된 대로 분수를 수집 합니다. 저수지에서 미디어 탱크와 모든 시간에 얼음에 원뿔 관을 유지 있는지 확인 합니다. 마지막으로, 천천히 속도 감소로 오른쪽 노브를 설정 하 여 보기 창 조정.</li>
		<li>일단 모든 20 분수 수집 되어, 있는 원심 분리기를 중지 및 정지를 표시 하는 원뿔 튜브에 50 mL 수집.</li>
	</ol></li></ol> 6. Elutriation 시스템의 플러싱 <ol><li>는 원심 분리기 멈춘 후 완전히 플러시 시스템 저수지 튜브 압력가 물과 폐기물 병에서 다시 출력 관의 1 리터 병에 넣어.
	<ol><li>50 mL/min까지 펌프 속도 설정 하 고 있도록 그것 고갈 될 때까지 시스템을 통해 실행 물.</li>
	</ol></li> <li>설정 펌프, 빠른 릴리스 어셈블리에서 입력 및 출력 호스를 제거 하 고 고정 케이블에서 핀을 꺼내.
	<li>제거로 터에서 빠른 릴리스 어셈블리 <ol>. 
		참고: 무엇는 원심 분리기 사용 됩니다, 따라서 elutriation 시스템 수 지금 남아 있을 이다. 그렇지 않으면, 전체 어셈블리 수 내려올 반대 순서에 따라 위에서 설명한 대로. Elutriation 챔버 빠른 릴리스 어셈블리에서 제거 하 고 초음파 물 목욕을 사용 하 여 실행 사이의 청소 수 있습니다. 이 이후 실행에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 챔버 벽에서 파편과 오염 물질을 제거.</li>
	</ol></li></ol> 7. 분수와 G1 또는 G2/M 풀의 컬렉션의 분석.
 참고: elutriation의 효과 설명 하기 위하여 각 분수 세포 수, 세포 직경, 및 DNA 콘텐츠 분석 및 풀 셀에 만들어집니다 immunoblot 분석에 대 한 G1 또는 G2/M 단계에 설명 된 대로 대표 결과입니다. 이 프로토콜 섹션 이러한 풀을 만들 및 실험적인 사용을 위해 그들을 준비 하는 방법을 설명 합니다.
<ol><li>2000 x g 4 ° C와 elutriation 버퍼에서 aspirate에서 5 분 동안에 각 분수를 스핀.</li>
	<li>G 1 단계 풀와 G2/M 단계 풀을 얻기 위하여 함께 결합 분수.
	<ol><li>G 1에 대 한 수영장 단계, 총 1 mL의 인산 염 버퍼 염 (PBS) 및 15 mL 원뿔 튜브에 661 x g (f 1-f 5) 788 x g의 속도 범위에서 수집 된 분수를 resuspend. G2/M 단계 풀 resuspend g x 333 x g (F17-F20) 387의 속도 범위에서 수집 된 분수.</li>
		<li>2000 x g 4 ° C와 PBS에서 aspirate에서 5 분에 셀 아래로 회전.</li>
	</ol></li> <li>셀 성장 매체의 10 mL에 resuspend 하 고 세포 수.</li>
	<li>Propidium 요오드 화물 얼룩 통해 콘텐츠 dna 분석 각 풀에서 한 약 수를 받아 고 cytometric 분석 15. 
	참고: 각 풀의 나머지는 추가 실험을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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Anisha Kothari 전지와 세인트 주드 어린이 연구 병원 분자 생물학의 부에 현재 있다.

우리 CCE를 사용 하 여 세포 주기의 다른 단계에 기본을 얻기위한 방법 모든 셀을 설명 했습니다. 최적의 조건에서 셀 g 1 단계에의 근본적으로 순수한 인구와 G2/M 단계에 있는 세포의 매우 풍부한 인구 쉽게 얻어질 수 우수한 수율, 그리고 셀 S 단계에서 매우 풍성 하 게 얻어질 수 있다 또한 원하는 경우. 여기에 제시 된 결과 독립적인 문화, 모든-215주 모든 문화 (특히, 모든-5), 그리고 본질적으로 동일한 결과 얻은 사용 하 여 얻은 했다. 또한, 다른 모든 기본 날짜를 검사 하는 모든 문화 비슷한 밀도 범위 동안 비동기 성장, 그리고 가능성이 CCE를 때 유사 하 게 수행 합니다. 우리의 이전 연구 또한 나타났습니다 HL60, K562, 등 다른 백혈병 세포 라인 CCE19,20를 사용 하 여 다른 세포 주기 단계로 분리 될 수 있다. 절차의 중요 한 단계를 확인 셀 모노 분산 및 하지 이멀전의 실행;의 시작에 포함 특히과로 터의 속도;의 조건의 최적화 깨끗 하 고 파편;의 자유는 보장 시스템의 구성 요소 그리고 흐름 라인에 공기 방울의 도입을 피하고. CCE 그들은 세포 주기를 통해 미리 셀 크기에 크게 증가 하는 셀에 가장 적합 합니다. 에 셀의 주어진된 인구에 대 한이 설정할 수 있습니다 쉽고 처음 DNA 콘텐츠 및 사이드 분산형, 셀 크기에 후자의 의존 관계를 검사 하 여. 두 매개 변수를 측정할 수 있습니다 동시에 cytometry에 의해 propidium 요오드 화물 얼룩, 후15를 설명한 우리. 측면-분산형 및 DNA 콘텐츠 간의 선형 관계 셀 크기 세포 주기 사전 증가 하 고 따라서 세포 주기 단계에 따라 CCE는 세포를 분리 하는 자신감을 제공 합니다.
같이 우리는 (그림 5), 손상 된 샘플 품질, 특히 셀 G2/M 단계에 대 한 최적화 절차에서 편차 발생. 그러나, 분수 또는 분수 볼륨의 수에 있는 감소 분명 미치지 않았다 셀의 순도에 g 1 단계 (그림 5). 따라서, 순화 g 1 단계 셀 필요 하는 경우에 프로시저에 바로 가기 용납 수 있습니다. CCE는 쉽게 의무가 정지 세포 배양, 그것 또한 subcellular 분수에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 murine 사전-B 세포에서 핵 되었습니다 성공적으로 크기-CCE8를 사용 하 여 분리. 부착 세포 유형 관과 elutriation 챔버의 표면에 응집 하 고 가능한 준수에 대 한 그들의 성향 때문에 잠재적인 문제를 제기 하 고 따라서 신중 하 게 조사 해야 합니다.
CCE의 주요 한계는 장비;의 비용 필요한 기구는 연구소와 협력 하 여 가능한 솔루션이입니다. 그러나 회전자는 전용된 악기는, 일반적인 원심 분리 목적는 원심 분리기를 사용할 수 있습니다, 그리고 CCE에 전적으로 투자 비용 감소. 또 다른 한계가 이다 실험의 일정 문제 혈 청 기아 또는 화학 동기화 같은 다른 방법의 유연성에 비해. Elutriation 실행 일반적으로 5-6 시간, 고 얻은 셀 이후에 단기 또는 다중 시간 실험에 필요한,이 불편을 일정 발생할 수 있습니다. 가장 큰 장점은이 방법에 의해 얻은 세포 교란은15를 같이 우리 조 난의 어떤 표시 없이 많은 일에 대 한 교양 수입니다. 이 약물 유발 손상 항구 수는 화학 방법으로 동기화 하는 세포와 대조 됩니다. 최근 연구 결과, 폭발 NB4 세포 급성 골수성 백혈병에서 파생 된을 사용 하 여, 직접 CCE와 혈 청 기아, hydroxyurea, 또는 치료  종속 키 1 억제제로-330621체포를 포함 한 다른 방법에 비해. Elutriated 세포와 세포 DNA 콘텐츠 및  식 비슷한 등장 하는 비교 단계에서 체포. 그러나,는 프로테옴 시험 되었다 때 주요 단백질 풍부, 특히 스트레스 관련 변경 하 고 체포 관련 단백질, 체포 셀에 해당 셀 크기 위치에서 elutriated 셀 안에 관찰 되었다. 이 결과 교란된 세포의 생산을 위한 CCE의 유틸리티를 강조 표시 하 고 강조 하는 다른 방법으로 동기화 셀에서 데이터를 해석 하는 때 주의 사용 해야 합니다.

배양된 세포는 일반적으로 비동기적으로 성장 하 고 개별 세포는 세포 주기의 다른 단계에 존재. 일부 생물 자연스럽 게 동기 세포 주기 전시 또는 특정 생리 적인 자극에 의해 동기화 할 수 있습니다. 예를 들면 점액 형 Physarum polycephalum 의 거 대 한 plasmodia 내 핵 매우 동기 패션1와 Desmodesmus quadricauda 는 빛과 어둠을 번갈아 하 여 동기화 할 수 있습니다 녹색 조류의 세포 분 기간2. 이러한 생물 독특한 실험 특성을 제공, 그들은 부적당 하 게 포유류 세포의 복잡 한 모델. 포유류 세포 인구를 인위적으로 동기화 하는 기능 세포 주기 규칙의 우리의 이해 및 세포 주기 검문소의 분자 기준 발전 중심 되었습니다. 일반적인 방법에는 혈 청 부족, 화학 블록 및 릴리스 또는 물리적 특성3,4악용 포함 됩니다. 혈 청의 철수 자주 세포 정지, 입력 하 고 g 1 단계5에 세포 주기 재입국을 촉진 하는 혈 청의 다시 추가 합니다. 화학 억제제 초과 티 미 딘 또는 G1/S 경계에서 세포를 차단 hydroxyurea microtubule 억제제는 일반적으로 M 단계3,4에 셀을 체포 대리인을 포함 합니다. Mitotic 쉐이크-오프 이후 그들은 덜 interphase 셀6보다 부착에 mitotic 세포에 대 한 풍부 하 게 사용할 수 있는 물리적 특성을 악용 하는 방법이 포함 합니다. 그러나, 이러한 모든 기술 잠재적인 단점이 있다. 예를 들어 모든 셀 형식 mitotic 억제제와 사전 동기화 없이 제한 mitotic 쉐이크-오프 후 혈 청 또는 화학 억제제의 존재의 부재와 셀의 수익률에서 생존을 유지 합니다.
어디 셀 점차적으로 감소 크기에 그들은7분할 초기 배아 세포 주기를 제외 하 고 대부분의 세포 주기를 통해 발전 성장 단계를 받아야 더 큰 되 고. 이 속성은 특히 원심 elutriation (CCE) 크기에 서로 다른 세포를 분리 하는 데 사용할 수 있으며 따라서 세포 주기에서8,9단계 기법에 악용 됩니다. CCE, 동안 세포는 2 개의 반대 세력의 영향 아래: 회전의 축에서 셀 드라이브, 원심력과 유체 속도 (특히), 회전 (그림 1)의 축으로 셀 드라이브. Elutriation 챔버에 셀이이 힘 같은지는 평형 위치에 도달 합니다. 평형 위치를 지시 하는 핵심 요소는 셀 직경 및 밀도 있습니다. 버퍼 솔루션의 속도 증가 흐름으로 원심력을 능가 하는 특히 끌기 힘, 새로운 균형을 설립, 챔버 내부 셀의 위치에 변화를 일으키는. 모든 세포는 특히 속도 충분히 증가 하 여 그들의 출구를 홍보를 때까지 더 큰 셀 챔버 내에 유지 하는 반면 먼저 챔버를 떠나 작은 것 들의 결과로 챔버 출구 쪽으로 이동 했다. 특히 속도 연속 증가와 elutriation 챔버 탈출 셀 특정 분수에 수집 될 수 있습니다 고 각 분수 순차적으로 증가 하는 크기의 셀을 포함 합니다. 특히 속도 증분 증가와 elutriation 실시, 대신 원심 분리 속도 감소 하 여 원심력에 순차 감소 동일한 결과 달성할 것 이다. Elutriation 과정 세포 유형과 elutriation 버퍼, 사용 하는 특정 장치에 따라 최적화를 있어야 합니다. 이러한 조건에서 셀의 침전 속도 최고의 Stokes 법칙에 의해 설명: SV = [d2(ρp-ρm) / 18η].ω2r, 어디 SV = 침전 속도; d =; 입자의 직경 Ρp =; 입자의 밀도 Ρm = 버퍼;의 밀도 Η =; 버퍼의 점성 Ω; 회전자의 각 속도 = 그리고 r = 입자의 방사형 위치. 따라서, SV는 셀 직경 및 밀도에 비례 하 고 직경 두 번째 전력 발생, 이후 그것은 일반적으로 세포 주기를 통해 상수는 밀도 보다 더 크게 기여.
CCE의 중요 한 장점은 셀 화학 치료 또는 영양 부족의 가혹한 조건에 적용 되지 않습니다 우수한 수익률 본질적으로 교란된에 복구할 수 있습니다. 요구는 문제의 세포 직경, 적어도 30%의 상당한 증가 받게 세포 주기 통과. 주요 단점은 특수 원심 분리기, 회전자, 및 액세서리의 비용입니다. 그럼에도 불구 하 고, 셀 CCE에 의해 특정 세포 주기 단계에서 풍성 하 게 준비 하는 능력은 크게 포유류 세포9,10에서 효 모 유기 체에서 세포 주기 연구를 촉진 했다. 또한, 최근 발전 암 조직, 이질적인 혼합물에서 특정 종류의 세포 immunotherapy9에 대 한 생산을 다른 세포 유형의 분리 대 건강 한에서 세포의 분리에 사용을 확산 되고있다.
우리의 주요 관심 vinca 알 카 로이드, taxanes 등 에이전트 (Mta)를 대상으로 하는 microtubule의 행동의 메커니즘을 이해 하고있다. 이 약은 유사 분열, 스핀 들 microtubule 함수11,12, 차단에 독점적으로 행동 생각 했다 하지만 최근 증거 그들은 또한 interphase microtubules13,14을 대상 수 있습니다 나왔다. 우리는 최근 주 급성 림프 구성 백혈병 (ALL) 셀 받 다 죽음에 g 1 단계 또는 m에서 vincristine, 세포 주기 의존적인 방식으로15에서 다른 Mta로 치료 하면 단계를 했다. CCE에 의해 다른 세포 주기 단계에 모든 세포를 분리 하는 기능은이 결론에 도달에서 쓸모 있었다. 이 문서에서는, 우리는 기술적인 세부 사항을 설명 하 고 다른 세포 주기 단계에서 모든 셀 기본 준비에 CCE의 응용 프로그램에 대 한 실용적인 팁을 제공.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1542">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">10-508Q</td>
			<td style="width:780px;">1 L bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">Fetal Plus bovine serum</td>
			<td style="width:108px;">Atlas Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">FP-0500-A</td>
			<td>500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt</td>
			<td style="width:108px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">212-672-4</td>
			<td>100 g powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">50 mL concial tubes</td>
			<td style="width:108px;">Denville Scientifics</td>
			<td style="width:119px;">C1062-P</td>
			<td>500/case</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">PES Membrane 0.22 &#181;m filter unit</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGP033RB</td>
			<td>250/pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">B14544</td>
			<td>centrifuge compatible with elutriation system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">JE 5.0 elutriator rotor kit</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">356900</td>
			<td>rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chamber, standard, 4-mL, &#34;A&#34;</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">356943</td>
			<td>standard elutriation chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Masterflex L/S Easy-Load pump head</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07518-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Masterflex L/S Variable-Speed Drive</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07528-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">25 G x 1.5 Precision Glide needle</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305127</td>
			<td>sterile, single-use needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">10 mL Luer-Lok syringe</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td>sterile, single-use syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">Vi-Cell XR</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">383556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">PI/RNase staining buffer</td>
			<td style="width:108px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">550825</td>
			<td>propidium iodide/RNase staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody</td>
			<td style="width:108px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody</td>
			<td style="width:108px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-20044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:108px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">8516s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:108px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">2118s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">170-6516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">170-6515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation

셀을 동기화 하는 기능 세포 주기 규칙의 우리의 이해를 발전의 중심이 되었습니다. 일반적인 기술이 포함 혈 부족; 화학 물질 세포에서 다른 세포 주기 단계; 체포 또는 mitotic 쉐이크-오프는 그들의 감소 된 준수 악용의 사용. 그러나, 이러한 모든 단점이 있다. 예를 들어 혈 청 기아 잘 정상 세포에 대 한 하지만 덜 oncogene 활성화 나 종양 억제기 손실로 인해 손상 된 세포 주기 검문소와 종양 세포에 대 한 잘 작동합니다. 마찬가지로, 화학적 치료 세포 인구는 약물 유발 손상 항구 하 고 스트레스 관련 변경 표시 수 있습니다. 이러한 문제를 circumvents는 기술 셀 2 개의 반대 힘, 원심력과 유체 속도, 크기 및 밀도 기준으로 셀의 분리에 어떤 결과를 받게 됩니다 특히 원심 elutriation (CCE) 이다. 때문에 세포 주기를 통해 일반적으로 발전 확대, CCE 다른 세포 주기 단계에 셀을 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포에이 기술을 적용. 최적의 조건에서 우수한 수익률에 g 1 단계 셀의 근본적으로 순수한 인구와 G2/M 단계에 있는 세포의 매우 풍부한 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 세포 인구를 항 암 제 약물의 행동의 공부 세포 주기-종속 메커니즘 및 다른 응용 프로그램에 대 한 적합 합니다. 우리는 또한 어떻게 표준 절차 수 있습니다 수정 최적이 아닌 성능 결과 보여 하 고 기술의 한계를 논의. 응용 프로그램 및 다른 종류의 세포에 기술 탐구 상세한 방법론 제시 용이 해야.

기본 모든 셀 (3-4 × 108) 원심 elutriation 대상이 되었고 프로토콜에 설명 된 대로 두 세척 분수와 20 메인 분수, 수집. 표 1 각 분수 해당 회전자 속도 있는 셀의 총 수 제시는 대표 데이터를 보여 줍니다. 전반적인 항복이 했다 일반적으로 80% 이상. 개별 분수에 셀 직경의 측정 확인 해당 셀 직경 elutriation (그림 2) 진출 증가. 이러한 결과 두 개의 독립적인 결정의 평균을 대표 하 고 데이터 재현성의 높은 학위를 반영. 분수 다음 propidium 요오드 화물 얼룩을 복종 되었다과 cytometry DNA 콘텐츠 (그림 3)를 결정 합니다. 초기 분수 (F1-f 5) G1 단계를 대표 하는 2N DNA 콘텐츠로 거의 독점적으로 셀을 포함. G 1 단계에서 S 단계 세포의 혼합물 중간 분수 (F6-F9)에서 관찰 되었다 그리고 4N DNA 콘텐츠로 셀 f 10에서 시작 관찰. 나중 분수 주로 셀 4N DNA 콘텐츠 G2/M 단계를 대표 했다. 그림 2 의 결과 함께이 데이터 셀 크기와 세포 주기 단계 사이의 관계를 확인 했다.
이러한 결과 바탕으로, 분수 f 1-f 5 g 1 단계에서 셀의 수영장을 만들 결합 했다 그리고 분수 F17-F20 G2/M 단계에서 셀의 수영장을 만들 결합 했다. 2N DNA 콘텐츠 g 1 단계 풀에 포함 된 셀의 비율 일반적으로 99% 이었고 4N DNA 콘텐츠 G2/M 수영장에서 포함 된 셀의 비율 일반적으로 85%, propidium 요오드 화물 얼룩에 의해 결정 되 고 cytometry 흐름. 비동기 조건 하에서 모든 셀 g 1 단계에 15-20%는 기본의 60-70%는 G2/M 단계15, 따라서 elutriation 농축의 높은 수준을 반영 후 얻은 값에에서 있습니다. 세포 주기 단계에 대해 두 개의 풀을 더 인증 하려면 각에서 추출 G1 또는 G2/M 단계의 마커와 immunoblotting를 받게 했다. 첫째, 우리 인식 (Rb) retinoblastoma 단백질 phosphorylated Ser-807 또는 Ser-811, 이후 그것은 잘 설립 Rb phosphorylated 점점 된다 세포 주기17 통해 셀 사전으로는 인 특정 항 체를 활용 . 그림 4에 나와 인 Rb의 레벨 셀 g 1 단계 풀, 기대와 일치 대 G2/M 수영장에 훨씬 더 높은 했다. 우리는 또한  B1, G2/M 단계 셀에 가장 높은 표현 및  D1, 가장 높은 g 1 단계 세포18 (그림 4)에 표현에 대 한 조사. G2/M 수영장  B1 G1 수영장, 기대와 일치에 비해 훨씬 높은 수준의 했다.  D1 이러한 준비에만 약한 신호를 준 하지만 그럼에도 불구 하 고 g 1 수영장에서 감지 및 G2/M 수영장에서 탐지 되었다. GAPDH 사용 되었다 동등한 단백질 로드를 확인 하는 컨트롤.
그들의 효과 평가 하 고 최적의 성능에 대 한 조건을 설정 하는 표준 프로토콜에 대 한 수정 수행 되었습니다. 첫째, 분수 수집된의 수 감소 했다에 표준 20에서 표 2와 같이 3에서 결정 하는 속도 사용 하 여 표, G1 또는 G2/M 단계에 있는 셀의 컬렉션에 대 한 터미널 포인트를 표현 하기 위해 1만. F1 및 F3 분수의 DNA 콘텐츠 분석 그림 5A에 표시 됩니다. 분수 1 셀 g 1 단계 (95%)에서 매우 풍부 하 게 포함 하 고 표준 조건 (그림 3)에서 얻은 것을 이와 유사한 순도의 이렇게 이었다. 그러나, 분수 3, 표면적으로 세포가 매우 G2/M 단계에서 농축도 존재 하는 g 1과 S 단계에서 세포와 혼합된 인구를 주었다. G2/M 세포 전체의 51%만 표현 표준 조건 하에서 85%에 비해. 이러한 결과 분수 타협 샘플 품질의 수를 줄여 절차를 단순화 하기 위해 시도 나타냅니다. 다음, 우리 시 약 소비를 줄이기 위해 수단으로 분수 볼륨 감소의 효과 테스트 합니다. 표준 elutriation 40 mL 50 mL 분수 대신 수집을 제외 하 고 수행 되었다. 분수 F1 및 F20 DNA 콘텐츠에 대 한 분석 했다. 그림 5B같이 분수 F1 g 1 단계 셀 (98%), 표준 조건 하에서 얻어진 저것과 유사한 높은 농축 했다. 그러나, 셀만 전체의 64%를 대표 하는 G2/M 단계에와 모든 3 개의 단계에서 분수 F20 포함 된 셀 표준 조건 하에서 85%에 비해. 이 결과 샘플 품질을 타협도 분수 볼륨 감소를 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56418/56418fig1.jpg"> 
그림 1 . 특히 원심 elutriation의 원리입니다. 참고 여기에 표시 된 대로 특히의 속도 증가 하거나 감소 하는 회전자 속도 셀의 그 elutriation 달성 될 수 있다. 맥 밀란 발행인 주식 회사에서 허가 의해 적응: [자연 프로토콜] (Ref 8.), 저작권 (2008)8. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56418/56418fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56418/56418fig2.jpg"> 
그림 2 . 기본 모든 직경 세포 elutriation 분수와 함께 증가. 평균 직경 샘플 당 500-4500 개별 셀에서 데이터를 기록 하는 세포 분석기를 사용 하 여 각 부분에 대 한 결정 했다. 표시 된 데이터는 두 개의 독립적인 실험에서 평균 ± 사 우 스 다코타. 참고 많은 포인트에 대 한 오차 막대 기호 보다 작은 그리고 명확성을 위해 생략 되었다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56418/56418fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56418/56418fig3.jpg"> 
그림 3 . DNA 콘텐츠 분석 다른 세포 주기 단계에서 모든 셀 기본의 성공적인 분리 확인합니다. 10 mL 각 분수의 70%에 고정 되었다 EtOH, propidium 요오드 화물에 얼룩이 지 고으로, cytometry에 의해 분석 설명15. Propidium 통합 요오드 화 강도 (x 축) 어디 2N DNA 콘텐츠 G1 단계 나타내고 4N DNA 콘텐츠 나타냅니다 셀 g 2 M 단계에서 각 단계에 세포의 부분을 결정 하는 세포 수 (y 축) 대 구성 했다. 표시 된 데이터는 대표적인 실험에서 고 필수적인 동일한 결과 4 개의 반복에서 얻은. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56418/56418fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56418/56418fig4.jpg"> 
그림 4 . 에 세포 주기 관련 단백질의 Immunoblot 분석 풀링된분수입니다. 다음 주 모든 셀, 분수 f 1-f 5 G1 단계 수영장과 분수 F17-만드는 결합 했다의 표준 elutriation F20 G2/M 단계 풀을 만들기 위해 결합 했다. 추출 물 준비 및 40 µ g/레인 이전15, 인 Rb (Ser807/811), 항 체와 함께 설명한 대로 immunoblot 분석 대상이  B1, 또는  D1, 1:2,000 희석에서 사용 된 모든 했다. GAPDH (1:10, 000) 로드 제어로 사용 되었다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56418/56418fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56418/56418fig5.jpg"> 
그림 5 . 설명 데이터 차선 elutriations에서. A) 분수 수집의 수를 감소의 효과. 3 주 분수 (F1-f 3), 표준 20, 100 mL의 각 대신 수집 했다, 속도에 표 2에 표시 된 대로. 분수 f 1와 f 3 그림3 DNA 콘텐츠에 대 한 분석 했다. B) 분수 볼륨 감소의 효과입니다. 20 분수, 표 1에서와 같이 동일한 조건 하에서 수집 하지만 40 mL 표준 50 mL 대신 elutriation 버퍼의 각각을 위해 사용 되었다. 분수 F1 및 F20 그림3 DNA 콘텐츠에 대 한 분석 했다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56418/56418fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>분수</td>
			<td>속도 (rpm)</td>
			<td>G 조-포스</td>
			<td>총 셀 (x 10 ^6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W1</td>
			<td>3000</td>
			<td>867 x g</td>
			<td>17.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W2</td>
			<td>2920</td>
			<td>821 x g</td>
			<td>7.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1</td>
			<td>2860</td>
			<td>788 x g</td>
			<td>4.60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2</td>
			<td>2800</td>
			<td>755 x g</td>
			<td>10.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3</td>
			<td>2740</td>
			<td>723 x g</td>
			<td>15.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4</td>
			<td>2680</td>
			<td>692 x g</td>
			<td>22.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F5</td>
			<td>2620</td>
			<td>661 x g</td>
			<td>26.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F6</td>
			<td>2560</td>
			<td>631 x g</td>
			<td>25.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F7</td>
			<td>2500</td>
			<td>602 x g</td>
			<td>22.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F8 키</td>
			<td>2440</td>
			<td>573 x g</td>
			<td>18.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F 9</td>
			<td>2380</td>
			<td>546 x g</td>
			<td>14.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F10</td>
			<td>2320</td>
			<td>518 x g</td>
			<td>10.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F11</td>
			<td>2260</td>
			<td>492 x g</td>
			<td>7.43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 키</td>
			<td>2200</td>
			<td>466 x g</td>
			<td>8.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F13</td>
			<td>2140</td>
			<td>441 x g</td>
			<td>6.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F14</td>
			<td>2100</td>
			<td>425 x g</td>
			<td>4.98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F15</td>
			<td>2060</td>
			<td>409 x g</td>
			<td>3.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F16</td>
			<td>2020</td>
			<td>393 x g</td>
			<td>3.43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F17</td>
			<td>1980</td>
			<td>378 x g</td>
			<td>2.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F18</td>
			<td>1940</td>
			<td>363 x g</td>
			<td>3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F19</td>
			<td>1900</td>
			<td>248 x g</td>
			<td>2.78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F20</td>
			<td>1860</td>
			<td>333 x g</td>
			<td>1.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>중지</td>
			<td>0</td>
			<td>0 x g</td>
			<td>5.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">총 수익률</td>
			<td>245.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">백분율 수확량</td>
			<td>81.69</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1입니다. 셀 생산량 및 해당 회전자 각 분수에 대 한 속도. 세포 수 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 결정 했다. 총 수익률은 입력 (3 x 108 셀) 대 개별 분수의 합으로 결정 했다. 데이터는 두 개의 대표적인 실험의 평균. 원심력과 해당 회전자 속도 제공 됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>분수</td>
			<td>속도 (rpm)</td>
			<td>G 포스</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W1</td>
			<td>3000</td>
			<td>867 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W2</td>
			<td>2920</td>
			<td>821 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1</td>
			<td>2620</td>
			<td>661 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2</td>
			<td>2020</td>
			<td>393 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3</td>
			<td>1860</td>
			<td>333 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>중지</td>
			<td>0</td>
			<td>0 x g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2입니다. 차선의 elutriation 속도 매개 변수입니다. 원심력과는 세척에 대 한 해당 회전자 속도 압축된 차선 elutriation에 수집 된 3 개의 분수는입니다. 그림 5A 해당 DNA 콘텐츠 및 자세한 내용은 텍스트를 참조 하십시오.

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Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

preparation-primary-acute-lymphoblastic-leukemia-cells-different-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.2K 조회수.  University of Arkansas for Medical Sciences. 이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

비디오: Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients have achieved complete remission (CR). Approximately half of the adult patients who entered CR will relapse within 12 months due to the outgrowth of residual AML cells in the bone marrow. The quantitation of these remaining leukemia cells, known as minimal or measurable residual disease (MRD), can be a robust biomarker for the prediction of these relapses. Moreover, retrospective analysis of several studies has shown that the presence of MRD in the bone marrow of AML patients correlates with poor survival. Not only is the total leukemic population, reflected by cells harboring a leukemia associated immune-phenotype (LAIP), associated with clinical outcome, but so is the immature low frequency subpopulation of leukemia stem cells (LSC), both of which can be monitored through flow cytometry MRD or MRD-like approaches. The availability of sensitive assays that enable detection of residual leukemia (stem) cells on the basis of disease-specific or disease-associated features (abnormal molecular markers or aberrant immunophenotypes) have drastically improved MRD assessment in AML. However, given the inherent heterogeneity and complexity of AML as a disease, methods for sampling bone marrow and performing MRD and LSC analysis should be harmonized when possible. In this manuscript we describe a detailed methodology for adequate bone marrow aspirate sampling, transport, sample processing for optimal multi-color flow cytometry assessment, and gating strategies to assess MRD and LSC to aid in therapeutic decision making for AML patients.

Detection of minimal or measurable residual disease (MRD) is an important prognostic biomarker for refining risk assessment and predicting relapse in acute myeloid leukemia (AML). These comprehensive guidelines and recommendations with best practices for consistent and accurate identification and detection of MRD, may aid in making effective AML treatment decisions.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

연구

암 연구학

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in adults. Initially, AML is a disease of hematopoietic stem cells (HSC) characterized by arrest of differentiation, subsequent accumulation of leukemia blast cells, and reduced production of functional hematopoietic elements. Heterogeneity extends to the presence of leukemia stem cells (LSC), with this dynamic cell compartment evolving to overcome various selection pressures imposed upon during leukemia progression and treatment. To further define the LSC population, the addition of CD90 and CD45RA allows the discrimination of normal HSCs and multipotent progenitors within the CD34+CD38- cell compartment. Here, we outline a protocol to detect simultaneous expression of several putative LSC markers (CD34, CD38, CD45RA, CD90) on primary blast cells of human AML by multiparametric flow cytometry. Furthermore, we show how to quantify three progenitor populations and a putative LSC population with increasing degree of maturation. We confirmed the presence of these populations in corresponding patient-derived-xenografts. This method of detection and quantification of putative LSC may be used for clinical follow-up of chemotherapy response (i.e., minimal residual disease), as residual LSC may cause AML relapse.

We outline a protocol to detect simultaneous expression of leukemia stem cell markers on primary acute myeloid leukemia cells by flow cytometry. We show how to quantify three progenitor populations and a putative LSC population with increasing degree of maturation. We confirmed the presence of these populations in corresponding patient-derived-xenografts.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly indicate that aneuploidy triggers genome instability, ultimately generating cells with complex karyotypes that arrest their proliferation. Isolation and characterization of cells harboring complex karyotypes are crucial to study the impact of an imbalanced chromosome number on cell physiology. To date, no methods have been established to reliably isolate such aneuploid cells. This paper provides a protocol for the enrichment and analysis of aneuploid cells with complex karyotypes utilizing standard, inexpensive tissue culture techniques. This protocol can be used to analyze several features of aneuploid cells with complex karyotypes including their induced senescence-associated secretory phenotype, pro-inflammatory properties, and ability to interact with immune cells. Because cancer cells often harbor imbalances in chromosome number, it is crucial to decipher how aneuploidy impacts cell physiology in normal cells, with the ultimate goal of uncovering both its pro- and anti-tumorigenic effects.

Aneuploidy leads to genome instability, which eventually produces cell cycle-arrested cells with complex karyotypes. This paper provides a simple and convenient method to isolate aneuploid cells with complex karyotypes that cease to divide.

생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer treatments as used in clinical oncology. It enables a quantitative and longitudinal analysis of the DNA damage response after genotoxic stress, as induced by radiotherapy and a multitude of anti-cancer drugs. The method covers all stages of the DNA damage response, providing endpoints for induction and repair of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle arrest and cell death by apoptosis in case of repair failure. Combining these measurements provides information about cell cycle-dependent treatment effects and thus allows an in-depth study of the interplay between cellular proliferation and coping mechanisms against DNA damage. As the effect of many cancer therapeutics including chemotherapeutic agents and ionizing radiation is limited to or strongly varies according to specific cell cycle phases, correlative analyses rely on a robust and feasible method to assess the treatment effects on the DNA in a cell cycle-specific manner. This is not possible with single-endpoint assays and an important advantage of the presented method. The method is not restricted to any particular cell line and has been thoroughly tested in a multitude of tumor and normal tissue cell lines. It can be widely applied as a comprehensive genotoxicity assay in many fields of oncology besides radio-oncology, including environmental risk factor assessment, drug screening and evaluation of genetic instability in tumor cells.

The presented method combines the quantitative analysis of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle distribution and apoptosis to enable cell cycle-specific evaluation of DSB induction and repair as well as the consequences of repair failure.

유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant cellular localization disrupting their mechanism of action. The survival of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) cells, among other cancer cells, is assisted by the deregulation of nuclear to cytoplasmic shuttling, at least in part through deregulation of the transport receptor XPO1 and the constitutive activation of PI3K-mediated signaling pathways. It is essential to understand the role of individual proteins in the context of their intracellular location to gain a deeper understanding of the role of such proteins in the pathobiology of the disease. Furthermore, identifying processes that underlie cell stimulation and the mechanism of action of specific pharmacological inhibitors, in the context of subcellular protein trafficking, will provide a more comprehensive understanding of the mechanism of action. The protocol described here enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These fractions can be used to determine changes in protein trafficking between the nuclear and cytoplasmic fractions upon cell stimulation and drug treatment. The data can be quantified and presented in parallel with immunofluorescent images, thus providing robust and quantifiable data.

This protocol enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These samples are used to determine protein localization as well as changes in protein trafficking that take place between the nuclear and cytoplasmic compartments upon cell stimulation and drug treatment.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties (so called leukemic stem cells, LSCs) from more differentiated counterpart leukemic cells that lack disease initiation potential although they carry similar leukemia specific genetic mutations. NKG2DL are biochemically highly diverse MHC class I-like self-molecules. Healthy cells in homeostatic conditions generally do not express NKG2DL on the cell surface. Instead, expression of these ligands is induced upon exposure to cellular stress (e.g., oncogenic transformation or infectious stimuli) to trigger elimination of damaged cells via lysis through NKG2D-receptor-expressing immune cells such as natural killer (NK) cells. Interestingly, NKG2DL surface expression is selectively suppressed in LSC subpopulations, allowing these cells to evade NKG2D-mediated immune surveillance. Here, we present a side-by-side analysis of two different flow cytometry methods that allow the investigation of NKG2DL surface expression on cancer cells i.e., a method involving pan-ligand recognition and a method involving staining with multiple antibodies against single ligands. These methods can be used to separate viable NKG2DL negative cellular subpopulations with putative cancer stem cell properties from NKG2DL positive non-LSC.

We present two different staining protocols for NKG2D ligand (NKG2DL) detection in human primary acute myeloid leukemia (AML) samples. The first approach is based on a fusion protein, able to recognize all known and potentially yet unknown ligands, while the second protocol relies on the addition of multiple anti-NKG2DL antibodies.

급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...