이 문서의 목적은 후속 메타볼로메 분석을 위해 배양 된 암세포에서 수성 대사 산물을 추출하기위한 상세하고 단계적 시각적 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 부착 된 세포에서 대사 산물을 추출하기위한 단순성과 신뢰성입니다. 그러나 무엇보다도 모세관 전기 포근 질량 분석법 또는 CEMS를 사용하여 메타볼로메 분석에 최적화되어 있습니다.
Metabolomics는 암 환자에 대한 바이오 마커 또는 초기 단계 암을 감지하고 화학 요법 반응을 예측하는 강력한 기술입니다. 우리는 이 데모에서 암세포를 사용합니다. 그러나, 이 기술은 또한 iPS 세포에 있는 섬유아세포와 같은 그밖 부착된 세포에서 대사 산물을 수확하기 위하여 적용될 수 있습니다.
대사 산물 농도는 실행 가능한 세포의 수에 따라 정규화됩니다. 문화의 주의 깊은 준비, 이것은 좋은 재현 가능한 데이터를 얻기위한 열쇠입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 아미 마루야마가 될 것입니다.
우선, 플레이트 HCC827 및 PC-9 세포는 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지의 10 밀리리터를 포함하는 100mm 접시에 있습니다. 배양에 24시간 동안 인큐베이터에 5%의 이산화탄소와 섭씨 37도를 놓습니다. 인큐베이션 후 100mm 배양 접시를 부드럽게 기울여 세포 배양 매체를 흡인시합니다.
칼슘과 마그네슘없이 인산염 완충 식염수 용액의 두 밀리리터를 사용하여 각 접시에 세포를 씻어. PBS 용액이 접시 표면을 완전히 덮도록 각 접시를 부드럽게 흔들어 서 접시를 기울여 세척 버퍼를 흡인시합니다. 따뜻한 0.25%의 트립신-EDTA 용액이 섭씨 37도에 떨어뜨려갑니다.
5밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 각 접시에 따뜻한 트립신-EDTA 용액 2밀리리터를 추가합니다. 트립신이 접시의 표면을 완전히 덮을 수 있도록 각 접시를 부드럽게 흔들어 주세요. 문화 요리를 섭씨 37도에서 약 5분간 배양하세요.
그런 다음, 각 접시에 미리 따뜻하게 된 완전한 성장 매체의 4 밀리리터를 추가합니다. 그리고 부드럽게 파이펫을 여러 번 반복하여 세포를 배지로 다시 일시 중단합니다. 각 셀 서스펜션을 별도의 15밀리리터 원판 튜브로 전송합니다.
원심 분리기는 800배 g로 5분간. 상체를 버리고 미리 따뜻진 완전한 성장 매체의 2 밀리리터에서 각 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 서스펜션의 마이크로리터 10개에 0.4%의 마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로튜브에 넣습니다.
모세관 작용을 통해 세포 계수 챔버 슬라이드에 혼합물의 10 마이크로 리터를적. 챔버 슬라이드를 자동화된 셀 카운터에 삽입하고 캡처 버튼을 눌러 이미지를 캡처하고 셀의 총 수 및 %의 생존 가능성 결과를 표시합니다. 총 세포 수가 밀리리터당 0.5백만 세포 이상이면, 원하는 세포 농도를 얻기 위해 15밀리리터 원내 튜브에 추가 성장 배지를 추가한다.
이제 각 100mm 세포 배양 접시에 배양2~5밀리리터를 추가하여 접시당 약 1~2 1/2백만 개의 세포를 시드합니다. 문화 용 요리는 18 시간 동안 섭씨 37도에서 5 %의 이산화탄소를 배양합니다. 첫째, 15밀리리터 체피트릭 플라스크에서 L-메티오닌 설포네 및 D-Camphor-10-sulfonic acid 1, 000배의 초순수수를 포함하는 상업용 내부 표준 솔루션을 희석시하십시오.
초순수물에 매니톨을 녹여 세척 버퍼로서 초순수 수역에서 밀리리터 마니톨 용액 당 0.05 그램을 준비하십시오. 그런 다음 각 원심 필터 장치의 필터 컵에 넣고, 파이펫 250 마이크로리터의 초순수수. 필터 유닛을 단단히 밀고 원심분리기를 섭씨 4도에서 100배, 5분간 100회 원심분리기를 캡을 씌우습니다.
각 여과의 볼륨을 확인합니다. 첫 번째 짧은 스핀 중에 상당한 여과가 축적된 경우 필터 장치가 결함이 있을 수 있습니다. 필터 장치를 폐기하고 대신 새 필터 장치를 사용합니다.
필터 장치의 뚜껑을 단단히 닫고 원심분리기를 섭씨 4도에서 100배, 30분 동안 다시 닫습니다. 필터 컵에 초순수물이 남아 있지 않도록 하고 파이펫으로 각 수집 튜브의 여과된 초순수수를 제거하십시오. 필터 컵을 수집 튜브에 다시 넣고 건조 시 손상을 피하기 위해 1 시간 이내에 원심 필터 장치를 사용합니다.
인큐베이터에서 100mm 배양 접시를 꺼내 각 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하십시오. 각 접시에 250 마이크로몰러 디아미드의 유무에 관계없이 PBS 배양 배지 10밀리리터를 추가하여 세포 층을 방해하지 않도록 주의하십시오. 30분 동안 37°C의 문화 요리를 배양합니다.
인큐베이션 후, 각 100mm 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡인한다. 접시를 약간 기울이고, 부드럽게 세포를 씻어 각 접시의 가장자리에 5 %의 마니톨 워시 버퍼의 두 밀리리터를 추가, 세포 층을 방해하지 않도록주의. 각 배양 접시에서 세척 버퍼를 흡인하고, 접시를 약간 기울이고 접시 당 세척 버퍼 10 밀리리터를 부드럽게 추가하여 세포를 다시 씻으십시오.
그런 다음 각 문화 접시의 가장자리에서 세척 버퍼를 완전히 흡인시합니다. 이제 문화 요리당 99.7%의 메탄올800 마이크로리터를 추가하고 각 문화 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 전체 표면을 덮습니다. 30초 동안 실온에서 요리를 그대로 둡니다.
파이펫 끝을 메탄올에 담그고 여러 번 부드럽게 파이펫을 피펫하여 접시당 희석 된 내부 표준 용액 550 마이크로 리터를 천천히 추가하십시오. 각 문화 요리를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 전체 표면을 덮고, 30 초 동안 실온에서 요리를 둡니다. 그런 다음, 추출된 용액을 각 배양 접시에서 별도의 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송한다.
튜브를 섭씨 4도에서 2, 300배에서 5분간 원심분리합니다. 각 슈퍼네티의 700마이크로리터를 2개의 원심 필터 단위로 옮기고, 단위당 350마이크로리터를 제공합니다. 필터 튜브는 필터 컵에 액체가 남아 있지 때까지 약 2 시간 동안 섭씨 4도에서 100 배, 100 배 g에서 원심 분리.
필터 컵을 제거하고 수집 튜브의 뚜껑을 단단히 닫습니다. 이 연구에서, HCC827 및 PC-9 세포는 3 시간 동안 동등하게 성장했다. CEMS 분석은 두 세포주를 위한 디아미드 처리된 세포와 PBS 처리된 세포 사이 다름을 나타냅니다.
이들 중, 펜토제 인산염 통로및 상부 글리코리시스에서 몇몇 중간체는 diamide 처리조건에서 상당히 높았고, 몇몇 트리카박스사이클 중간체는 처리된 조건에서 낮았다. 세포 내 대사 산물의 메타볼리트 프로파일은 HCC827 및 PC-9 세포에서 각각 175 및 150 개의 차동 대사 산물을 각각 밝혔다. 디아미드 처리에 이어, 글루콘산과 산화포도당의 수준은 HCC827 세포에서 12배, PC-9 세포에서 10배 증가했다.
유사하게, 제1육소키나제-촉매글리소리시스 제품에서 인산포도당인 포도당 6-인산염의 수준도 HCC827 및 PC-9 세포에서 각각 6.3배 및 3.5배 증가했다. 또한, 펜토스 인산염 통로의 첫 번째 중간인 6-인산글루코네이트의 수준은 HCC827 세포에서 89배, PC-9 세포에서 231배 나증가했다. 대조적으로, 과당 6-인산염과 같은 그밖 당화성 중간체의 수준은 디아미드 실험 조건에서 변경되지 않았습니다.
총 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 수준은 디아미드 치료와 PBS 조절 조건 간에 거의 동등했다. PBS 이외의 5%매니톨 용액을 사용하여 세척 셀에 대한 세척 버퍼는 CEMS 분석에 매우 중요하며, 이는 염기반 완충제가 분석을 방해하고 측정에 부정적인 영향을 미치기 때문입니다. 이 프로토콜은 지질과 같은 소수성 대사 산물을 추출하기에 적합하지 않으므로 보다 포괄적인 메타볼로메 분석을 위해 소수성 대사 산물을 편리하게 추출하기위한 프로토콜을 개발해야합니다.
이 기술은 거의 모든 부착 세포에서 대사 산물의 쉬운 추출을 실현하고, 따라서, 암, 줄기 세포, 약리학, 영양 및 화장품 과학과 같은 다양한 연구에 적용 할 수 있습니다.
