QRT-PCR 기계의 사용에 감사 박사 Kati Andreasson (부의 신경과 및 신경 과학, 스탠포드 대학) 하 고. 일은 스탠포드 학부의 학장의 박사 친목 (사운드) 국립 연구소의 건강 보조금 K08NS098876 (P.M.G.)을 지원 했다.

모든 줄기 세포 및 동물 절차 및 실험실 동물 관리 (SCRO 616 및 APLAC 31909)에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 스탠포드의 줄기 세포 연구 감독 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 이토 유리 에칭
<ol><li>인듐 주석 산화물 (ITO) 준비-유리의 전도성 저쪽 마스킹 에이전트를 배치 하 여 커버 유리 슬라이드. 참고: 대부분의 상용 투명 테이프는 마스킹 요원으로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>블레이드를 사용 하 여 초과 마스크를 제거, 최종 이토 디자인만 원하는 모양 떠나는 유리에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>질소 산의 5% (v/v) 및 에칭 솔루션을 준비 하는 증기 두건 안쪽 유리 비 커에 HCl의 45% (v/v) 결합 한다.<ol>
<li>핫 플레이트와 온도계를 사용 하 여 솔루션을 에칭의 온도 70 ° c.에 유지 되도록</li>
	</ol>
</li>
	<li>에칭 솔루션에는 70 ° C에 도달 하면, 2 분 초과 이토 레이어를 제거를 위한 솔루션으로 마스크-이토 유리 슬라이드를 놓습니다. 참고: 테이프 마스킹 산 성 솔루션에 노출에서 이토 레이어를 보호합니다.</li>
	<li>솔루션에서 슬라이드를 제거 하 고 이온된 (DI) H2o.로 그것을 씻어합니다</li>
	<li>조심 스럽게 제거 나머지 이토 그대로 되도록 멀티 미터를 사용 하 여 마스크와 측정 저항. 원하는 에칭된 면의 해독 약 0 Ω 이어야 한다.</li>
</ol>2입니다. Pyrrole 솔루션의 준비
<ol><li>1000 mL 유리병에 디 H2o.의 600 mL에 70 g 나트륨 dodecylbenzenesulfonate (NaDBS)의 해산</li>
	<li>일단는 NaDBS 해산 솔루션에 0.2 M pyrrole의와 디 H2O의 386 mL 14 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>커버 알루미늄 호 일로 솔루션 및 4 ° c.에 저장</li>
</ol>3. 전기 Polypyrrole 이토 유리에의
<ol><li>따뜻한 실내 온도에 pyrrole 솔루션 NaDBS redissolved 완전히 때까지. 참고:이 약 15 ~ 20 분 정도 걸립니다.</li>
	<li>Pyrrole 솔루션의 25 mL 비 커에 붓으십시오.</li>
	<li>멀티 미터를 에칭된 이토 유리를 연결 하 고 슬라이드 pyrrole 솔루션에 잠수함.<ol>
<li>0 Ω 저항 측면 플래티넘 메쉬 참조 전극으로 직면 하 고 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PPy의 멀티 미터 (전류 3 mA/cm2 에서 4 시간에 대 한)를 사용 하 여 ITO 표면에 전기 도금을 시작 하는 전류를 적용 합니다.</li>
	<li>멀티 미터 및 세척 전기-PPy 디 H2O 잔여 계면 활성 제를 제거 하에서 ITO 유리를 제거 합니다.</li>
	<li>부드럽게 면도날을 사용 하 여 이토 유리에서 전기 PPy 플레이트를 분리 합니다.<ol>
<li>실 온에서 PPy 접시를 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다.입니다 (PDMS)의 준비
<ol><li>주걱과 무게 접시 사용 하, 경화제의 2 세대와 기본 에이전트의 18 g을 혼합 하 고 두 10 cm x 8 cm 유리 금형에 혼합물을 부 어.</li>
	<li>15-20 분 동안 진공 챔버를 사용 하 여 금형에서 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>3 h 70 ° C 오븐에 금형을 놓습니다.</li>
	<li>일단 냉각, 금형에서는 PDMS를 제거 하려면 평평한 주걱을 사용 합니다.</li>
</ol>5. 시험관에 전기 자극 챔버의 제조
<ol><li>압력솥 (WxL, 2.5 c m x 12.5 c m) 금속 접시와 흐름 1 시간 동안 120 ° C에서 밸브.</li>
	<li>템플릿으로 챔버 슬라이드를 사용 하 여, PDMS의 두 조각을 잘라. 참고: PDMS의 한 조각 셀 챔버 내에서 두 개의 인접 한 사각형의 배 기판 가진 셀 챔버의 경계 역할을 합니다. 다른 PDMS 조각 챔버의 경계에 대 한 개요입니다.<ol>
<li>잘라 안쪽에 밖으로 셀을 정사각형 모양 실과 셀 챔버의 모양을 일치. PDMS의 두 조각의 전반적인 모양은 직사각형 이며 챔버 슬라이드의 일치를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>맨 아래에서 다음과 같은 자료를 레이어: (1) 금속 격판덮개, (2) (단편), 없이 PDMS (3) PPy 플레이트 (PDMS에 수직), (단편)와 (4) PDMS 및 (5) 셀 챔버.</li>
	<li>일단 완벽 하 게 정렬 기구를 함께 클램프.</li>
	<li>금속 와이어의 두 60 cm 조각 잘라내어 실버 붙여넣기를 사용 하 여 챔버의 외부에서 돌출 PPy 플레이트의 각 끝에 1 개의 철사를 연결. 전선은 충분히 인큐베이터의 외부에 장치에서 확장을 확인 합니다.</li>
	<li>일단은 풀 치료 강화와 에폭시와 와이어 연결 인감.<ol>
<li>적용된 분야는 각 챔버에 동일 다는 것을 확인 하는 멀티 미터를 사용 하 여 저항을 기록 합니다.</li>
		<li>이식, 제거 와이어; unclamp 셀 챔버 및 PDMS 그리고 그들 전도성 발판에서 별도. 이식 장비의 차원은 약 1 m m x 3 m m x 0.25 m m입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 인간의 신경 조상 세포 (hNPCs) PPy에 도금
<ol><li>2 시간 동안 UV 빛에서 조립된 챔버를 소독.<ol>
<li>1 시간 후 조립 회전 90 °를 실.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 후 코트 코팅 기판의 800 µ L와 아래쪽 챔버의 PPy의 표면 하 고 1 시간에 5% CO2 에서 37 ° C에서 인큐베이터의 PPy 접시에 공고히 기판 허용.</li>
	<li>1 시간 후 챔버에서 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 잘 당 DPBS Ca + Mg의 1 mL로 씻어. 참고:로이 코팅 기판의 분리로 인해 강제로 PPy의 표면 세척 하지 마십시오.</li>
	<li>신선한 셀 미디어를 사용 하 여 기계적으로 부드러운 pipetting으로 조직 배양 접시에서 챔버와 함께 사용 하기 위해 배양된 세포 분열. 참고: 셀 분리 시 90-100% 합칠 이어야 한다.</li>
	<li>HNPC 펠 릿 8000 x g에서 5 분간 원심 분리를 사용 하 여 수집.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 고 100, 000 셀/c m2의 볼륨에서 셀 resuspend.</li>
	<li>각 챔버 잘 (100000 셀/cm2 미디어의 1 ml에서)으로 100000 세포를 플레이트.</li>
	<li>5%에서 37 ° C에서 인큐베이터 챔버 돌아가기 CO2.
</li>
</ol>7. 전기 자극의 hNPCs
<ol><li>챔버에 세포를 뿌리기 후에 1 일 파형 발생기를 사용 하 여 셀에 전기 자극을 적용.</li>
	<li>자극, 전에 잘 각 약 실에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 800 µ L를 보충 합니다.</li>
	<li>미디어를 변경한 후 약 실 인큐베이터에 다시, 인큐베이터에서 철사 연장 놓고 파형 발생기에 첨부</li>
	<li>1 시간에 100 Hz와 ±400 mV에서 구형 파 신호를 세포에 자극을 적용 합니다.</li>
	<li>자극 후 철사를 제거 하 고 또 하루 5% CO2와 37 ° C에서 설정 하는 인큐베이터에서 챔버를 품 어.</li>
	<li>세포 생존 능력 및 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 다음 제조 업체의 프로토콜을 포함 하 여 이후 생물 학적 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>8. PPy 이식 Vivo에서
<ol><li>T 세포 결핍에 원심 중간 대뇌 동맥 (dMCA) 폐색 선 모델 수행 성인 남성 누드 쥐 (NIH RNU 230 ± 30 g)로2위에서 설명한. 이식 1 주일 게시물 dMCA 폐색을 수행 합니다.</li>
	<li>수술 전에 1 일 그들의 감 금 소 물에 쥐에 암 피 실린 (1 mg/mL)을 제공 합니다.</li>
	<li>Anesthetize 사용 하 여 유도 챔버 쥐 isoflurane 흡입을 통해 관리의 0.5-3 %mg / kg.</li>
	<li>발가락 핀치 반사 응답의 부족에 의해 쥐의 anesthetization를 확인 합니다.<ol>
<li>동물 마 취 동안 막, 호흡 패턴, 색상과 직장 온도 15 분 마다 모니터링을 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단 anesthetization 확인, 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 인공 눈물을 적용 합니다.</li>
	<li>무 균 기술 멸 균 장갑, 그리고 메 마른 외과 용 드 레이프13를 사용 하 여이 절차 동안 유지 됩니다 확인 하십시오. 살 균 분야 내 메 마른 외과 기구를 유지.</li>
	<li>마 취는 쥐를 실행 하는 동안 왼쪽된 피 위에 craniectomy 드릴. 경질을 엽니다.<ol>
<li>수술 마이크로-얇은 바늘을 사용 하 여 뇌에서 dura mater를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>쥐 피에 체 외에 시스템에서 전도성 건설 기계를 이식. 참고: 우리의 실험에 대 한 우리 생체 외에서 3 일 hNPC 도금 후에서 건설 기계에 이식합니다.<ol>
<li>중간 선 병 변 주로 반영 피 질에 플을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발판은 배치 후, 이식 피부 폐쇄 움직임을 방지 하기 위해 surgicel을 놓습니다.</li>
	<li>봉합 사 상처 고 쥐 buprenorphine SR stereotaxic 수술 및 dMCA 폐색과 관련 된 통증을 관리 하기 위해 1 mg/kg의 복용량에 피하 주입</li>
	<li>의식 회복 쥐 복구에 놓습니다.<ol>
<li>결코 방치 동물 그것은 의식 하는 동안.</li>
		<li>그것은 완전히 의식을 얻을 때까지 다른 동물을 배치 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>매일 몸 무게 감소, 감소 음식/물 섭취, 감소 손질/빗질 외 투, 자발적인 활동 감소/증가, 비정상적인 자세, 탈수/피부 tenting, 오목 눈, 숨기기, 자기 절제, 등 통증의 흔적에 대 한 동물을 모니터링 빠른 호흡, 오픈 짖 어 대 호흡, 경련, 떨림, 떨림과 발성 합니다.<ol>
<li>그들이 먹고, 마시고, 손질, 고 무게;를 얻고 나타날 때까지 동물을 매일 모니터링 그리고 체중 증가 후 다음 주간입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CO2 흡입 및 euthanization (으로 동물 정상적인 산소 공급 게시물 CO2 흡입으로 인해 부활 하지 것 이다)의 보조 확인을 통해 초기 euthanization 술 안 먹고 나타나는 어떤 동물에 발생 하 고 초기 수술; 후 무게를 얻고 고통을;에 나타납니다. 때문에 모터 피 질 적자를 예상 보다 더 큰 행동 테스트를 완료할 수 없습니다 나타납니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는이 작품을 선언 하 전혀 충돌의 관심이 없다.

증거를 성장 소설 뇌졸중 치료로 줄기 세포의 약속을 입증 했다. 이 약속은 적어도 40 진행 중이거나 완료 된 임상 시험을 머리 맡에 줄기 세포 치료제를 사전 중요 한 노력에 결과 있다. 선 병 급성 모욕 후 과정이 없다 신경 복구를 방지 하기 때문에 줄기 세포 치료 라는 독특한 신경 장애를 제공 합니다. 줄기 세포 강화 된 뇌졸중 복구의 정확한 기계 장치는 불분명 남아 있습니다. 신생, synaptogenesis, 및 시 냅 스 리 모델링 모두 중요 한 것을 보여줘 왔다. BDNF 등 THBS-1 시 냅 스 형성에 대 한 중요 한 분자는 제거 하는 경우 뇌졸중 복구 장애인된6,19입니다. hNPCs 수많은 동물 모델20,21에서 뇌졸중 후 기능적 복구를 개선 했습니다. 메커니즘은 hNPCs의 효과가 남아 완전히 이해 하는, 그리고이 세포에 대 한 이상적인 전달 방법 알려져 있다. HNPCs에서 발표 하는 중요 한 분자를 조작할 수 있도록 하는 시스템을 개발 하 여 한 줄기 세포 치료를 최적화 하 고 필수적인 복구 메커니즘을 차별화를 도울 수 있다.
뇌에 성공적인 셀 배달 도전 남아 있습니다. 현재, 다양 한 기술 생존 및 줄기 세포9,10의 통합을 개선 하기 위해 줄기 세포를 전달 하기 위해 다른 소재 비 계 시스템을 사용 하 여 개발 되었습니다. 그러나, 이러한 자료의 불활성 특성 때문에 그것은 그들의 이식 후 줄기 세포 조절 어렵다입니다.
이 문서에서는 PPy 비 계를 사용 하 여 전기 qRT-PCR 데이터에 BDNF와 THBS-1의 upregulation에 의해 표시 된 hNPCs의 transcriptome 조작 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 이전 연구 VEGFA 식 hNPCs에 전기 자극에 노출 후에 증가 스트로크2후 기능 회복 개선 밝혀. 여기 그 추가 neurotrophic 요인 BDNF와 THBS-1는 또한 변조 다른 hNPC 셀 라인에서 전기 자극에 노출 된 후 수많은 셀 라인 우리의 시스템을 사용할 수 있는 표시와 같은 설명 합니다.
생체 외에서 전기 자극 챔버의 제조, 중 금속 와이어 PPy 플레이트 실버 페인트와 에폭시를 사용 하 여 완전히 연결 되어 있는지 중요 하다. 이 연결 되지 않으면 소리, 심지어 같은 매개 변수와 함께 다양 한 전기 분야 발생 합니다. 또한, 시간에 미디어 스 캐 폴딩 시스템의 조립 후 누설 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 진공 그리스 밀봉 하지 셀 시드 표면에 적용 하는 PDMS 주의 PPy 플레이트 사이의 공간에 적용할 수 있습니다. PPy 플레이트의 불투명 특성상 한계가 표준 가벼운 현미경으로 세포의 confluency 검사는 제한입니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 방법의 장점은 hNPCs의 변조에 대 한 세포의 기계적 변화를 확인할 수 있습니다. 현재, 전기 변조는 하지 접근 되었다 전통적인 히드로 또는 불활성 비 계 시스템을 사용 하 여. 전기 자극 PPy 비 계를 사용 하 여, 후에 hNPCs 폴리머 표면에서 vivo에서 모델을 제거 하지 않고 전달할 수 있습니다. 방법을 더 줄기 세포 응용 프로그램의 질환 모델 연구 개발 수 있습니다 더 나은 디자인을 변환 응용 프로그램을. 전기 preconditioning 접근, 전도성 폴리머 시스템에 의해 다른 셀 형식에 적용할 수 있습니다 하 고 셀에 전기 자극의 영향의 더 나은 이해를 위해 있습니다. 체 외에서 세포 최적화 다음 없이 조작 (예: 뿌리고 또는 제거)을 추가 하는 기능 등 질병 상태에서 vivo에서 조작을 시험관에서 이러한 테스트에 대 한 수 있습니다. 궁극적인 목표는 설명된 전도성 고분자 발판 사전 뇌졸중 치료제와 뇌졸중 복구 메커니즘의 이해를 개선 등 새로운 기법을 활용 하는 것입니다.

스트로크는 세계에서 사망의 두 번째 주요 원인이 이며 미국에서 죽음의 다섯 번째 주요 원인. 이러한 높은 사망률에도 불구 하 고 뇌졸중 복구에 대 한 치료는 현재 가능한 의료 옵션 현재 사용할 수 있는1와 도전 남아 있습니다. 현재 다루고 있는 유일한 40 줄기 세포를 활용 하는 허 혈 성 뇌졸중의 임상 시험 300 개에 대 한 있다. 이전 연구 결과 줄기 세포 치료 선 수리2,3에 유익한 영향을 미칠 것으로 나타났습니다. 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF) 등 thrombospondin-1 (THBS-1) 이식된 인간의 신경 조상 세포 (hNPCs)에서 발표 Paracrine 요인의 증가와 관련 된 메커니즘을 통해 향상 된 기능 복구를 나타났습니다. 시 냅 스 형성, angiogenesis, 수지상 분기 및 새로운 axonal 계획 뿐 아니라 면역 시스템4,,56변조. 그러나, 줄기 세포의 최적의 전송 방법 애매 남아 있습니다.
뇌에 성공적인 줄기 세포 배달 도전 남아 있습니다. 현재, 주사 가능한 히드로 및 고분자 스 캐 폴딩 시스템 줄기 세포 제공 도입 되었습니다. 이러한 전달 방법 이식 시 줄기 세포를 보호 뿐만 아니라 호스트의 염증 반응과 hypoxic 조건7,,89 를 포함 하 여 가혹한 포스트 치기 환경에서 보호를 제공 , 그러나 10., 가장 일반적으로 사용 되는 재료는 불활성,11셀 연속 변조 (즉, 전기 자극)의 사용을 제한 하. 전기 자극 차별화, 이온 채널 밀도, 그리고 줄기 세포12neurite 결과 영향을 미치는 큐입니다. 불활성 고분자에 비해 전도성 고분자는 전기 자극 및 줄기 세포2의 조작에 대 한 현재 수 있도록 수행할 수 있습니다. 그러나,는 전기 자극 neurotrophic 요인 릴리스 (즉, BDNF와 THBS-1)를 변조 하는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 탐험.
이 프로토콜에서 우리는 전도성 고분자 비 계, polypyrrole (PPy), 체 외에 전기 자극에 대 한 수 있도록 구성 된 셀 문화 시스템을 구성 하는 단계를 설명 합니다. 셀 문화 체계를 조작 하는 방식으로 인해 줄기 세포 시드 비 계 요정 경색 피 질에의 후속 주입이 가능 하다. 이 시스템에 대 한 우리 전기 전제 발판에 줄기 세포 이식 전에 짧은 시간 동안. 전기 자극에 따라 셀을 들고 전도성 고분자 발판 성공적으로 intracranially 최소 침 습 방법을 사용 하 여 이식 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="623">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">FGF-Basic</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">CTP0261</td>
			<td style="width:188px;">20 ng/mL for working media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Matrigel</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">cb40234a</td>
			<td style="width:188px;">1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">LIF Protein, Recom. Hum. (10 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:103px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">LIF1010</td>
			<td style="width:188px;">10 ng/mL for working media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Sylgard 184 silicone 3.9 kg</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA56-4</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA95</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">ITO Glass</td>
			<td style="width:103px;">Delta Technologies</td>
			<td style="width:119px;">CG-40IN-0115</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Sodium dodecylbenzenesulfonate</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">289957-1KG</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Pyrrole</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">131709-500ML</td>
			<td style="width:188px;">Protect pyrrole solution from light and room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">8 well glass slide chambers</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Sci Nuc&#160;</td>
			<td style="width:119px;">125658</td>
			<td style="width:188px;">Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Flat-Surface Bracket, 3&#34;x1&#34;</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1030A4</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">TWO PART SILVER PAINT 14G</td>
			<td style="width:103px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1264214</td>
			<td style="width:188px;">Mix two parts (1:1) in plastic plate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">Genesse&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25-508C</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit</td>
			<td style="width:103px;">Aruna Biomedical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ABNS7013.2</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit</td>
			<td style="width:103px;">Aruna Biomedical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;hNP7013.1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32&#34; to 5/8&#34; Tube OD</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5330K22</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Multimeter</td>
			<td style="width:103px;">Keysight&#160;</td>
			<td style="width:119px;">E3641A</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Wavefoam generator</td>
			<td style="width:103px;">Keysight</td>
			<td style="width:119px;">33210A-10MHz</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Pt meshes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">298107-425MG</td>
			<td style="width:188px;">Reference electrode with dimensions, 1x1 cm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">BDNF</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Hs02718934_s1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">THBS1</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Hs00962908_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">GAPDH</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Hs02758991_g1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74106</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">QIAshredder (250)</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79656</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">RNase-Free DNase Set (50)</td>
			<td style="width:103px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 &#181;L rxns</td>
			<td style="width:103px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">1708891</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4369510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">7-8 Week Old, male, RNU Rats</td>
			<td style="width:103px;">NCI-Frederick</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">4-0 Ethicon Silk Suture</td>
			<td style="width:103px;">eSutures.com</td>
			<td style="width:119px;">683G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:103px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System</td>
			<td style="width:103px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">Surgicel Original Absorbable Hemostat</td>
			<td style="width:103px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">1952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat</td>
			<td style="width:103px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:213px;">Kimberly-Clark Professional&#160;Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">19-063-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Sterile Drape</td>
			<td style="width:103px;">Medline</td>
			<td style="width:119px;">DYNJSD1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:213px;">Thermo Scientific&#160;Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">53-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Walter Stern Scalpel Blade Series 300</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td>17-654-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4484642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">Frazier Micro Dissecting Hook</td>
			<td style="width:103px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>52-2706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrically conductive scaffold to modulate and deliver stem cells

줄기 세포 치료 치료, 흥미 진 진한 선으로 등장은 하지만 최적의 전달 방법 불분명 남아. 뇌졸중 모델에서 줄기 세포를 전달 하기 위해 수십 년 동안 microinjection의 기술을 사용 하는 동안이 기술은 주입 전에 줄기 세포를 조작 하는 능력의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 문서는 전기 전도성 폴리머 비를 사용 하 여 줄기 세포 배달에 대 한 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 전도성 고분자 비 계를 사용 하 여 줄기 세포의 전기 자극 세포 생존, 염증 반응, 및 시 냅 스 리 모델링에 관련 된 줄기 세포의 유전자를 변경 합니다. 전기 거치기 후 발판에 줄기 세포는 원심 중간 대뇌 동맥 폐색 쥐 모델에서 intracranially 이식 수 있습니다. 이 프로토콜 전도성 고분자 비 계를 통해 줄기 세포를 조작 하는 강력한 기법을 설명 하 고 추가 줄기 세포 기반 치료를 개발 하는 새로운 도구를 만듭니다.

그림 1 에 표시 된 회로도 hNPCs 및 잠재적인 다운스트림 응용 프로그램의 전기 자극의 전체 워크플로 나타냅니다. 줄기 세포 치료에서 현재 한계 줄기 세포 염증, 허 혈 성 조건 등 거친 후 이식 환경에 노출 되는 것 이다.입니다. 이러한 어려운 조건을 가능성이 그들의 치료 효능14,15제한합니다. 이 환경에서 hNPCs를 보호 하기 위해 전도성 비 계를 사용 하 여 전기 늘어진 통해 hNPCs 치료 혜택을 증가 수 있습니다. 이 줄기 세포 전달 기술에서는 첫 번째 단계는 전기 접근2,16를 사용 하 여 전도성 비 계의 개발 이다. 우리 건설 기계 생체 적합성을 특징 하 고 hNPCs와 전기 늘어진 특성에 최적화 된. 컨트롤은 unstimulated 줄기 세포 조직 배양 접시에 성장으로 정의 되었다.
다양 한 전압 전기 자극의 안전성을 확인 하 고 preconditioning 효능을 최대화 하기 위해 평가 했다. 각 챔버에 적용 된 필드는 같은 되도록 조립된 챔버의 저항 멀티 미터를 사용 하 여 측정 되었다 (챔버의 저항 (Ohm, Ω) 되었고 약 10 k ω, resistivity≈3 Ωm). 상용 공급 업체에 따라 사용 하는 hNPCs 정상적인 문화 시스템에 아무 중요 한 세포 독성을 보여왔다. hNPCs 또는 전기 자극에 노출 없이 세포 생존 능력 분석 실험으로 물 했다 (라이브: 녹색; 죽은: 레드) (그림 2). 이러한 결과 hNPCs 전기 자극 (±400 mV, 1 시간에 100 Hz) 후 가능한 되었다 나타냅니다. 세포 생존 능력 분석 실험의 유효성을 검사 하려면 우리는 세포 생존 테스트 resazurin 분석 결과 사용 하 여 수행 합니다. 결과 또한 hNPCs에 전기 자극의 더 중요 한 세포 독성을 보여 줍니다.
우리의 이전 vivo에서 데이터 시연 paracrine 요인 전기 자극에 노출 hNPCs (SD56, 미 발달 줄기 세포에서 파생 된 NPCs)에서 발표 스트로크2후 회복을 향상. 하 여 추가 발표 된 후보 요소 뇌졸중 복구에서 중요 한 것으로 알려진 hNPC (아 의치, 배아 줄기 세포에서 파생 된 NPCs), BDNF와 THBS-1 평가 했다. 이 요인 신경 파생물에 그들의 역할 때문에 광범위 하 게 연구 및 상호 작용 셀17,18에 증가. BDNF와 THBS-1 transcriptome 변화에 전기 자극의 효능을 조사, qRT-PCR GAPDH 하우스키핑 유전자로와 BDNF와 THBS-1 유전자를 포함 하 여 수행 되었다. 약 1 µ g 총 RNA의 역-제조 업체의 프로토콜에 따라 cDNA로 변하게 했다. 정규화 된 배-변경 비율 PPy에 hNPCs에 전기 자극에 노출 PPy에 hNPCs 유전자 발현을 비교 하는 ΔΔCt 방법에 의해 계산 되었다. 통계 분석 된 전기적 자극 종속 (p ≤0.01) 그룹 사이 BDNF와 THBS-1의 유전자 발현에 중요 한 upregulations를 보였다 (그림 3). 이 데이터는 최적화는 중요 한 세포 죽음 없이 hNPC 효능을 극대화 시킬 수 제안 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig1.jpg"> 그림 1 . 생체 외에서 전기 자극을 위한 전도성 고분자 비 계 시스템입니다. (A) 슬라이드 챔버 PPy 접시 위에 배치 됩니다. (B) 회로도 PPy의 표면에 도금 하는 hNPCs와 함께 체 외에 전기 자극 챔버의 제조를 보여줍니다. 흐름 밸브 슬라이드 챔버, PDMS, PPy, 그리고 금속 플레이트를 함께 사용 됩니다. (C)는 챔버의 이미지. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig2.jpg"> 그림 2 . HNPCs 또는 전기 자극 없이 세포 생존 능력 분석 결과. (A) Calcein 오전 물 라이브 셀을 보여 주는 막대 그래프. 데이터는 평균 ± 사 우 스 다코타; n = 4. (B) 세포 생존 능력 분석 결과 resazurin를 사용 하 여. 바 그래프 표시 했다 hNPCs;에 전기 자극의 아무 세포 독성 n = 4. 세포 생존 능력 분석 실험 전과 전기 자극 치료 후의 이미지를 ((C)) . 반면 빨간 신호 나타냅니다 죽은 세포 (EtHD-1) 녹색 신호 라이브 셀 (Calcein-am)을 나타냅니다. ES 전기 자극을 나타냅니다. ES + 또는-셀에 전기 자극의 존재 여부를 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig3.jpg"> 그림 3 . 전기 자극으로 유전자 표현 변경. BDNF (A) 와 THBS1의 유전자 표현에 변화를 접어 막대 그래프 보여주는 (B) hNPCs (* * p 전기 preconditioned와 모든 다른 그룹 간의 통계적 나타냅니다 < 0.01, 오류 막대 표시 사 우 스 다코타, n = 4, 일방통행 ANOVA ). 네거티브 셀 일반 조직 배양 접시에 배양 했다 컨트롤을 나타냅니다. ES + 또는-셀에 전기 자극의 존재 여부를 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

이 프로토콜 설명 줄기 세포 생체 외에서 전기 자극 및 줄기 세포 시드 비 계를 사용 하 여 후속 vivo에서 이식에 대 한 비 전도성 고분자 계에서의 시드 수 있도록 셀 문화 시스템의 제조를 최소 침 습 기법입니다.

변조 및 줄기 세포를 제공 하는 전기 전도성 비 계

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

electrically-conductive-scaffold-to-modulate-and-deliver-stem-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K 조회수.  Stanford University School of Medicine. 이 프로토콜 설명 줄기 세포 생체 외에서 전기 자극 및 줄기 세포 시드 비 계를 사용 하 여 후속 vivo에서 이식에 대 한 비 전도성 고분자 계에서의 시드 수 있도록 셀 문화 시스템의 제조를 최소 침 습 기법입니다.

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Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

전도성 잉크의 평면 및 3 차원 인쇄

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...