אנו מודים Andreasson קטי ד ר (מחלקת נוירולוגיה ו נוירולוגיות המדע, אוניברסיטת סטנפורד) לשימוש של המכונה לרביעיית-PCR. העבודה נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים K08NS098876 (ל P.M.G.) בתר של סטנפורד הספר לרפואה דין (כדי ריח רע).

כל תאי גזע והתהליכים בעלי חיים, אושרו על ידי ועדת הפיקוח מחקר תאי הגזע של סטנפורד על ידי פאנל ניהול באוניברסיטת סטנפורד על מעבדה חיה על עצמך (SCRO-616 ו APLAC-31909).
1. תחריט של זכוכית ITO
<ol><li>להכין את תחמוצת בדיל אינדיום (ITO)-שקופיות זכוכית מכוסה על ידי הנחת סוכן מיסוך בצד ואטימה של הזכוכית. הערה: מרבית הקלטות שקוף יכול לשמש כמסכה.<ol>
<li>להסיר את המסכה עודף באמצעות להב, להשאיר רק את הצורה הרצויה של העיצוב הסופי של איטו מכוסה על הזכוכית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשלב 5% (v/v) של חומצה חנקתית 45% (v/v) של HCl ב גביע זכוכית בתוך ברדס fume להכין את הפתרון תחריט.<ol>
<li>השתמש צלחת חמה, מד חום כדי להבטיח כי הטמפרטורה של תחריט הפתרון נשמר ב- 70 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מרגע שהתמיסה איכול 70 מעלות צלזיוס, למקם את השקופית רעולי פנים-ITO זכוכית בתוך תמיסת למשך 2 דקות להסיר את שכבת איטו עודף. הערה: הקלטת מיסוך מגן השכבה איטו החשיפה תמיסה חומצית.</li>
	<li>הסר את השקופית של הפתרון, לשטוף אותו עם יונים (DI) H2O.</li>
	<li>הסר בזהירות את ההתנגדות מסכת ולמדוד באמצעות multimeter על מנת להבטיח כי קריטון שנותרו ללא פגע. המפרט של חרוט באזור הרצוי צריך להיות כ 0 Ω.</li>
</ol>2. הכנת פירול פתרון
<ol><li>בבקבוק זכוכית 1000 מ ל, להמיס 70 גר' נתרן dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) ב- 600 מ"ל של DI H2O.</li>
	<li>ברגע NaDBS מחוסלת, להוסיף 14 מ"ל של פירול 0.2 מ' ו- mL 386 DI H2O הפתרון.</li>
	<li>לכסות את הפתרון עם רדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 º C.</li>
</ol>3. electroplating של Polypyrrole על זכוכית ITO
<ol><li>לחמם את הפתרון פירול לטמפרטורת החדר עד NaDBS הוא redissolved באופן מלא. הערה: זה לוקח בערך 15-20 דקות.</li>
	<li>שופכים 25 מ של הפתרון פירול לתוך גביע.</li>
	<li>להתחבר הזכוכית איטו חרוט multimeter ויציפו את השקופית לתוך הפתרון פירול.<ol>
<li>ודא כי הצד בהתנגדות Ω 0 פונה לכיוון האלקטרודה הפניה רשת פלטינה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>החל זרם חשמלי ליזום electroplating של PPy על פני השטח איטו באמצעות של multimeter (שוטף נשלטת על אמא/ס מ 32 למשך 4 שעות).</li>
	<li>הסר את הזכוכית איטו multimeter ואת כביסה electroplated-PPy DI H2O כדי להסיר שאריות חומרים פעילי שטח.</li>
	<li>ניתוק בעדינות את הצלחת electroplated PPy מהזכוכית איטו באמצעות סכין גילוח.<ol>
<li>אחסן את הצלחת PPy בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנת Polydimethylsiloxane (PDMS)
<ol><li>בעזרת מרית וקערית שוקלים, לערבב 18 גרם של סוכן הבסיס עם דור 2 של ריפוי סוכן, שופכים את התערובת לתוך תבניות זכוכית שני 10 ס"מ 8 ס"מ.</li>
	<li>הסר את הבועות התבניות באמצעות תא ואקום במשך 15-20 דקות.</li>
	<li>מניחים את התבניות בתנור 70 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.</li>
	<li>לאחר מקורר, להשתמש במרית שטוחה כדי להסיר את PDMS מן התבניות.</li>
</ol>5. ייצור לשכת גירוי חשמלי במבחנה
<ol><li>אוטוקלב לוחות מתכת (WxL, 2.5 ס"מ x 12.5 ס"מ) ואת זרימת שסתומים ב 120 מעלות צלזיוס במשך שעה.</li>
	<li>באמצעות שקופית קאמרית כתבנית, לחתוך שתי חתיכות של PDMS. הערה: חתיכה אחת של PDMS משמש להיקף של התא לתא עם מגזרות של שני ריבועים צמודים מ בתוך תא התא. החלק השני PDMS היא חלוקה של השטח של התא.<ol>
<li>לחתוך החוצה הבתוך תא קאמרית כך שהוא מרובע בצורת ומתאימה את הצורה של התא לתא. ודא כי הצורה הכללית של שני החלקים של PDMS הוא מלבני המתאים של השקופית קאמרית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שכבה של החומרים כמו הבאות מלמטה למעלה: (1), לוחית מתכת (2) PDMS (ללא עמלות), (3) PPy צלחת (בניצב PDMS), (4) PDMS (עם מגזרות), ו- (5) תא קאמרית.</li>
	<li>תהדק את המנגנון ביחד ברגע שיהיה מיושר לגמרי.</li>
	<li>לחתוך שתי פיסות 60 ס מ של חוט מתכת ולהשתמש הדבק כסף לחבר חוט אחד בכל קצה של צלחת PPy המגיחה מתוך החלק החיצוני של החדר. ודא החוטים מספיק זמן כדי להאריך מן המנגנון אל מחוץ אינקובטור.</li>
	<li>לאחר ההדבקה כסף הוא נרפא, לחזק, לאטום את החיבור חוט עם אפוקסי.<ol>
<li>להקליט את ההתנגדות משתמש multimeter כדי לוודא כי השדה יישומית הוא זהה בכל אחד.</li>
		<li>להשתלה, להסיר את החוטים; unclamp התאים תא, PDMS, ולאחר מכן אותם להפריד לגרדום מוליך. המימד של פיגומים מושתל הוא בערך 1 מ מ x 3 מ"מ x 0.25 מ"מ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ציפוי האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) ב- PPy
<ol><li>לעקר את התאים מורכבים תחת אור UV למשך שעתיים.<ol>
<li>לאחר שעה אחת, לסובב את שהורכב צ'יימברס 90°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר עיקור, מעיל השטח של PPy בחלק התחתון של החדר עם 800 µL של מצע ציפוי ולאפשר את המצע שבמהלכו בצלחת PPy בתוך אינקובטור ב 37 ° C-5% CO2 לשעה.</li>
	<li>לאחר שעה אחת, הסר את תגובת שיקוע של צ'יימברס, לשטוף בעדינות עם 1 מ"ל של DPBS + Ca + Mg לכל טוב. הערה: להימנע לשטוף את פני השטח של PPy בכוח כמו זה יגרום להתנתקות המצע ציפוי.</li>
	<li>באמצעות מדיה תא טריים, מכנית מביצועם בתרבית תאים לשימוש עם התאים מצלחת תרביות רקמה עם pipetting עדין. הערה: תאים צריך להיות 90-100% confluent על דיסוציאציה.</li>
	<li>לאסוף את כדורי hNPC באמצעות צנטריפוגה ב 8000 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>שימוש של hemocytometer, לספור, resuspend את התאים בווליום של תאים/ס מ 100,0002.</li>
	<li>צלחת 100,000 התאים לתא בכל טוב (100,000 תאים/cm2 ב 1 מ"ל של מדיה).</li>
	<li>לחזור צ'יימברס חממה-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2-
</li>
</ol>7. גירוי חשמלי של hNPCs
<ol><li>יום אחד לאחר זריעה התאים על התאים, השתמש מחולל גל כדי להחיל גירוי חשמלי לתאים.</li>
	<li>לפני גירוי, להסיר מדיה זקן אחד טוב, לחדש עם 800 µL של התקשורת טריים.</li>
	<li>לאחר שינוי בתקשורת, במקום התאים בחזרה לתוך החממה, להרחיב את החוטים מתוך החממה, לצרף אותם גנרטור גל</li>
	<li>להחיל את הגירוי התאים עם אות גל מרובע ב mV ±400 עם 100 הרץ לשעה.</li>
	<li>לאחר הגירוי, להסיר את החוטים, תקופת דגירה של התא להוצאה של עוד יום בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>לבצע לאחר מכן ניתוח הביולוגי כולל הכדאיות התא, כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) ע פ הפרוטוקול של היצרן.</li>
</ol>8. in Vivo PPy השרשה
<ol><li>מבצע דיסטלי עורק המוח התיכון (dMCA) סגר קו הדגמים תא T לקויה למבוגרים זכר עירום חולדות (NIH-RNU 230 ± 30 g) כפי שתוארה קודם לכן2. ביצוע ההשתלה שבוע אחד פוסט-dMCA סגר.</li>
	<li>יום אחד לפני הניתוח, לתת אמפיצילין (1 מ"ג/מ"ל) לעכברושים במים הכלוב שלהם.</li>
	<li>עזים ומתנגד העכברוש באמצעות לשכת אינדוקציה 0.5 - 3% מ"ג/ק"ג של איזופלוריין מנוהל באמצעות אינהלציה.</li>
	<li>לאשר ההרדמה של העכברוש על ידי חוסר תגובת רפלקס של קמצוץ הבוהן.<ol>
<li>בעוד החיה תחת הרדמה, להמשיך לפקח שלה ממברנה צבע דפוס הנשימה, טמפרטורה רקטלית כל 15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר ההרדמה הוא אישר, החל דמעות מלאכותיות על עיני עכברוש למניעת יובש.</li>
	<li>ודא כי הטכניקה aseptic תישמר במהלך הליך זה על-ידי שימוש בכפפות סטריליות, מאסו כירורגי סטרילי13. לשמור על כלי כירורגי סטרילי בתוך שדה סטרילי.</li>
	<li>בעוד העכברוש הוא בהרדמה, תרגיל של craniectomy מעל קליפת המוח השמאלי. פתח את השכבה הקשה של המוח.<ol>
<li>הסר את הדורה המוח באמצעות מחט דק מיקרו כירורגי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שתל פיגומים מוליך ממערכת במבחנה על גבי קליפת חולדה. הערה: לניסויים שלנו, אנחנו מושתלים פיגומים מיום במבחנה 3 לאחר ציפוי hNPC.<ol>
<li>למקם את השתל בעיקר על קליפת penumbral המדיאלי כדי הנגע שבץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר לגרדום מושם, הצב surgicel מעל השתל כדי למנוע תנועה עם העור סגירה.</li>
	<li>לתפור הפצע סגור, subcutaneously להחדיר את החולדות. הבופרנורפין SR במינון של 1 מ ג/ק ג כדי לנהל את הכאב קשור dMCA סגר ובבית stereotaxic.</li>
	<li>מקום העכברוש בכלוב שחזור זה להכרתו.<ol>
<li>לעולם לא תעזוב את החיה ללא התערבות כשהוא מחוסר הכרה.</li>
		<li>אין למקם את החיה עם אחרים עד מלא זכה להכרה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יפקח חיות מדי יום עבור סימנים של כאב כולל ירידה במשקל הגוף, צריכת מזון ירידה/מים, המעיל פרוע/לטפח מופחתת, ירד/מוגברת פעילות ספונטנית, יציבה נורמלית, התייבשות/עור להקים אוהל, עיניים שקועות, מסתור, השחתה עצמית נשימה מהירה נשימה בפה פתוח, מתעוות, רועדת, רעד, הניקוד.<ol>
<li>לנטר את החיות מדי יום עד שיופיע כי הם לאכול, לשתות, טיפוח, לעלות במשקל; ואז שבועי לאחר עלייה במשקל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanization מוקדמת דרך שאיפת2 CO ואישור משני euthanization (על מנת להבטיח את החיה לא ישוב כתוצאה מהשאיפה של2 CO פוסט של חמצן נורמלית האספקה) יחולו כל חיה שמופיע כדי לא לאכול, לשתות, לעלות במשקל לאחר ההליך הכירורגי הראשוני; מופיע כאב; או מופיעה אפשרות להשלים את הבדיקות התנהגותיות עקב גדול יותר מאשר צפוי גירעון של קורטקס מוטורי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Science+of+Stroke:+Mechanisms+in+Search+of+Treatments.">The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li><li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Preconditioning+of+Stem+Cells+with+a+Conductive+Polymer+Scaffold+Enhances+Stroke+Recovery.">Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery.</a> Biomaterials. 142, 31-40 (2017).</li><li>Steinberg, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+of+Transplanted+Modified+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Stroke:+A+Phase+1/2a+Study.">Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study.</a> Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).</li><li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Stroke+Therapeutics:+Unraveling+Stroke+Pathophysiology+and+Its+Impact+on+Clinical+Treatments.">Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li><li>Schabitz, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Enhances+Poststroke+Sensorimotor+Recovery+and+Stimulates+Neurogenesis.">Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis.</a> Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).</li><li>Liauw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+1+and+2+Are+Necessary+For+Synaptic+Plasticity+and+Functional+Recovery+After+Stroke.">Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).</li><li>Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Encapsulating+Biomaterial+Regulates+Mesenchymal+Stromal/Stem+Cell+Differentiation+and+Macrophage+Immunophenotype.">Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).</li><li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+Tunable+Stress+Relaxation+Regulate+Stem+Cell+Fate+and+Activity.">Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li><li>Ballios, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Hyaluronan-Based+Injectable+Hydrogel+Improves+the+Survival+and+Integration+of+Stem+Cell+Progeny+following+Transplantation.">A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).</li><li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+Injured+Spinal+Cord+by+Transplantation+of+Neural+Stem+Cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel.">Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li><li>Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implant+Biomaterials:+A+Comprehensive+Review.">Implant Biomaterials: A Comprehensive Review.</a> World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).</li><li>Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Stimulation+Elicits+Neural+Stem+Cells+Activation:+New+Perspectives+in+CNS+Repair.">Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair.</a> Front Hum Neurosci. 9, (2015).</li><li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon.">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Abdelwahid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Death+and+Survival+in+Heart+Regeneration+and+Repair.">Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair.</a> Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinical+Status+of+Stem+Cell+Therapy+for+Ischemic+Cardiomyopathy.">The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li><li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+Biocompatibility+of+Polypyrrole+Implants+Suitable+for+Neural+Prosthetics.">Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics.</a> Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).</li><li>Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Induces+Proliferation+of+Human+Airway+Smooth+Muscle+Cells.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells.</a> J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).</li><li>Lopes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+2+Regulates+Cell+Proliferation+Induced+by+Rac1+Redox-Dependent+Signaling.">Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).</li><li>Ploughman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Contributes+to+Recovery+of+Skilled+Reaching+After+Focal+Ischemia+in+Rats.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats.</a> Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).</li><li>Baker, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Neural+Stem+Cell+Therapy+Enhances+Recovery+in+an+Ischemic+Stroke+Pig+Model.">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model.</a> Sci Rep. 7 (1), 10075 (2017).</li><li>Bacigaluppi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Transplantation+Induces+Stroke+Recovery+by+Upregulating+Glutamate+Transporter+GLT-1+in+Astrocytes.">Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להצהיר עם עבודה זו.

גדל ראיות הוכיחה את ההבטחה של תאי גזע כטיפול קו הרומן. הבטחה זו הובילה מאמץ גדול כדי להתקדם תאי גזע הרפוי המיטה לפחות 40 הניסויים הקליניים מתמשכים או שהושלמו. קו פתולוגיה מציע הפרעה נוירולוגית ייחודי זה הוא משאיל את עצמו טיפול בתאי גזע כי לאחר העלבון חריפה, שום תהליך ניווניות מניעת שחזור. המנגנון המדויק של התאוששות משופרת תאי גזע שבץ עדיין לא ברור. אנגיוגנזה, synaptogenesis וסינפטית שיפוץ כל הוכחו להיות חשוב. כאשר מולקולות חשוב עבור סינפסה היווצרות כגון BDNF ו- THBS-1 אינן מוסרות, קו שחזור הוא לקוי6,19. hNPCs השתפרו שחזור פונקציונלי לאחר שבץ בבעלי חיים רבים20,21. המנגנון של hNPCs אפקט שרידים לא הבנתי, שיטת המשלוח אידיאלי עבור תאים אלה אינו ידוע. על ידי פיתוח מערכת המאפשר אחד כדי לתפעל מולקולות חשוב שוחררה מבית hNPCs, אחד יכול לעזור להבדיל את מנגנוני התאוששות אינטגרלי ולמטב את טיפול בתאי גזע.
תא מוצלחת משלוח אל המוח נשאר אתגר. כיום, מספר טכנולוגיות אלו פותחו מערכות פיגומים biomaterial שונים לספק בתאי גזע כדי לשפר את ההישרדות ושילוב של תאי גזע9,10. עם זאת, בשל המאפיינים אינרטי של חומרים אלה, קשה לווסת את תאי הגזע לאחר ההשתלה שלהם.
מאמר זה מתאר שיטה באמצעות לפיגום PPy חשמלית לתפעל את transcriptome של hNPCs, כפי שמוצג על ידי קולטנים upregulation של BDNF ו- THBS-1 בהנתונים שלנו לרביעיית-PCR. המחקר הקודם שלנו גילה כי עלייה בביטוי VEGFA על hNPCs, לאחר חשיפה גירוי חשמלי פונקציונלי שחזור משופר לאחר קו2. כאן אנחנו מדגימים שאת neurotrophic נוספים גורמים כגון BDNF ו- THBS-1 גם מאופנן לאחר חשיפה גירוי חשמלי בקו תא hNPC שונים, מראה כי המערכת שלנו יכולה לשמש עם שורות תאים רבים.
במהלך ייצור לשכת גירוי חשמלי במבחנה , חיוני כי החוט מתכת לגמרי מחובר לצלחת PPy באמצעות כסף צבע אפוקסי. אם חיבור זה הוא לא קול, היא גורמת שדות חשמליים שונים אפילו עם אותם פרמטרים. יתר על כן, לעיתים התקשורת עלול לדלוף לאחר ההרכבה של מערכת פיגומים. כדי לפתור בעיה זו, ניתן להחיל משחה ואקום כדי לאטום את הרווח בין את PDMS ואת PPy לצלחת עם טיפול לא תחול פני זורעות תא. מגבלה אחת בשל אופיו שאינם שקופים של צלחת PPy הוא בדיקת confluency של תאים עם מיקרוסקופ אור רגיל הוא מוגבל.
היתרון של השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה מאפשר אפנון של hNPCs כדי לקבוע את השינויים מכניסטית של התאים. כיום, אפנון חשמל לא היה פנה באמצעות הידרוג קונבנציונאלי או מערכות פיגומים אינרטי. לאחר גירוי חשמלי באמצעות לגרדום PPy, hNPCs יכולים להינתן ללא הסרת מהמשטח פולימר למודל ויוו . פיתוח שיטות ללמוד עוד דגמים מחלה של תאי גזע יישומים מאפשר לנו עיצוב טוב יותר translational יישומים. הגישה preconditioning חשמל, מתאפשרת על ידי מערכת פולימר מוליך, שניתן להחיל על סוגי תאים שונים ומאפשר הבנה טובה יותר של ההשפעה של גירוי חשמלי על תא. היכולת לייעל את תאי במבחנה , אז בלי עוד מניפולציה (כגון passaging או הסרת) מאפשר בדיקה של אלה מניפולציות במבחנה בויוו מצבי מחלה כגון שבץ מוחי. המטרה היא לנצל את טכניקות חדשות, כגון לגרדום פולימר מוליך המתואר, כדי לקדם קו הרפוי ולשפר את ההבנה של מנגנונים שחזור שבץ.

שבץ מוחי הוא הסיבה המובילה השניה של מוות בעולם, הגורם המוביל החמישי המוות בארצות הברית. למרות אלה שיעורי התמותה גבוהים, טיפולים להחלמה שבץ נותרו כיום אתגר עם אפשרויות רפואי קיימא זמין כעת1. כרגע יש כ 300 ניסויים קליניים העוסקים שבץ איסכמי, מהם 40 רק לנצל את תאי גזע. מחקרים קודמים הראו כי תאי הגזע טיפולים יש השפעה מיטיבה על קו-תיקון-2,-3. גורמים Paracrine כמו neurotrophic המוח-derived factor (BDNF) ו- thrombospondin-1 (THBS-1) שוחררו המושתלים האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) הראו התאוששות פונקציונליות משופרת באמצעות מנגנונים הקשורים עם עלייה סינפסה היווצרות, אנגיוגנזה, מסעף דנדריטים, תחזיות עצב חדשים, כמו גם הכוח ויסות מערכת החיסון4,5,6. עם זאת, השיטות אספקה אופטימלים של תאי גזע נשארים חמקמקים.
משלוח מוצלח בתאי גזע המוח נשאר אתגר. כיום, הידרוג להזרקה ומערכות פיגומים פולימריים הוכנסו להעביר תאי גזע. שיטות משלוח אלה להגן על תאי גזע במהלך ההשתלה, כמו גם להציע הגנה מפני הקשים שלאחר שבץ כולל תגובה דלקתית של המחשב המארח, תנאים ובשפתיים-7,-8,-9 , 10. עם זאת, החומרים הנפוצים הם ללא ניע, אשר מגביל את השימוש אפנון רציפה (קרי, גירוי חשמלי) של תאים11. גירוי חשמלי הוא רמז המשפיע בידול, יון ערוץ צפיפות ו- neurite המוצלח תאי גזע12. לעומת פולימרים אינרטי, פולימרים מוליכים יכול לשאת הנוכחי המאפשר גירוי חשמלי ומניפולציה של תאי גזע2. עם זאת, המנגנון המדויק שבו גירוי חשמלי ממיקרו neurotrophic גורם לשחרור (קרי, BDNF ו- THBS-1) הוא חקר עדיין לא לגמרי.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים כדי לבנות מערכת התרבות התא המורכב לפיגום פולימר מוליך, polypyrrole (PPy), המאפשר במבחנה גירוי חשמלי. בשל האופן שבו מערכת התרבות התא הוא מפוברק, אפשרי בהמשך השרשת לגרדום נזרע תאי גזע על גבי קליפת פרי-לאוטם. למערכת זו, אנחנו חשמלית כתנאי תאי גזע על הגרדום פרק זמן קצר לפני ההשתלה. בעקבות גירוי חשמלי, לגרדום פולימר מוליך נושא את התאים בהצלחה קטנטנים intracranially באמצעות שיטת פולשנית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="623">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">FGF-Basic</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">CTP0261</td>
			<td style="width:188px;">20 ng/mL for working media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Matrigel</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">cb40234a</td>
			<td style="width:188px;">1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">LIF Protein, Recom. Hum. (10 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:103px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">LIF1010</td>
			<td style="width:188px;">10 ng/mL for working media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Sylgard 184 silicone 3.9 kg</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA56-4</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA95</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">ITO Glass</td>
			<td style="width:103px;">Delta Technologies</td>
			<td style="width:119px;">CG-40IN-0115</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Sodium dodecylbenzenesulfonate</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">289957-1KG</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Pyrrole</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">131709-500ML</td>
			<td style="width:188px;">Protect pyrrole solution from light and room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">8 well glass slide chambers</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Sci Nuc&#160;</td>
			<td style="width:119px;">125658</td>
			<td style="width:188px;">Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Flat-Surface Bracket, 3&#34;x1&#34;</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1030A4</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">TWO PART SILVER PAINT 14G</td>
			<td style="width:103px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1264214</td>
			<td style="width:188px;">Mix two parts (1:1) in plastic plate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">Genesse&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25-508C</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit</td>
			<td style="width:103px;">Aruna Biomedical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ABNS7013.2</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit</td>
			<td style="width:103px;">Aruna Biomedical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;hNP7013.1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32&#34; to 5/8&#34; Tube OD</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5330K22</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Multimeter</td>
			<td style="width:103px;">Keysight&#160;</td>
			<td style="width:119px;">E3641A</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Wavefoam generator</td>
			<td style="width:103px;">Keysight</td>
			<td style="width:119px;">33210A-10MHz</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Pt meshes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">298107-425MG</td>
			<td style="width:188px;">Reference electrode with dimensions, 1x1 cm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">BDNF</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Hs02718934_s1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">THBS1</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Hs00962908_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">GAPDH</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Hs02758991_g1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74106</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">QIAshredder (250)</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79656</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">RNase-Free DNase Set (50)</td>
			<td style="width:103px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 &#181;L rxns</td>
			<td style="width:103px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">1708891</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4369510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">7-8 Week Old, male, RNU Rats</td>
			<td style="width:103px;">NCI-Frederick</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">4-0 Ethicon Silk Suture</td>
			<td style="width:103px;">eSutures.com</td>
			<td style="width:119px;">683G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:103px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System</td>
			<td style="width:103px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">Surgicel Original Absorbable Hemostat</td>
			<td style="width:103px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">1952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat</td>
			<td style="width:103px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:213px;">Kimberly-Clark Professional&#160;Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">19-063-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Sterile Drape</td>
			<td style="width:103px;">Medline</td>
			<td style="width:119px;">DYNJSD1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:213px;">Thermo Scientific&#160;Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">53-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Walter Stern Scalpel Blade Series 300</td>
			<td style="width:103px;">Fisherbrand</td>
			<td>17-654-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:213px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4484642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:213px;">Frazier Micro Dissecting Hook</td>
			<td style="width:103px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>52-2706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrically conductive scaffold to modulate and deliver stem cells

טיפול בתאי גזע התפתחה משיכת מרגש טיפולית, אך שיטת אספקה אופטימלים נשאר לא ברור. בעוד בטכניקה של microinjection שימש במשך עשרות שנים כדי לספק תאי גזע במודלים שבץ, טכניקה זו מוגבל על ידי חוסר היכולת לתפעל את תאי הגזע לפני ההזרקה. מאמר זה מפרט שיטה של שימוש בפיגומים פולימר מוליך חשמלי של תאי גזע למסירה. גירוי חשמלי של תאי גזע באמצעות לפיגום פולימר מוליך הפיצולים של התא גזע גנים המעורבים ב הישרדות cell, תגובה דלקתית ו שיפוץ סינפטית. לאחר preconditioning חשמליים, תאי גזע על הגרדום מושתלים intracranially במודל חולדה סגר דיסטלי עורק המוח התיכון. פרוטוקול זה מתאר טכניקה חזקה לתמרן תאי גזע דרך לפיגום פולימר מוליך ויוצר כלי חדש כדי להמשיך ולפתחו טיפול המבוסס על תאי גזע.

התרשים המוצג באיור 1 מייצג את זרימת העבודה הכוללת של גירוי חשמלי של hNPCs והיישומים פוטנציאלית במורד הזרם. מגבלה הנוכחי של טיפול בתאי גזע הוא כי תאי גזע נחשפים סביבת שלאחר השתלת קשים כולל דלקת ותנאים איסכמי. אלה התנאים הקשים סביר להגביל את היעילות הטיפולית14,15. השימוש לפיגום מוליך על hNPCs מפני סביבה זו עשוי להגדיל את היתרונות הטיפוליים hNPCs דרך preconditioning חשמל. הצעד הראשון בטכניקה זו מסירה תאי גזע הוא התפתחות לפיגום מוליך באמצעות מטוס2,אלקטרוליטי הגישה16. אנו שאפיינה את הביו פיגומים, אופטימיזציה המאפיינים החשמליים preconditioning עם hNPCs. פקדים הוגדרו unstimulated תאי גזע גדל על צלחת תרביות רקמה.
המתחים השונים הוערכו כדי לקבוע את הבטיחות של גירוי חשמלי וכדי למקסם את היעילות preconditioning. כדי להבטיח כי השדה יישומית תהיה זהה בכל אחד, resistivity לשכת שהורכב נמדדה באמצעות multimeter (התנגדויות (אוהם, Ω) של צ'יימברס היו כ 10 kΩ, resistivity≈3 Ωm). לפי הספק מסחרי, הראו hNPCs בשימוש אין cytotoxicity משמעותי במערכות תרבות נורמלי. hNPCs עם או בלי חשיפה גירוי חשמלי היו מוכתמים תא הכדאיות מבחני (Live: ירוקים; המתים: אדום) (איור 2). תוצאות אלו מצביעות על כי hNPCs היו קיימא לאחר גירוי חשמלי (mV ±400, 100 הרץ לשעה). לאימות וזמינותו הכדאיות תא, ביצענו תא הכדאיות בדיקת שימוש assay resazurin. התוצאות גם להוכיח אין cytotoxicity משמעותית של גירוי חשמלי ב- hNPCs.
הנתונים שלנו אין ויוו הקודמים הוכיח כי גורמים paracrine שוחררה מבית hNPCs (SD56, NPCs שמקורם בתאי גזע עובריים) עם חשיפה גירוי חשמלי לשפר את ההתאוששות לאחר קו2. כדי לחקור יותר גורמים המועמד ידוע להיות חשוב בהחלמה שבץ משתחררים מן hNPC (ביו ארונה, NPCs שמקורם בתאי גזע עובריים), הוערכו BDNF ו- THBS-1. גורמים אלה נחקרו בהרחבה בשל התפקיד שמילאו תוצר עצביים ולהגדיל -לתא אינטראקציות17,18. כדי לחקור את היעילות של גירוי חשמלי על שינויים transcriptome BDNF ו- THBS-1, לרביעיית-PCR בוצעה כולל גנים BDNF ו- THBS-1 עם GAPDH כמו גן משק בית. µG כ 1 של RNA הכולל היה הפוך-עיבד לתוך cDNA לפי הפרוטוקול של היצרן. קיפול מנורמל-שינוי יחס חושבו בשיטה ΔΔCt השוואה בין גנים hNPCs על PPy, hNPCs על PPy עם חשיפה גירוי חשמלי. ניתוח סטטיסטי הראה upregulations משמעותית בביטוי הגנים של BDNF ו- THBS-1 בין קבוצות שהיו חשמלית גירוי מותנה (p ≤0.01) (איור 3). נתונים אלה עולה שאופטימיזציה אפשרית למקסם את יעילות hNPC ללא מוות בתא משמעותיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig1.jpg"> איור 1 . במבחנה פולימר מוליך מערכת לגרדום סטימולציה חשמלית. (א) תא שקופית מונחת על גבי צלחת PPy. (B) התרשים מראה הזיוף של התא גירוי חשמלי במבחנה עם hNPCs מצופה על פני השטח של PPy. זרימה שסתומים משמשים כדי להחזיק את התא שקופיות, PDMS, PPy, מתכת צלחת ביחד. (ג) תמונה של החדר. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig2.jpg"> איור 2 . תא assay הכדאיות ב hNPCs עם או בלי גירוי חשמלי. (א) גרף הממחיש תא חי מוכתם Calcein-am. נתונים שהוצגו הם זאת אומרת ± ש; n = 4. (B) התא assay הכדאיות באמצעות resazurin. גרף מציגה שהיה לא cytotoxicity של גירוי חשמלי-hNPCs; n = 4. (ג) תמונות של תא הכדאיות assay לפני ואחרי טיפול גירוי חשמלי. אות ירוק מציין תאים חיים (Calcein-am), ואילו האות אדום מציין תאים מתים (EtHD-1). ES מצביע על גירוי חשמלי. ES + או - מצביע על נוכחות או היעדרות של גירוי חשמלי על תאים. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig3.jpg"> איור 3 . שינויים בביטוי הגנים עם גירוי חשמלי- גרף הממחיש מקפלים שינויים ג'ין ביטויים של BDNF (א) ו- THBS1 (B) hNPCs (* * מציין משמעותי סטטיסטית בין חשמלית preconditioned וכל שאר הקבוצות, p < 0.01, שגיאה ברים הצג ש; n = 4, חד-כיווני אנובה ). שלילי מציין את הפקד שבו התאים היו תרבותי על צלחת רגילה תרביות רקמה. ES + או - מצביע על נוכחות או היעדרות של גירוי חשמלי על תאים. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells at JoVE.com

Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות מרדית

מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

electrically-conductive-scaffold-to-modulate-and-deliver-stem-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K Views.  Stanford University School of Medicine. פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות מרדית

Video: Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Microdissection של מקטעי רקמת הכליה העיקרי, התאגדות עם טכנולוגיית הרומן לבנות בפיגומים-חופשית

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...