이 작품 연구 간 질 (부여 번호 35489);에 대 한 미국 시민에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회 (부여 번호 R01NS100954, R01NS099188); 루이지애나 주립 대학 건강 과학 센터 말 콤 Feist 박사 화목 하 고.

<ol>
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저자는 공개 없다.

유물에서 무료로 고품질 EEG ECG 녹음을 얻기 위해 모든 예방 조치는 저하 또는 이식된 전극과 와이어의 풀림을 방지 하기 위해 취해야 한다. 뇌 파 머리 이식 되 느슨한, 두뇌와 와이어 접촉 감소 신호 진폭을 선도 저하 됩니다. 느슨한 임 플 란 트 또는 가난한 와이어 연락처 운동 유물과 배경 잡음 기록에 소개 전기 신호의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 머리 이식의 잠재적인 완화 방지, 최대한의 강도와 접착 되도록 두 피 절 개를 닫을 때 플 기지 주변 치과 시멘트의 관대 한 금액을 적용. 한다 또한 주의 두개골에서 모피의 완전 한 제거를 보장, 모피 나머지는 임 플 란 트 주위 붓기를 선도 하 고 조기 수술 후 염증을 일으킬 수 있기 때문 임 플 란 트 분리. 시간이 지남에, 머리 이식 반복 연결 및 동물의 분리와 관련 된 스트레스로 인해 완화 가능성이 있다. 따라서, 만약에 가능 하다 면, 동물 여러 짧은 기간 기록 보다는 오히려 단일 오랜 기간 녹음을 수행 하 여 연결/분리는 횟수를 최소화 하려고 합니다. Postsurgical 임 플 란 트 피해와 후속 동물 상해의 또 다른 잠재적인 소스는 임 플 란 트와 동물의 홈 장에 wiretop 사이 신체 접촉 이다. Wiretops, 음식에 대 한 필요성을 제거 하기 위해 펠 릿 및 보습 젤 케이지 바닥에 배치할 수 있습니다. 마지막으로, ECG 리드의 무결성을 유지 하기 위해 동물의 처리 한다 최소화, 특히 ECG 전선을 실행 하는 신체의 측면을 따라.
또한 임 플 란 트 또는 와이어 연락처의 저하, 테더 녹음 구성의 또 다른 잠재적인 합병증 신호 손실에 지도 하는 실험 동안 (즉, 분리 또는 없었다) 분리 되는 동물의 가능성입니다. 분리 실행 하 고 수신 거부와 함께 심한 경련 발작을 경험 하는 마우스에 대 한 특히 성가신 될 수 있습니다. 분리 되 고 마우스의 가능성을 최소화 하기 위해 철사 밧줄에 여유의 크기를 최적화 합니다. 최고의 와이어 길이 일반적으로 분리를 홍보할 수 있는 와이어에 감 금 소의 모든 모서리를 탐구 하는 동물에 대 한 충분 한 여유 있지만 하지 거의 하지 않습니다 필요한 긴장을 제공 사이의 균형. 최적의 와이어 길이 결정 하는데, 확인 하지 않습니다 많은 마우스 경우 와이어 깨졌습니다 신호 손실에 지도할 수 있는 와이어에 씹는 쉽게 수 있습니다 느슨하게. 전극 nanoconnector를 사용 하 여 임 플 란 트와 적어도 10-전선 (즉, 10-핀/소켓 쌍)은 또한 10-와이어 더 자주 분리 하는 경향이 보다 적은 비용으로 nanoconnectors로 테더 링된 연결에 여분의 안정성을 제공 하는 것이 중요. 분리 되는 동물의 가능성을 더 줄이기 위해이 프로토콜 녹음 실 위의 정지 저 토크 정류에 마우스의 머리에서 전선을 연결 하 여 쉽게 수정할 수 있습니다. 정류 회전 마우스 이동 마우스 뽑기에서 방지 와이어에 비틀림 긴장의 형성을 완화 하 여 작동 합니다.
이 속박 되 비디오-뇌 파-ECG 프로토콜의 주요 힘은 추가 응용 프로그램에 대 한 메서드를 수정 하는 기능 이다. 여기서 설명 하는 대로 사용 가능한 10 전극 와이어의 유일한 6 활용 됩니다. 그러나, 나머지 4 개의 와이어 두뇌 활동의 더 나은 공간적 해상도 제공 하는 추가 4 뇌 파 리드 이식도 수 있습니다. 또는, 사용 하지 않은 전선의 두 기록 치십시오 (EMG), 뇌 파와 함께에서 슬립/웨이크 상태를 결정 하기 위한 중요 한 근육 활동의 측정을 제공 하는 목의 근육에 봉합 될 수 있습니다. 또 다른 가능한 수정 철사 밧줄에 맞게 수정 된 전체-몸 plethysmography 챔버에 동물을 기록 하는 것입니다. plethysmography, 영감과 관련 된 작은 압력 변화 하 고 만료 호흡기 파형으로 변환 됩니다. 따라서, 통합 하 여 plethysmography, 그것은 기술적으로 비디오의 동시 녹화 가능 뇌 파, 심전도, 근 전도, 및 호흡, 행동 및 뇌, 심장, 근육, 및 폐 활동의 판독을 나타내는 것 이다. 이러한 포괄적인 vivo에서 생리 녹음은 원격에서 사실상 불가능 하지 않습니다 밧줄된 접근을 만드는 오늘날의 시스템 설명 여기 쥐에서 여러 biosignals의 동시 심문을 위해 특히 강력한 도구.

Electroencephalography (뇌 파)와 심전도 (ECG)는 각각 vivo에서 뇌와 심장 기능을 평가 하기 위한 강력 하 고 널리 사용 되는 기법. 뇌 파 전극을 두 피1에 연결 하 여 전기 두뇌 활동의 기록 이다. 비-침략 적 뇌 파를 기록 하는 신호 전압 변동을 summated 흥분 성의 억제 postsynaptic 잠재력 주로 대뇌 피 질의 각 추 모양 신경1,2에 의해 생성 된에서 발생 하는 나타냅니다. 뇌 파를 평가 하 고 간 질3,4환자 관리에 대 한 가장 일반적인 neurodiagnostic 테스트입니다. 간 질 발작 부재 발작 등 비 경련 상태 epilepticus5,6명백한 경련 행동 발현 없이 발생 하는 경우 특히 유용 합니다. 반대로, 비 간 질 관련 경련 에피소드 나 의식의 손실에 지도 하는 조건 없이 비디오-뇌 파 모니터링7간 질 발작으로 오진 될 수 있습니다. 간 질 분야에서의 유용성 뿐만 아니라 뇌 파는 또한 널리 이용 관련 된 수 면 장애, encephalopathies, 및 메모리 장애, 비정상적인 두뇌 활동을 감지 하로 수술2 중 전신 마 취를 보완 하기 위해 , 8 , 9.
뇌 파, 심전도 달리 (또는 그것으로 심전도 때때로 약식)10심장 전기 활동의 기록 이다. ECGs 사지 사지와 가슴 벽, 수축과 이완10,11의 각 심장 주기 동안 심근에 의해 생성 된 전압 변화의 감지 수 있는 전극을 연결 하 여 일반적으로 수행 됩니다. P 파, 복잡 한 QRS 및 T 파, 도발은 심 방, 심 실 도발은, 및 심 실 repolarization, 각각10, 에 해당 하는 ECG 파형의 기본 구성 정상 심장 주기 포함 11. 정기적으로 심장 부정맥 및 심장 전도 시스템12의 결함을 식별 하는 ECG 모니터링. 간 질 환자 중, ECG를 사용 하 여 잠재적으로 생명을 위협 하는 부정맥을 식별의 중요성은 증폭 된다 이후 그들은 갑자기 심장 마비, 간 질13, 갑자기 예기치 않은 죽음의 위험이 크게 증가 , 1415.
그들의 임상 응용 프로그램 뿐만 아니라 뇌 파 및 심전도 기록의 질병 마우스 모델에서 뇌와 심장 기능 장애를 식별 하는 데 필수적인 도구 되고있다. 전통적으로 이러한 기록을 별도로 수행 되었습니다, 하지만 여기 우리가 쥐에 동시에 기록 비디오, 뇌 파, 심전도를 기술 설명. 여기 상세한 동시 비디오-뇌 파-ECG 메서드는 마우스의 머리에 이식된 전극은 녹음 장비에 유선 테더 녹음 구성을 활용 합니다. 역사적으로,이 곁에, 또는 유선, 구성 표준 되었으며 가장 광범위 하 게 사용 하는 방법 쥐; 뇌 파 기록에 대 한 그러나, 무선 뇌 파 원격 측정 시스템 최근에 개발도 하 고 인기16에서 얻고 있다.
무선 뇌 파 시스템에 비해, 테더 배열 원하는 응용 프로그램에 따라 바람직 할 수 있습니다 몇 가지 기술적인 장점을 있습니다. 이러한 장점이 포함 뇌 파 또는 다른 biopotentials; 기록에 대 한 채널의 더 많은 수 낮은 전극 비용; 전극 disposability; 적은 민감성 신호 손실; 그리고 더 큰 주파수 대역폭 (즉., 샘플링 속도) 녹음17의. 제대로, 테더 녹음 방법을 여기에 설명 된은 높은 품질, 유물-뇌 파, 자유롭고 ECG 데이터 행동 모니터링에 대 한 해당 비디오와 동시에. 신경, 심장, 식별 하기 위해 다음이 뇌 파 및 심전도 데이터를 수집한 수 또는 neurocardiac 이상 발작, 뇌 파의 변화 등 파워 스펙트럼, 심장 유도 블록 (즉., 심장 박동을 생략), 심장 박동의 변화에서 변화. 이러한 뇌 파 ECG 양적 방법의 응용 프로그램 입증, 선물이 예 실험 Kcna1 녹아웃 (-/-)를 사용 하 여 마우스. Kcna1 -/- 생쥐 전압 개폐 Kv1.1 α-소 단위 부족 하 고 결과적으로 자발적인 발작, 심장 기능 장애, 조기 사망, 그들의 해로운 동시 EEG ECG 평가 대 한 이상적인 모델 간 연결 만들기 전시 neurocardiac 장애입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VistaVision stereozoom dissecting microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolan-Jenner MI-150 microscopy illuminator, with ring light</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MI-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS Series scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>CS200</td>
			<td>for weighing animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump professional</td>
			<td>Stryker</td>
			<td></td>
			<td>recirculating water heat pad system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments</td>
			<td>RS-6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal Micro Drill Burr Set</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>60-1000</td>
			<td>only need the 0.8-mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9962</td>
			<td>mini clipper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tabletop vise</td>
			<td>Eclipse Tools</td>
			<td>PD-372</td>
			<td>PD-372 Mini-tabletop suction vise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>ToughCut, Straight, Sharp/Sharp, 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crile-Wood needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12003-15</td>
			<td>Straight, Serrated, 15 cm, with lock - For applying wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11297-00</td>
			<td>Standard Tips, Curved, Dumostar, 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Serrated, Straight, 12 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar needle holder with suture cutter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td>Straight, Serrated, 12 cm, with lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical blades #15</td>
			<td>Havel&#39;s</td>
			<td>FHS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 surgical suture</td>
			<td>Unify</td>
			<td>S-N618R13</td>
			<td>non-absorbable, monofilament, black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze sponges</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>2346</td>
			<td>12 ply, 7.6 cm x 7.6 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped swabs</td>
			<td>Constix</td>
			<td>SC-9</td>
			<td>15.2-cm total length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>super glue&#160;</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>LOC1364076</td>
			<td>gel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel wound clips, 7.5mm</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS700750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarboxylate dental cement kit</td>
			<td>Prime-dent</td>
			<td>010-036</td>
			<td>Type 1 fine grain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427431</td>
			<td>PE160, 1.143 mm (ID) x 1.575 mm (OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorhexidine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube vet ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td></td>
			<td>opthalamic eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anesthetic cocktail</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ketamine (80 mg/kg), Xylazine (10 mg/kg), and Acepromazine (1 mg/kg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rimadyl (trade name)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HydroGel</td>
			<td>ClearH20</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>hydrating gel; 56-g cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponemah&#160; software</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td></td>
			<td>data acquisition and analysis software; version 5.2 or greater with Electrocardiogram Module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7700 Digital Signal conditioner</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Channel Isolated Bio-potential Pod</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fish tank</td>
			<td>Topfin</td>
			<td></td>
			<td>for use as recording chamber; 20.8 gallon aquarium; 40.8 cm (L) X 21.3 cm (W) X 25.5 cm (H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Communication Module (DCOM)</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td>13-7715-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Channel Isolated Bio-potential Pod</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td>12-7770-BIO12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serial link cable</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td>J03557-20</td>
			<td>connects DCOM to bio-potential pod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Interface (ACQ-7700USB)</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td>PNM-P3P-7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>network video camera</td>
			<td>Axis Communications</td>
			<td></td>
			<td>P1343, day/night capability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Port Gigabit Smart Switch</td>
			<td>Cisco</td>
			<td>SG200-08</td>
			<td>8-port gigabit ethernet swith with 4 power over ethernet supported ports (Cisco Small Business 200 Series)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-pin male nanoconnector with guide post hole</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>NPS-10-WD-30.0-C-G</td>
			<td>electrode for implantation on the mouse head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-socket female nanoconnector with guide post</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>NSS-10-WD-2.0-C-G</td>
			<td>connector for electrode implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mm female touchproof connector cables</td>
			<td>PlasticsOne</td>
			<td>441</td>
			<td>1 signal, gold-plated; for connecting the wiring from the head-mount implant to the bio-potential pod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WESD51 BUNDLE</td>
			<td>digital soldering station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solder</td>
			<td>Bernzomatic</td>
			<td>327797</td>
			<td>lead free, silver bearing, acid flux core solder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat shrink tubing</td>
			<td>URBEST</td>
			<td></td>
			<td>collection of tubing with 1.5- to 10-mm internal diameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat gun</td>
			<td>Dewalt</td>
			<td>D26960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting tape (double-sided)</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>MMM114</td>
			<td>114/DC Heavy Duty Mounting Tape, 2.54 cm x 1.27 m&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>recommended minimum requirements: 3rd Gen Intel Core i7-3770 processor with HD4000 graphics; 4 GB RAM, 1 GB AMD Radeon HD 7570 video card; 1 TB hard drive; Windows 7 OS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>permanent marker</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>37001</td>
			<td>black color, ultra fine point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mixing and applying the polycarboxylate dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart Pro software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>power spectrum software; version 8.1.3 or greater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kubios HRV software</td>
			<td>Univ. of Eastern Finland</td>
			<td></td>
			<td>HRV analysis software; version 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notepad</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>simple text editor software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous video-eeg-ecg monitoring to identify neurocardiac dysfunction in mouse models of epilepsy

간 질, 발작 심장 박동 변화, 유도 블록, asystoles, 및 잠재적으로 간 (SUDEP)에 갑자기 예기치 않은 죽음의 위험을 증가 시킬 수 있는 부정맥 같은 심장 리듬을 교란을 보여주고 수 있습니다. Electroencephalography (뇌 파)와 심전도 (ECG)는 비정상적인 두뇌 및 환자의 심장 리듬에 대 한 모니터링 널리 임상 진단 도구입니다. 여기, 동시에 기록 비디오, 뇌 파, 심전도 측정 동작, 뇌, 심장 활동을 마우스에 각각, 기술을 설명 합니다. 여기에 설명 된 기술을 활용 한 테더 마우스의 머리에 이식된 전극 녹음 장비에 유선은 녹화 구성 (즉, 유선). 무선 원격 측정 시스템 기록에 비해, 밧줄된 배치 보유 뇌 파 또는 다른 biopotentials; 기록에 대 한 채널의 더 많은 가능한 수 등 여러 기술적인 장점 낮은 전극 비용; 그리고 기록의 더 큰 주파수 대역폭 (즉, 샘플링 속도). 이 기술의 기본 plethysmography 근육 및 호흡 활동의 평가 대 한 전도 (EMG) 등 다른 biosignals를 각각 기록에 맞게 쉽게 수정 수 있습니다 또한. EEG ECG 기록 수행 하는 방법을 설명 하는, 뿐만 아니라 우리는 또한 발작, 뇌 파 스펙트럼 전력, 심장 기능 및 우리와 함께 마우스를 사용 하 여 예제 실험에서 설명 하는 심장 박동의 변화에 대 한 결과 데이터를 계량 하는 방법 자세히 Kcna1 유전자 삭제 때문의 간 질 비디오-뇌 파-ECG 모니터링 간 질 또는 다른 신경 질환 마우스 모델에서 뇌, 심장, 또는 뇌-심장 상호 작용의 수준에서 장애를 식별 하는 강력한 도구를 제공 합니다.

결과 표시 됩니다 neurocardiac 이상을 식별 하 뇌 파 ECG 기록에서 데이터를 분석 하는 방법을 설명 하는 Kcna1-/- 마우스 (2 개월)의 24 시간 뇌 파 ECG 기록에 대 한. 부족 전압 개폐 Kv1.1 α-소 단위는 Kcna1 유전자에 의해 설계 된다, 이러한 돌연변이 동물은 간 질의 자주 사용된 유전자 모델 그들은 안정적이 고 자주 일반된 토 닉 clonic 발작 활동 시작을 전시 하기 때문에 나이20의 약 2-3 주. 이외에 자발적인 발작, Kcna1-/- 마우스도 전시 조 interictal 뿐 아니라 간 질의 개시로 맞은 죽음과 심장 부전 발작 관련21, 22. 따라서, Kcna1-/- 마우스 또한 자주 연구 간 질 (SUDEP), 간 질 관련의 주요 원인에에서 갑자기 예기치 않은 죽음 기본 잠재적인 pathophysiological 프로세스 사용 사망률, 발작 관련 심폐 체포, 아직 참여 하는 것을 믿어진다, 저조한 메커니즘23이해.
이 실험에서 Kcna1-/- 마우스에서에서 녹음의 EEG 구성 요소 보여 자주 자발적인 발작 발작 발병 뒤에 간단한 전압에서 초기 큰 스파이크는으로 일반적으로 관찰 되는 우울증, 억제 패턴 (그림 8A) 버스트 급상승을 높은 진폭으로 전환. 동시에 녹화 된 비디오를 사용 하 여 이러한 electrographic 발작 발작 같은 행동, 양육 및 forelimb clonus 이후 전신 강장제 clonic 경련으로 개발 하 여 특징에 맞춰 발견 됐다. 노트, 뇌 파의 주요 장점 중 하나는 분명 한 행동, 그들은 혼자 행동에 따라 발작을 득점 하는 관찰자에 의해 놓친 것을 의미와 연결 되지 않은 "자동" electrographic 발작을 식별 하는 기능입니다. 이 특정 Kcna1-/- 마우스에에서 발작 발생률의 정량화 (그림 8B) 24 시간 녹음 기간 15 발작을 밝혔다. 이러한 발작의 기간 평균 60 ~ s, 대략에서 배열 15-105 s (그림 8B). Peri ictal 스펙트로그램 생성 (그림 8C) 및 사전 및 사후 ictal 기간의 상대적 스펙트럼 전력 밀도 분석을 보여 80의 기간의 발작 파워 스펙트럼 소프트웨어를 사용 하 여 평가 선정 되었다. 델타 주파수 대역의 사후 ictal 상대 스펙트럼 전력 미리 ictal 기준선 (그림 8D)에 비해 50% 증가 되었다. 또한, 다른 더 높은 주파수 뇌 파 밴드의 포스트 ictal 상대 전력을 미리 ictal 기간 (그림 8D)에 비해 해당 감소 전시. 포스트 ictal 델타 파워의 증가 다른 밴드의 포스트 ictal 힘의 감소는 뇌 파를 감속 하 고, 길고, 심각한 발작이 모델18에서 특성을 나타내는.
Kcna1-/에서 기록의 ECG 구성 요소 분석- 마우스, interictal 건너뛴된 심장 박동 수 수동으로 위에서 설명한을 계산 했다. 이 Kcna1-/- 마우스에에서 건너뛴된 심장 박동의 주파수는 5.84/h (표 1)은 한 > 우리의 이전 연구18,21WT 쥐에 비해 5 증가. Kcna1-/- 마우스의 ECG에 건너뛴된 심장 박동 자주 하지 뒤에, 복잡 한 QRS 그림 9A, 나타내는 것 (AV) 전도 블록21에서 같이 P 파를 전시 한다. 다음 HRV 소프트웨어를 사용 하 여, HRV이이 동물에 심장 기능에 자율 신경의 영향의 측정을 제공 하기 위해 분석 했다. HRV의 다음 시간 도메인 측정 Kcna1-/- 마우스에 대 한 계산 했다: 총 자율 가변성;의 인덱스 비트 대 비트 간격 (SDNN)의 표준 편차 그리고는 제곱 연속 비트 대 비트 차이 (RMSSD)의 부 교감 신경 음색의 인덱스입니다. 24 신호 수집 소프트웨어에서 생성 된 R-R 간격 값을 사용 하 여 Kcna1-/- 마우스 (그림 9B), 대 한 HRV 소프트웨어 계산 737 박동/min (표 1)의 심장 박동 우리의 이전 연구18WT 쥐 비슷한. 2.4 ms와 3.2 ms SDNN과 RMSSD 값 계산 했다 각각 (표 1)는에 대해 2-에 3 배 정상적인 WT 마우스18보다 더 높은. 이 Kcna1-/- 마우스에에서 도메인 HRV 측정 표시 증가 부 교감 신경 음색, 심장의 비정상적인 자율 제어를 제안 하는 높은 시간. 다음으로, 우리는 표 1에 요약 된다 주파수 영역에서 HRV의 다음 값을 계산 하 HRV 소프트웨어 사용: 낮은 주파수 전력 비율 (LF); 고주파 전력 비율 (HF); 그리고 LF/HF 비율입니다. HF 구성 요소 조합 교감 및 부 교감 신경의 영향25을 반영 하기 위해 생각 되 고 LF 구성 요소 반면 부 교감 신경의 변조를 반영 하기 위해 생각 된다. LF/HF 비율 교감 하 고 공감 활동의 상대적 균형을 캡처하는 데 사용 됩니다.
마지막으로, 신경 및 심장 기능 장애의 정량적 측정을 파생 하는 것 외에도 뇌 파 ECG 기록 또한 분석 될 수 있다 품질로 잠재적인 neurocardiac 장애를 식별 하기 위해 뇌 파 및 심전도 이상이 사이의 시간적 관계에 대 한 이전21,26일. 예를 들어 때 발작 또는 interictal epileptiform 방전 뇌 파에서 식별 됩니다, 해당 심전도 유도 블록 등 부정맥, 간 질 뇌 활동에 의해 evoked 수 있는 심장 이상 검사 수 합니다. Kcna1-/- 마우스에에서 발작 때로는 bradycardia 또는 asystole 치21,22를 진행 할 수를 보여주고 있습니다. 다른 간 질 모델 Kcnq1 돌연변이 마우스, 유도 블록 및 asystoles interictal 뇌 파 방전, 그들은 병 적인 neurocardiac 상호 작용26의 결과 제안 동시 발생 합니다. 따라서, 뇌 파 및 심전도의 동시 녹음 두뇌와 마음은 특히 중요 한 간 질 발작 잠재적으로 치명적인 심장 장애를 연상 수 있기 때문에 사이의 상호 작용의 더 완전 한 그림을 제공 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig1.jpg"> 그림 1입니다. 절차에 필요한 수술 도구. (1) 외과 블레이드 #15; (2) 메스 핸들 #3; (3) Adson 집게; (4) 올 슨 Hegar 바늘 홀더; (5) 좋은 위; (6) 뒤 몽 #7 집게; (7) 미셸 상처 클립; (8) Crile 나무 바늘 홀더; (9) 마이크로 드릴 0.8 m m 비트; (10) 의 전기 트리머 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig2.jpg"> 그림 2입니다. 전극 이식에 대 한 준비. 10-소켓 여성 nanoconnector (즉, 전극)의 (A) 예. (B) 뇌 파 및 심전도 이식 와이어와 탁상 바이스에 전극 아래로 접혀. 와이어 색상 표시 됩니다. 위쪽으로 지적 했다, 나머지 전선은 차단 될 것 이다. 삽입 된 전극에서 나오는 전선의 확대 보기를 표시 합니다. (C) 표시 위치는 절연 스트립를 나타내는 파란색 ECG 와이어. (D) 메스 블레이드를 사용 하 여 공개 안쪽은 필 라 멘 트 와이어 절연 스트립. (E) 트림 된 뇌 파를 보여주는 준비 전극의 최종 구성 전선 고 장착 테이프로 벗겨진된 ECG 전선 상단에 준수. 삽입 장착 테이프와 전극에서 나오는 전선의 확대 보기를 표시 합니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig3.jpg"> 그림 3입니다. 두개골에 전극의 수술 첨부. (A)는 양쪽으로 마우스의 예 (화살표로 표시) 면도 심전도 대 한 와이어 주입. (B) 눈과 절 개에 대 한 경로 만들기 위해 귀 사이 모피의 고 별. (C) 메스를 사용 하 여 두 피 절 개를 만들기 위해. (D) 두 피 절 개입니다. (E) 드릴 사이트를 나타내는 데 사용 하는 두개골에 4 개의 표시의 예입니다. (F) 버 구멍 드릴링 후 두개골에 전극의 배치. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig4.jpg"> 그림 4입니다. 터널링 및 ECG 전선의 이식. 폴 리 에틸렌 튜브를 약 6 c m 자르고 피하 터널링을 촉진 하기 위하여 1 개의 끝에 경사지는의 (A) 예. (B)는 측면 절 개 사이트에 시작 하는 폴 리 에틸렌 튜브와 함께 피하 터널링. (C)는 튜브를 통해 머리에 전극에서 ECG 와이어를 먹이. (D)는 튜브를 제거한 후 긴장 된 와이어가 겠 지. (E) 기본 조직에 제자리에 ECG 와이어 소지가 노출된 부분에는 봉합을 적용 합니다. 사이드 절 개 상처 클립의 (F) 폐쇄. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig5.jpg"> 그림 5입니다. 뇌 파 전선 이식 (A) 빨간 뇌 파 와이어를 파악 하 고 두개골에 버 구멍에 그것을 수평으로 먹이, 다음 배치는 블랙의 접지 와이어. (B) nanoconnector 및 이식에 따라 와이어의 마지막 구성입니다. (C) 회로도 표시 배치는 양자 뇌 파 및 심전도의 철사, 참조 (REF)와 접지 (GND) 전선. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig6.jpg"> 그림 6입니다. 머리 절 개를 폐쇄. (A) caudally 시작 하 고 rostrally 진행 전극의 기지 주변 치과 시멘트의 응용 프로그램. 치과 시멘트 모자 전체 nanoconnector 및 와이어, 절 개의 최종 폐쇄 직전의 (B) 예. 마지막 봉인된 절 개 (C) 예. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig7.jpg"> 그림 7입니다. 비디오 뇌 파 ECG 신호의 기록. (A) 는 녹음 하는 동안 곁된 마우스의 예. (B) 회로도 테더 비디오-뇌 파-ECG 기록 vivo에서 시스템에 대 한 장비 구성을 보여주는 두개골에 이식 여성 nanoconnector에 연결, 10-핀 남성 nanoconnector에서 배선 12 채널 절연된 바이오 잠재력 포드 인터페이스에 연결 되는 1.5 m m 여성 케이블에 납땜입니다. 이 포드 다음 어떤 전송 디지털 데이터 신호 수집 인터페이스 유닛 (ACQ) 데이터 수집 소프트웨어를 데스크톱 컴퓨터에 연결 된 디지털 통신 모듈 (DCOM), 직렬 링크 케이블에 의해 연결 된다. 비디오도 동시에 외부의 위치 및 감 금 소에 인접 한 네트워크 비디오 카메라를 사용 하 여 획득 됩니다. 카메라는 이더넷 스마트 스위치를 통해 파워를 통해 컴퓨터에 연결 됩니다. (C) 일반적인 뇌 파 및 심전도의 대표적인 흔적 신호 다음 필터를 사용 하 여 데이터 적용:-60hz 노치, EEG; 75 Hz 낮은 0.3 Hz 높은 통과 대역 필터 그리고 심전도 대 한 3 Hz 높은 통과 필터. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig8.jpg"> 그림 8입니다. 뇌 파 신호 분석. (A)는 뇌 파 추적에 대표적인 자연 스러운 발작을 보여주는 한 Kcna1-/- 마우스. (B) 각 발작의 시간 기간의 줄거리에 24 h 녹음 세션 동안 관찰 된 Kcna1-/- 마우스. 막대는 평균 ± 표준 편차에 대응 한다. (C) 페리 ictal 스펙트로그램, 동안, 이전과 이후 대표적인 발작 주파수 및 전력 밀도 보여주는. (D) 사전 및 사후 ictal 기간 동안 각 뇌 파 주파수 대역에서 상대적 힘의 비교 상대 델타 파워의 증가 보여 고 세타, 알파, 베타 및 감마 전력 감소. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig9.jpg"> 그림 9입니다. ECG 신호 분석. (A) 샘플 ECG 추적에서는 Kcna1-/- 마우스 복잡 한 정상 부 비 동 리듬 선행 하는 QRS에 의해 따르지 P 파로 명시 하는 것 전도 블록을 보여주는. P 파, QRS 복합물, 및 R-R 간격 참조에 대 한 표시 됩니다. (B) R-R 간격 시리즈의 대표 작의 ECG 기록에서 얻은 Kcna1-/- 마우스 비트 사이의 시간에 변화를 보여주는. 빨간색 선은 낮은 주파수 트렌딩 다음 R-R 간격 시리즈에서 제거 하는 트렌드 구성 요소를 보여줍니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="4">심장 박동을 생략 / h</td>
			<td colspan="6">심장 박동 변화 (HRV)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">시간 영역</td>
			<td colspan="3">주파수 영역</td>
		</tr>
<tr>
<td>시간</td>
			<td>SDNN</td>
			<td>RMSSD</td>
			<td>LF</td>
			<td>HF</td>
			<td rowspan="2">LF/HF 비율</td>
		</tr>
<tr>
<td>(비트/분)</td>
			<td>(ms)</td>
			<td>(ms)</td>
			<td>(%)</td>
			<td>(%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.84</td>
			<td>736.8</td>
			<td>2.4</td>
			<td>3.2</td>
			<td>52.27</td>
			<td>46.38</td>
			<td>1.127</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 정량화 건너뛴된 심장의 박동, 심장 박동 (인사), 그리고 심장 박동 변화 (HRV) 에 Kcna1-/- 마우스. HRV의 다음 시간 도메인 측정을 받는다: 비트-비트 간격 (SDNN)의 표준 편차와 연속 비트 대 비트 차이 (RMSSD)의 제곱 평균. 주파수 영역에서 다음 HRV 측정 표시 됩니다: 저주파 전력 비율 (LF %); 높은 주파수 전력 비율 (HF %); 및 고주파 전원 (LF/HF 비율)에 낮은 주파수 전력의 비율.

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Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

여기, 선물이 두뇌를 기록 하 고 동시 비디오를 사용 하 여 마우스에 바이오 신호를 심장에 프로토콜 electroencephalography (뇌 파), 그리고 심전도 (ECG). 우리는 또한 발작, 뇌 파 스펙트럼 전력, 심장 기능, 그리고 심장 박동의 변화에 대 한 결과 뇌 파 ECG 기록 분석 하는 방법을 설명 합니다.

동시 비디오-뇌 파-ECG 모니터링 Neurocardiac 부전 간 질 마우스 모델에서을 식별 하

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

simultaneous-video-eeg-ecg-monitoring-to-identify-neurocardiac

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

25.2K 조회수.  Louisiana State University Health Sciences Center. 여기, 선물이 두뇌를 기록 하 고 동시 비디오를 사용 하 여 마우스에 바이오 신호를 심장에 프로토콜 electroencephalography (뇌 파), 그리고 심전도 (ECG). 우리는 또한 발작, 뇌 파 스펙트럼 전력, 심장 기능, 그리고 심장 박동의 변화에 대 한 결과 뇌 파 ECG 기록 분석 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

연구

유전학

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome editing, embryonic stem (ES) cell-based gene-targeting technology does not have these shortcomings and is widely used to modify animal/mouse genome ranging from large deletions/insertions to single nucleotide substitutions. Notably, identifying the relatively few homologous recombination (HR) events necessary to obtain desired ES clones is a key step, which demands accurate and reliable methods. Southern blotting and/or conventional PCR are often utilized for this purpose. Here, we describe the detailed procedures of using those two methods to identify HR events that occurred in mouse ES cells in which the endogenous Myh9 gene is intended to be disrupted and replaced by cDNAs encoding other nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). The whole procedure of Southern blotting includes the construction of targeting vector(s), electroporation, drug selection, the expansion and storage of ES cells/clones, the preparation, digestion, and blotting of genomic DNA (gDNA), the hybridization and washing of probe(s), and a final step of autoradiography on the X-ray films. PCR can be performed directly with prepared and diluted gDNA. To obtain ideal results, the probes and restriction enzyme (RE) cutting sites for Southern blotting and the primers for PCR should be carefully planned. Though the execution of Southern blotting is time-consuming and labor-intensive and PCR results have false positives, the correct identification by Southern blotting and the rapid screening by PCR allow the sole or combined application of these methods described in this paper to be widely used and consulted by most labs in the identification of genotypes of ES cells and genetically modified animals.

Here, we present a detailed protocol for identifying homologous recombination events that occurred in mouse embryonic stem cells using Southern blotting and/or PCR. This method is exemplified by the generation of nonmuscle myosin II genetic replacement mouse models using traditional embryonic stem cell-based homologous recombination-mediated targeting technology.

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) are a rigorous method for studying mammalian development and disease. Our laboratory has developed several GEMMs of prostate cancer (PCa) that lack expression of one or multiple tumor suppressor genes using the site-specific Cre-loxP recombinase system and a prostate-specific promoter. In this article, we describe our method for necropsy of these PCa GEMMs, primarily focusing on dissection of mouse prostate tumors. New methods developed over the last decade have facilitated the culture of epithelial-derived cells to model organ systems in vitro in three dimensions. We also detail a 3D cell culture method to generate tumor organoids from mouse PCa GEMMs. Pre-clinical cancer research has been dominated by 2D cell culture and cell line-derived or patient-derived xenograft models. These methods lack tumor microenvironment, a limitation of using these techniques in pre-clinical studies. GEMMs are more physiologically-relevant for understanding tumorigenesis and cancer progression. Tumor organoid culture is an in vitro model system that recapitulates tumor architecture and cell lineage characteristics. In addition, 3D cell culture methods allow for growth of normal cells for comparison to tumor cell cultures, rarely possible using 2D cell culture techniques. In combination, use of GEMMs and 3D cell culture in pre-clinical studies has the potential to improve our understanding of cancer biology.&#160;

We show a method for necropsy and dissection of mouse prostate cancer models, focusing on prostate tumor dissection. A step-by-step protocol for generation of mouse prostate tumor organoids is also presented.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

소독멜라노가스터에서 새로운 신경보호 유전자를 식별하기 위한 생체 전방 유전자 스크린

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...