Diese Arbeit wurde unterstützt von Citizens United für die Forschung bei Epilepsie (Grant-Nummer 35489); die National Institutes of Health (Zuschuss Zahlen R01NS100954, R01NS099188); und Louisiana State University Health Sciences Center Malcolm Feist Postdoctoral Fellow.

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

EEG-EKG Aufnahmen in hoher Qualität zu erhalten, die frei von Artefakten sind, sollten alle Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um Abbau oder Lockerung von implantierten Elektrode und Leitungen zu verhindern. Ein EEG Kopf Implantat locker wird, werden der Draht Kontakte mit dem Gehirn führt zu verminderter Signal Amplituden beeinträchtigen. Lockere Implantate oder schlechten Draht Kontakte kann auch Verzerrung der elektrischen Signale, Einführung von Bewegungsartefakten und Hintergrundgeräusche zu den Aufnahmen. Um zu verhindern, mögliche Lockerung des Implantats Kopf, gelten Sie eine großzügige Menge von dental Zement um die Basis des Implantats beim Schließen des Kopfhaut Schnittes um maximale Festigkeit und Haftung zu gewährleisten. Auch sollte darauf geachtet werden, um vollständige Entfernung von Pelzen aus dem Schädel zu gewährleisten, da Fell Reste können dazu führen, dass postoperative Entzündungen führen zu Schwellungen rund um das Implantat und vorzeitige Ablösung Implantat. Im Laufe der Zeit haben den Kopf Implantate das Potenzial, durch den Stress mit wiederholten und Ausstecken des Tieres zu lösen. Daher, wenn möglich, versuchen Sie, die Anzahl der Wiederholungen zu minimieren, die das Tier angeschlossen/unplugged durch die Durchführung einzelner langer Dauer Aufnahmen, anstatt mehrere Aufnahmen von kurzer Dauer ist. Eine weitere mögliche Quelle von postoperativen Implantat Schaden und anschließende Tier Verletzungen ist Körperkontakt zwischen dem Implantat und dem Wiretop in das Tier nach Hause Käfig. Um den Bedarf an Wiretops, Nahrung zu beseitigen können Pellets und feuchtigkeitsspendende Gel auf dem Boden platziert werden. Zu guter Letzt sollte um die Integrität der ECG führt zu erhalten, Handhabung des Tieres, vor allem an den Seiten des Körpers minimiert werden wo die ECG Drähte laufen.
Zusätzlich zum Abbau der Implantat oder Draht Kontakte ist eine weitere mögliche Komplikation der gefesselte Aufnahmekonfiguration die Möglichkeit des Tieres immer getrennt (d.h., unplugged oder hakte) während eines Experimentes führt um zu Verlust zu signalisieren. Distanz kann besonders problematisch für Mäuse, die schweren krampfhafte Anfälle mit laufen und springen zu erleben. Um die Wahrscheinlichkeit, dass die Maus immer getrennt zu minimieren, optimieren Sie die Höhe der Flaute in den Draht-Tether-Gurt. Die besten Drahtlänge ist normalerweise ein Gleichgewicht zwischen bietet genug Spielraum für das Tier zu allen Ecken des Käfigs zu erkunden, aber nicht so wenig, dass gibt es unnötige Spannung in den Drähten, die Ablösung fördern könnte. Bei der Bestimmung der optimalen Drahtlänge, sicherzustellen, dass es nicht so viel Spielraum, dass die Maus leicht auf dem Draht kauen kann, was zu Signalverlust führen kann, wenn das Kabel beschädigt ist. Mit Elektrode Nanoconnector Implantate mit mindestens 10-Drähte (z. B. 10-Pin-Sockel/Paare) ist auch wichtig, um zusätzliche Stabilität auf die gefesselte Verbindung als Nanoconnectors mit weniger als 10-Drähte sind in der Regel häufiger aushängen. Um die Wahrscheinlichkeit, dass das Tier immer getrennt weiter zu reduzieren, kann dieses Protokoll leicht geändert werden, indem Sie die Drähte von der Maus Kopf auf einen niedrigen Drehmoment Kommutator über die Aufnahme Kammer aufgehängt. Der Kommutator funktioniert durch drehen die Maus bewegt, die Anhäufung der Torsionssteifigkeit Belastung in den Draht, wodurch verhindert, dass die Maus ausstecken zu entlasten.
Die große Stärke dieses tethered Video-EEG-EKG-Protokolls ist die Möglichkeit, die Methode für zusätzliche Anwendungen zu ändern. Wie hier beschrieben, sind nur sechs von den verfügbar zehn Elektrodenleitungen genutzt. Die restlichen vier Drähte könnte jedoch auch implantiert werden, wie eine zusätzliche vier EEG führt um zu besser räumlichen Auflösung der Aktivität des Gehirns zu bieten. Alternativ konnten zwei der ungenutzte Leitungen vernäht in die Muskulatur des Halses aufzuzeichnende Elektromyogramm (EMG), stellt ein Maß für die Muskelaktivität, die in Kombination mit EEG wichtig ist für die Bestimmung der Standby-Status. Eine andere mögliche Änderung wäre das Tier in einer Ganzkörper-Plethysmographie Kammer zu erfassen, die den Draht-Tether-Gurt angepasst ist. In Plethysmographie kleine Druckänderungen mit Inspiration und Ablauf sind Atemwegserkrankungen Wellenformen umgebaut. Durch den Einbau von Plethysmographie, deshalb technisch möglich, eine gleichzeitige Aufnahme von Videos, EEG, EKG, EMG und Atmung, die eine Auslesen der Verhalten und Gehirn, Herz, Muskeln und Lunge Aktivitäten darstellen würde. Solche umfassenden in Vivo physiologische Aufnahmen sind nahezu unmöglich in der Telemetrie Systeme von heute machen die gefesselten Ansatz beschrieben hier ein besonders leistungsfähiges Werkzeug für gleichzeitige Abfrage von mehreren Biosignalen bei Mäusen.

Elektroenzephalographie (EEG) und Elektrokardiographie (EKG) sind leistungsfähige und am weitesten verbreiteten Techniken zur Bewertung von in Vivo Gehirn und Herzfunktion, beziehungsweise. EEG ist die Aufzeichnung der elektrischen Hirnaktivität durch das Anbringen der Elektroden auf der Kopfhaut1. Das Signal aufgezeichnet mit nicht-invasive EEG steht für Spannungsschwankungen aus aufintegrierten exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen Potenziale vor allem durch kortikale pyramidale Neuronen1,2erzeugt. EEG ist der am häufigsten verwendeten neurodiagnostische-Test zur Beurteilung und Behandlung von Patienten mit Epilepsie3,4. Es ist besonders nützlich, wenn epileptische Anfälle, ohne offensichtliche krampfhaft Verhaltens Manifestationen, z. B. Abwesenheit Ergreifungen oder nicht-konvulsiver Status Epilepticus5,6 auftreten. Umgekehrt, nicht-Epilepsie zusammenhängende Bedingungen, die zu krampfartigen Episoden oder Verlust des Bewusstseins führen als epileptische Anfälle ohne Video-EEG Überwachung7diagnostiziert werden können. Neben seiner Nützlichkeit auf dem Gebiet der Epilepsie ist EEG auch abnormale Gehirnaktivität im Zusammenhang mit Schlafstörungen, Enzephalopathien und Gedächtnisstörungen zu erkennen sowie allgemeinen Anästhesie bei Operationen2 ergänzen weit verbreitet , 8 , 9.
Im Gegensatz zum EEG, ECG (oder EKG als es manchmal abgekürzt) ist die Aufzeichnung der elektrischen Aktivität des Herzens10. EKGs erfolgt in der Regel durch das Anbringen von Elektroden auf die Extremität Extremitäten und Brustwand, die ermöglicht die Erkennung von Spannungsänderungen, die vom Herzmuskel während jedes Herzzyklus Kontraktion und Entspannung10,11erzeugt. Die ECG Wellenform Hauptkomponenten einer normalen Herzzyklus gehören die P-Welle, QRS-Komplexes und der T-Welle, die Vorhofflimmern Depolarisation, ventrikulären Depolarisation und ventrikuläre Repolarisation, bzw.10, entsprechen 11. EKG-monitoring wird routinemäßig verwendet, um Herzrhythmusstörungen und Mängel der kardialen Wärmeleitung System12zu identifizieren. Bei Epilepsie-Patienten ist die Bedeutung des Einsatzes von ECG, um potenziell lebensbedrohliche Arrhythmien zu identifizieren verstärkt, da sie deutlich erhöhtes Risiko für plötzlichen Herztod, sowie plötzliche unerwartete Todesfälle bei Epilepsie13sind, 14,15.
Neben ihrer klinischen Anwendungen sind EEG und EKG-Aufnahmen ein unverzichtbares Instrument zur Identifizierung von Hirn und Herz Dysfunktion in Mausmodellen der Krankheit geworden. Obwohl traditionell diese Aufnahmen separat durchgeführt worden sind, beschreiben hier wir eine Technik, um Videos aufzunehmen, EEG und EKG gleichzeitig bei Mäusen. Die gleichzeitige Video-EEG-EKG-Methode hier nutzt eine gefesselte Aufnahmekonfiguration in denen die implantierte Elektrode auf den Kopf der Maus dem Kontrollgerät fest verdrahtet ist. In der Vergangenheit das angebunden oder verdrahtet, Konfiguration der Standard und wurde am häufigsten verwendete Methode für EEG-Ableitungen bei Mäusen; Allerdings drahtlose EEG-Telemetrie-Systeme haben auch vor kurzem entwickelt worden und gewinnt an Popularität16.
Im Vergleich zu EEG-Funksysteme, besitzt die gefesselte Anordnung einige technische Vorteile, die es, abhängig von der gewünschten Anwendung vorzuziehen machen können. Diese Vorteile sind eine größere Anzahl von Kanälen zur Aufnahme von EEG oder anderen Biopotentials; untere Elektrode Kosten; Elektrode Verfügbarkeit; weniger Anfälligkeit für signal-Verlust; und größere Frequenzbandbreite (i.e., Sampling-Rate) von Aufnahmen17. Richtig gemacht, die hier beschriebene tethered Aufnahmemethode ist in der Lage qualitativ hochwertige, artefaktfrei EEG und EKG Daten gleichzeitig, zusammen mit dem entsprechenden Video zur Überwachung von Verhalten. Diese EEG und EKG-Daten können dann abgebaut werden, um neuronale, kardiale zu identifizieren, oder Neurocardiac Anomalien wie Krampfanfälle, Veränderungen im EEG power-Spektrum, kardiale Wärmeleitung Blöcke (i.e., Herzschläge übersprungen), und Veränderungen in der Herzfrequenz-Variabilität. Um die Anwendung dieser EEG-EKG quantitative Methoden zu demonstrieren, präsentieren wir ein Beispiel-Experiment mit einem Kcna1 -Ko (- / -) Maus. Kcna1 - / - Mäusen fehlt Spannung gated Kv1.1 α-Untereinheiten und folglich weisen eine spontane Anfälle, kardialer Dysfunktion und vorzeitigen Tod, so dass sie ein ideales Modell für simultane EEG-EKG-Auswertung von schädlichen Epilepsie-assoziierten Neurocardiac Dysfunktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VistaVision stereozoom dissecting microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolan-Jenner MI-150 microscopy illuminator, with ring light</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MI-150RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS Series scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>CS200</td>
			<td>for weighing animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump professional</td>
			<td>Stryker</td>
			<td></td>
			<td>recirculating water heat pad system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments</td>
			<td>RS-6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal Micro Drill Burr Set</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>60-1000</td>
			<td>only need the 0.8-mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9962</td>
			<td>mini clipper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tabletop vise</td>
			<td>Eclipse Tools</td>
			<td>PD-372</td>
			<td>PD-372 Mini-tabletop suction vise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>ToughCut, Straight, Sharp/Sharp, 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crile-Wood needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12003-15</td>
			<td>Straight, Serrated, 15 cm, with lock - For applying wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11297-00</td>
			<td>Standard Tips, Curved, Dumostar, 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Serrated, Straight, 12 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar needle holder with suture cutter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td>Straight, Serrated, 12 cm, with lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical blades #15</td>
			<td>Havel&#39;s</td>
			<td>FHS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 surgical suture</td>
			<td>Unify</td>
			<td>S-N618R13</td>
			<td>non-absorbable, monofilament, black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze sponges</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>2346</td>
			<td>12 ply, 7.6 cm x 7.6 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped swabs</td>
			<td>Constix</td>
			<td>SC-9</td>
			<td>15.2-cm total length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>super glue&#160;</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>LOC1364076</td>
			<td>gel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel wound clips, 7.5mm</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS700750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarboxylate dental cement kit</td>
			<td>Prime-dent</td>
			<td>010-036</td>
			<td>Type 1 fine grain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427431</td>
			<td>PE160, 1.143 mm (ID) x 1.575 mm (OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorhexidine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube vet ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td></td>
			<td>opthalamic eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anesthetic cocktail</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ketamine (80 mg/kg), Xylazine (10 mg/kg), and Acepromazine (1 mg/kg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rimadyl (trade name)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HydroGel</td>
			<td>ClearH20</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td>hydrating gel; 56-g cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponemah&#160; software</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td></td>
			<td>data acquisition and analysis software; version 5.2 or greater with Electrocardiogram Module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7700 Digital Signal conditioner</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Channel Isolated Bio-potential Pod</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fish tank</td>
			<td>Topfin</td>
			<td></td>
			<td>for use as recording chamber; 20.8 gallon aquarium; 40.8 cm (L) X 21.3 cm (W) X 25.5 cm (H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Communication Module (DCOM)</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td>13-7715-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Channel Isolated Bio-potential Pod</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td>12-7770-BIO12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serial link cable</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td>J03557-20</td>
			<td>connects DCOM to bio-potential pod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Interface (ACQ-7700USB)</td>
			<td>Data Sciences International</td>
			<td>PNM-P3P-7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>network video camera</td>
			<td>Axis Communications</td>
			<td></td>
			<td>P1343, day/night capability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Port Gigabit Smart Switch</td>
			<td>Cisco</td>
			<td>SG200-08</td>
			<td>8-port gigabit ethernet swith with 4 power over ethernet supported ports (Cisco Small Business 200 Series)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-pin male nanoconnector with guide post hole</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>NPS-10-WD-30.0-C-G</td>
			<td>electrode for implantation on the mouse head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-socket female nanoconnector with guide post</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>NSS-10-WD-2.0-C-G</td>
			<td>connector for electrode implant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-mm female touchproof connector cables</td>
			<td>PlasticsOne</td>
			<td>441</td>
			<td>1 signal, gold-plated; for connecting the wiring from the head-mount implant to the bio-potential pod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WESD51 BUNDLE</td>
			<td>digital soldering station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solder</td>
			<td>Bernzomatic</td>
			<td>327797</td>
			<td>lead free, silver bearing, acid flux core solder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat shrink tubing</td>
			<td>URBEST</td>
			<td></td>
			<td>collection of tubing with 1.5- to 10-mm internal diameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat gun</td>
			<td>Dewalt</td>
			<td>D26960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting tape (double-sided)</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>MMM114</td>
			<td>114/DC Heavy Duty Mounting Tape, 2.54 cm x 1.27 m&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>recommended minimum requirements: 3rd Gen Intel Core i7-3770 processor with HD4000 graphics; 4 GB RAM, 1 GB AMD Radeon HD 7570 video card; 1 TB hard drive; Windows 7 OS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>permanent marker</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>37001</td>
			<td>black color, ultra fine point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mixing and applying the polycarboxylate dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart Pro software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>power spectrum software; version 8.1.3 or greater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kubios HRV software</td>
			<td>Univ. of Eastern Finland</td>
			<td></td>
			<td>HRV analysis software; version 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notepad</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>simple text editor software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous video-eeg-ecg monitoring to identify neurocardiac dysfunction in mouse models of epilepsy

Bei Epilepsie können Anfälle hervorrufen, Herzrhythmus-Störungen wie zum Beispiel Veränderungen der Herzfrequenz, Wärmeleitung Blöcke, Asystoles und Behandlung von Herzrhythmusstörungen, die potenziell plötzlicher unerwarteter Tod bei Epilepsie (bereits) erhöhen können. Elektroenzephalographie (EEG) und Elektrokardiographie (EKG) sind weit verbreitete klinische Diagnose-Tools für abnormale Gehirn und Herz Rhythmen bei Patienten zu überwachen. Hier ist eine Technik, um gleichzeitig, EEG und EKG bei Mäusen zu Maßnahme Verhalten, Gehirn und Herz Aktivitäten bzw. Videoaufnahmen beschrieben. Die hier beschriebene Technik nutzt ein tethered (d.h.verkabelt) Aufnahmekonfiguration in denen die implantierte Elektrode auf den Kopf der Maus fest verdrahtet, dem Kontrollgerät ist. Im Vergleich zu drahtlosen Telemetrie Aufzeichnungssysteme, besitzt die gefesselte Anordnung mehrere technische Vorteile wie eine größere mögliche Anzahl von Kanälen zur Aufnahme von EEG oder anderen Biopotentials; untere Elektrode Kosten; und größere Frequenzbandbreite (d.h., Sampling-Rate) Aufnahmen. Die Grundlagen dieser Technik können auch leicht angepasst werden bzw. andere Biosignalen wie Elektromyographie (EMG) oder Plethysmographie zur Beurteilung von Muskel und Atmungsaktivität, Aufnahme. Neben der Beschreibung der EEG-EKG-Aufnahmen durchführen, zeigen wir auch Methoden zur Quantifizierung der Ergebnisdaten für Anfälle, EEG-spektrale, Herzfunktion und Herzfrequenz-Variabilität, die wir zeigen an einem Beispiel-Experiment mit einer Maus mit Epilepsie durch Kcna1 gen löschen. Video-EEG-EKG-Überwachung in Mausmodellen der Epilepsie oder einer anderen neurologischen Erkrankung ist ein leistungsstarkes Tool um Dysfunktion auf der Ebene von Gehirn, Herz oder Gehirn-Herz Interaktionen zu identifizieren.

Zur Demonstration, wie die Datenanalyse aus EEG-EKG-Aufzeichnungen, Neurocardiac Anomalien zu identifizieren, die Ergebnisse werden angezeigt für eine 24-h-EEG-EKG-Aufzeichnung von einem Kcna1–/– Maus (2 Monate alt). Diese mutierte Tiere, die an Spannung-gated Kv1.1 α-Untereinheiten, die durch das Kcna1 -Gen codiert konstruiert sind, sind ein häufig verwendete genetische Modell von Epilepsie, da sie zuverlässig und häufige generalisierten Stärkungsmittel-klonischen Anfall Tätigkeit Anfang aufweisen bei ca. 2-3 Wochen Alter20. Zusätzlich zu den spontanen Anfällen, Kcna1–/– Mäuse auch ausstellen, vorzeitigen Tod zeitgleich mit dem Beginn der Epilepsie sowie korreliert und Beschlagnahme-assoziierten kardialen Dysfunktion21, 22., Kcna1–/– Mäuse werden auch oft verwendet, um die mögliche pathophysiologische Prozesse zugrunde liegen plötzlich unerwarteter Tod bei Epilepsie (bereits), die häufigste Ursache für Epilepsie-bezogene Studie Sterblichkeit, die vermutlich im Zusammenhang mit der Beschlagnahme kardiorespiratorische Verhaftung durch, als der noch einbeziehen, verstanden schlecht Mechanismen23.
In diesem Experiment zeigte die EEG-Komponente der Aufnahmen aus der Kcna1–/– Maus häufige spontanen Anfällen, die in der Regel als eine erste große Spike bei Beschlagnahme Beginn, gefolgt von kurzen Spannung zu beobachten sind Depression, Übergang in hoher Amplitude Spick und beenden platzen Unterdrückung Muster (Abb. 8A). Verwenden das gleichzeitig aufgezeichnete Video, fanden diese elektrographischen Anfälle zusammenfallen mit Beschlagnahme-ähnliche Verhaltensweisen, gekennzeichnet durch Aufzucht und Vordergliedmaße Klonus, die anschließend in Ganzkörper-Tonikum-klonische Krämpfe entwickelt. Der Hinweis ist einer der Hauptvorteile des EEG "silent" elektrographischen Anfälle zu identifizieren, die nicht mit offensichtlichen Verhalten, was bedeutet, dass sie von einem Beobachter scoring Anfälle basierend auf Verhalten allein fehlen würde verbunden sind. Die Quantifizierung der Beschlagnahme Inzidenz in diesem bestimmten Kcna1–/– Maus ergab 15 Anfälle während der 24-h Aufzeichnungsdauer (Abbildung 8 b). Die Dauer der diese Anfälle durchschnittlich ~ 60 s, angefangen bei ca. 15-105 s (Abb. 8 b). Um relative spektrale Dichteanalyse der Pre- und Post-iktalen Periode zu demonstrieren, wurde ein Anfall von 80s Dauer für Auswertung über die Power-Spektrum-Software ausgewählt und ein Peri-iktalen Spektrogramm generiert (Abbildung 8). Die Post-iktale relative spektrale macht das Delta-Frequenzband wuchs um ca. 50 % im Vergleich zum Pre-iktalen Ausgangswert (Abbildung 8). Die Post-iktale relative macht der andere höhere EEG Frequenzbänder ausgestellt darüber hinaus entsprechende sinkt gegenüber dem Pre iktalen (Abbildung 8). Der Zuwachs an Post-iktalen Delta macht und die Rückgänge in Post-iktalen macht die anderen Bands sind kennzeichnend für EEG-Verlangsamung, ein Merkmal von langen, schweren Anfällen in diesem Modell im18.
Analyse der ECG-Komponente der Aufnahme von der Kcna1–/– -Maus, die Anzahl der übersprungenen interiktale Herzschläge manuell zählte wie oben beschrieben. Die Frequenz der übersprungenen Herzschläge in diesem Kcna1–/– Maus war 5,84/h (Tabelle 1), das ist eine > 5-fold Anstieg im Vergleich zum WT Mäuse in unserem vorherigen Studien18,21. Im EKG Kcna1–/– Mäuse, weisen übersprungenen Herzschläge oft eine P-Welle, die ein QRS-Komplex, nicht gefolgt ist, wie in Abbildung 9A, Angabe einer ventrikulären (AV) Conduction Block21gezeigt. Als nächstes wurde mit Hilfe der HRV-Software, HRV analysiert, um ein Maß für den Einfluss des autonomen Nervensystems auf die Herzfunktion in diesem Tier zur Verfügung zu stellen. Die folgenden Zeit Domäne Maßnahmen der HRV wurden berechnet, für die Kcna1–/– Maus: die Standardabweichung von der Beat-to-Beat-Intervallen (SDNN), die einen Index von autonomen Gesamtvariabilität; und das Root Mittel der Quadrate aufeinander folgenden Schlag-zu-Schlag-Unterschiede (RMSSD), das einen Index von parasympathetic Ton ist. 24 mit dem Signal Software generiert R-R Intervall Anschaffungswerte für Kcna1–/– Maus (Abbildung 9 b), berechnet die HRV-Software eine Herzfrequenz von 737 Schläge/min (Tabelle 1) , das ist ähnlich wie WT Mäuse in unserem vorherigen Studien18. Die SDNN und RMSSD Werte wurden berechnet, um 2,4 ms und 3,2 ms werden (Tabelle 1), das sind über 2 - bis 3 - fache höher als eine normale WT Maus18. Die erhöhte Zeit Domäne HRV Maßnahmen in diesem Kcna1–/– Maus erhöhte parasympathetic Ton zeigen, was darauf hindeutet anormale autonome Kontrolle des Herzens. Als nächstes wir HRV-Software verwendet, um die folgenden Werte der HRV im Frequenzbereich, berechnen die in Tabelle 1zusammengefasst werden: die niederfrequenten Strom Prozentsatz (LF); die hohe Frequenz macht Prozentsatz (HF); und die LF/HF-Ratio. Die HF-Komponenten werden gedacht, um parasympathischen Modulation widerspiegeln, während die LF-Komponenten gedacht werden, um zu reflektieren, dass eine Kombination von sympathischen und parasympathischen25beeinflusst. Die LF/HF-Ratio wird verwendet, um die relative Balance des sympathischen und parasympathischen Aktivität zu erfassen.
Zu guter Letzt können neben quantitativen Maßnahmen der neuronalen und kardiale Dysfunktion abzuleiten, die EEG-EKG-Aufnahmen auch qualitativ für die zeitliche Beziehung zwischen EEG und EKG Auffälligkeiten zu identifizieren potenzielle Neurocardiac Dysfunktion analysiert werden , wie bisher21,26. Zum Beispiel wenn Anfälle oder interiktale epileptiformen Entladungen im EEG identifiziert werden, kann das entsprechende EKG für kardiale Auffälligkeiten, wie Wärmeleitung Blöcke oder Herzrhythmusstörungen, die durch epileptische Hirnaktivität evoziert werden können eingesehen werden. In Kcna1–/– Mäuse, evozieren Anfälle manchmal Bradykardie oder Asystolie, die Letalität21,22fortschreiten kann. In einem anderen Epilepsie Modell auftreten Kcnq1 mutierte Maus, Wärmeleitung Blöcke und Asystoles gleichzeitig mit interiktale EEG-Ableitungen, was darauf hindeutet, dass sie eine Folge von pathologischen Neurocardiac Zusammenspiel26sind. So bieten simultane Aufnahmen von EEG und EKG ein vollständigeres Bild der Interaktion zwischen dem Gehirn und das Herz, das ist besonders wichtig bei Epilepsie, da Anfälle lebensgefährlichen kardialen Dysfunktion hervorrufen können.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig1.jpg"> Abbildung 1: Chirurgische Instrumente für das Verfahren erforderlichen. (1) chirurgische Klinge #15; (2) Skalpell Griff #3; (3) Adson Pinzette; (4) Olsen-Hegar Nadelhalter; (5) feine Schere; (6) Dumont #7 Zange; (7) Michel Wunde Clips; (8) Crile-Wood Nadelhalter; (9) Mikro Bohrer mit 0,8 mm; Elektro-Trimmer (10) . <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig2.jpg"> Abbildung 2: Vorbereitung der Elektrodendurchmessers für die Implantation. (A) Beispiel für eine 10-Sockel weibliche Nanoconnector (d. h. Elektrode). (B) die Elektrode in die Tischplatte Schraubstock mit den Drähten für EEG und EKG eingepflanzt werden umgeklappt. Die Kabelfarben sind angegeben. Die restlichen Drähte, die oben genannt sind, werden abgeschnitten. Der Inset zeigt eine vergrößerte Ansicht der die Drähte aus der Elektrode. (C) markieren den blauen Draht der ECG um anzugeben, wo die Isolierung abzustreifen. (D) mittels einer Skalpellklinge die Kabelisolierung enthüllt die silbernen Fäden im Inneren abzustreifen. (E) die endgültige Konfiguration der vorbereitete Elektrode, zeigt die getrimmte EEG Drähte und die abgespeckte ECG Drähte mit dem Klebeband oben eingehalten werden. Der Inset zeigt eine vergrößerte Ansicht des Klebebandes und die Drähte aus der Elektrode. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig3.jpg"> Abbildung 3. Chirurgische Befestigung der Elektroden an den Schädel. (A) Beispiel für eine Maus mit den Seiten rasiert (durch Pfeile angedeutet) für EKG Draht Implantation. (B) Abschied des Fells zwischen den Augen und Ohren einen Weg für Schnitt machen. (C) mittels Skalpell einen Kopfhaut-Schnitt zu machen. (D) der Kopfhaut Einschnitt. (E) Beispiel für die vier Markierungen auf den Schädel verwendet, um Bohrungen zu zeigen. (F) Platzierung der Elektroden auf dem Schädel nach dem Bohren der Löcher Grat. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig4.jpg"> Abbildung 4. Tunnelbau und Implantation der ECG Drähte. (A) Beispiel für ein Polyethylen-Rohr, das auf etwa 6 cm geschnitten und an einem Ende zur subkutanen Tunnel Erleichterung abgeschrägt wurde. (B) Tunneling subkutan mit dem Polyethylen-Rohr am seitlichen Schnitt Standort ab. (C) Fütterung des ECG-Drahts von der Elektrode am Kopf durch das Rohr. (D) ziehen den Draht straff nach dem Entfernen der Röhre. (E) zuweisen einer Naht unisoliert freigelegten Teil des ECG Drahtes um es auf das darunter liegende Gewebe zu fixieren. (F) Schließung der Seite Schnitt mit einer Wunde-Clip. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig5.jpg"> Abbildung 5. Implantation die EEG-Drähte. (A) greifen das rote Kabel des EEG und horizontal in den Grat Loch in den Schädel, folgende Platzierung des schwarzen Erdungskabel. (B) die endgültige Konfiguration der Nanoconnector und Drähte, die nach der Implantation. (C) schematische anzeigen Platzierung der bilateralen EEG und EKG Kabel, sowie Referenz (REF) und Erde (GND) Drähte. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig6.jpg"> Abbildung 6. Schließen den Kopf Schnitt. (A) Anwendung der zahnärztlichen Zement um die Basis der Elektrode kaudal beginnend und Rostral voran. (B) Beispiel für die dental Zement Kappe rund um die gesamte Nanoconnector und Drähte, unmittelbar vor der endgültigen Schließung des Schnittes. (C) Beispiel für die endgültige versiegelten Schnitt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig7.jpg"> Abbildung 7. Aufzeichnung von video-EEG-EKG-Signale. (A) Beispiel einer kabelgebundenen Maus während einer Aufnahme. (B) Schaltplan zeigt die Konfiguration für das System in Vivo tethered-Video-EEG-EKG-Aufzeichnung. Die Verdrahtung von einem 10-poligen männlichen Nanoconnector, die Stecker in die weibliche Nanoconnector auf dem Schädel eingepflanzt ist an weibliche 1,5 mm Kabel gelötet, die ein 12-Kanal isoliert Bio-Potenzial-Pod-Schnittstelle verbunden sind. Diese Hülse wird dann über ein serial-Link-Kabel mit einen digitalen Kommunikations-Modul (DCOM), verknüpft die Übertragungen Daten Schnittstelle Aufnahmeeinheit ein Signal (ACQ) digitalisiert, die mit einem Desktop-Computer mit Datenerfassungs-Software verbunden ist. Video ist auch gleichzeitig mit einer Videokamera Netzwerk außerhalb des positioniert und angrenzend an den Käfig erwor- Die Kamera ist an den Computer über eine Stromversorgung über Ethernet-smart Switch verbunden. (C) repräsentative Spuren des typischen EEG und EKG signal-Daten mit den folgenden Filtern angewendet: 60-Hz-Kerbe, 75 Hz Low-0,3 Hz Hochpass-Bandfilter für EEG; und ein 3-Hz High-Pass-Filter für EKG. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig8.jpg"> Abbildung 8: Analyse der EEG-Signale. (A) ein EEG-Ablaufverfolgung zeigt einen repräsentativen spontanen Anfall in einem Kcna1–/– Maus. ()B) Grundstück von Zeitdauern jeder Anfall beobachtet während der 24-h-Aufnahme-Session in der Kcna1–/– Maus. Die Balken entsprechen den Mittelwert ± Standardabweichung. (C) Peri-iktalen Spektrogramm zeigt die Frequenz und Leistungsdichte, vor, während und nach der repräsentativen Machtergreifung. (D) Vergleich der relativen Leistung in jedem Frequenzband EEG während der Pre- und Post-iktalen zeigt eine Zunahme der relativen Delta macht und sinkt in Theta, Alpha, Beta und Gamma macht. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57300/57300fig9.jpg"> Abbildung 9. Analyse der ECG Signale. (A) eine Probe ECG Spur von einer Kcna1–/– Maus zeigt normale Sinusrhythmus vor einer ventrikulären Wärmeleitung-Block, der manifestiert sich als eine P-Welle, der nicht von einem QRS gefolgt Komplex. R-R Intervall, P-Welle und QRS-Komplex sind als Referenz gekennzeichnet. ()B) einem repräsentativen Grundstück einer R-R Intervall Serie entnommen die EKG-Aufzeichnung von der Kcna1–/– Maus zeigen die Schwankungen in der Zeit zwischen Schlägen. Die rote Linie zeigt die niedrige Frequenz Trend-Komponenten, die aus der R-R-Intervall-Serie nach detrending entfernt bekommen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57300/57300fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="4">Herzschläge übersprungen / h</td>
			<td colspan="6">Herzfrequenz-Variabilität (HRV)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Zeitbereich</td>
			<td colspan="3">Frequenzbereich</td>
		</tr>
<tr>
<td>HR</td>
			<td>SDNN</td>
			<td>RMSSD</td>
			<td>LF</td>
			<td>HF</td>
			<td rowspan="2">LF/HF-ratio</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Schläge/min)</td>
			<td>(ms)</td>
			<td>(ms)</td>
			<td>(%)</td>
			<td>(%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.84</td>
			<td>736.8</td>
			<td>2.4</td>
			<td>3.2</td>
			<td>52,27</td>
			<td>46,38</td>
			<td>1,127</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Quantifizierung der übersprungenen Herz schlägt, Herzfrequenz (HF) und Herzfrequenz-Variabilität (HRV) in einer Kcna1–/– Maus. Die folgenden Zeit Domäne Maßnahmen der HRV gegeben: Standardabweichung der Beat-to-Beat-Intervallen (SDNN) und die Wurzel Mittel der Quadrate aufeinander folgenden Schlag-zu-Schlag-Unterschiede (RMSSD). Im Frequenzbereich, HRV Folgendes gezeigt werden: Niederfrequenz macht Prozentsatz (LF %); Hochfrequenz Strom Prozentsatz (HF %); und das Verhältnis von niederfrequenten Leistung anzutreiben Hochfrequenz (LF/HF-Ratio).

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Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erfassung von Gehirn und Herz Bio-Signale bei Mäusen mit gleichzeitiger Video Elektroenzephalographie (EEG) und Elektrokardiographie (EKG). Wir beschreiben auch Methoden, um die daraus resultierende EEG-EKG-Aufnahmen für Anfälle, spektrale EEG, Herzfunktion und Herzfrequenz-Variabilität zu analysieren.

Gleichzeitige Video-EEG-EKG Monitoring Neurocardiac Dysfunktion in Mausmodellen der Epilepsie zu identifizieren

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

simultaneous-video-eeg-ecg-monitoring-to-identify-neurocardiac

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

25.2K Aufrufe.  Louisiana State University Health Sciences Center. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erfassung von Gehirn und Herz Bio-Signale bei Mäusen mit gleichzeitiger Video Elektroenzephalographie (EEG) und Elektrokardiographie (EKG). Wir beschreiben auch Methoden, um die daraus resultierende EEG-EKG-Aufnahmen für Anfälle, spektrale EEG, Herzfunktion und Herzfrequenz-Variabilität zu analysieren.

Serie: Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Forschung

Genetik

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Herstellung von rAAV9 überexprimiert oder Sturz Gene in Mäuseherzen

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome editing, embryonic stem (ES) cell-based gene-targeting technology does not have these shortcomings and is widely used to modify animal/mouse genome ranging from large deletions/insertions to single nucleotide substitutions. Notably, identifying the relatively few homologous recombination (HR) events necessary to obtain desired ES clones is a key step, which demands accurate and reliable methods. Southern blotting and/or conventional PCR are often utilized for this purpose. Here, we describe the detailed procedures of using those two methods to identify HR events that occurred in mouse ES cells in which the endogenous Myh9 gene is intended to be disrupted and replaced by cDNAs encoding other nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). The whole procedure of Southern blotting includes the construction of targeting vector(s), electroporation, drug selection, the expansion and storage of ES cells/clones, the preparation, digestion, and blotting of genomic DNA (gDNA), the hybridization and washing of probe(s), and a final step of autoradiography on the X-ray films. PCR can be performed directly with prepared and diluted gDNA. To obtain ideal results, the probes and restriction enzyme (RE) cutting sites for Southern blotting and the primers for PCR should be carefully planned. Though the execution of Southern blotting is time-consuming and labor-intensive and PCR results have false positives, the correct identification by Southern blotting and the rapid screening by PCR allow the sole or combined application of these methods described in this paper to be widely used and consulted by most labs in the identification of genotypes of ES cells and genetically modified animals.

Here, we present a detailed protocol for identifying homologous recombination events that occurred in mouse embryonic stem cells using Southern blotting and/or PCR. This method is exemplified by the generation of nonmuscle myosin II genetic replacement mouse models using traditional embryonic stem cell-based homologous recombination-mediated targeting technology.

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) are a rigorous method for studying mammalian development and disease. Our laboratory has developed several GEMMs of prostate cancer (PCa) that lack expression of one or multiple tumor suppressor genes using the site-specific Cre-loxP recombinase system and a prostate-specific promoter. In this article, we describe our method for necropsy of these PCa GEMMs, primarily focusing on dissection of mouse prostate tumors. New methods developed over the last decade have facilitated the culture of epithelial-derived cells to model organ systems in vitro in three dimensions. We also detail a 3D cell culture method to generate tumor organoids from mouse PCa GEMMs. Pre-clinical cancer research has been dominated by 2D cell culture and cell line-derived or patient-derived xenograft models. These methods lack tumor microenvironment, a limitation of using these techniques in pre-clinical studies. GEMMs are more physiologically-relevant for understanding tumorigenesis and cancer progression. Tumor organoid culture is an in vitro model system that recapitulates tumor architecture and cell lineage characteristics. In addition, 3D cell culture methods allow for growth of normal cells for comparison to tumor cell cultures, rarely possible using 2D cell culture techniques. In combination, use of GEMMs and 3D cell culture in pre-clinical studies has the potential to improve our understanding of cancer biology.&#160;

We show a method for necropsy and dissection of mouse prostate cancer models, focusing on prostate tumor dissection. A step-by-step protocol for generation of mouse prostate tumor organoids is also presented.

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...