이 프로토콜은 단일 밀도 그라데이션을 사용해야 하므로 보다 복잡한 기존 islet 격리 방법에 비해 노동 집약적이고 비용 효율이 훨씬 낮습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 효소가 췌장에 직접 전달되어 조직 소화가 향상되고 배회 수율이 증가한다는 것입니다. 먼저 마우스의 팔다리를 supine 위치에 테이핑하고 70%에탄올로 바디를 분사합니다.
커버글래스 집게와 구부러진 수술 용 가위를 사용하여 약 3센티미터의 수평 복부 피부 절개를 하고 피부를 열어 복부 벽을 노출시합니다. 췌장을 완전히 노출시키고 해부 현미경 아래에 마우스를 배치하기 위해 복부 복막에 3 ~ 4 센티미터 수직 절개를합니다. 간 엽을 우월하게 밀어 창백한 분홍색 튜브로 나타나는 담관을 노출시키고 내장을 오른쪽 요추와 장강 부위에서 복강 오른쪽으로 부드럽게 이동하여 담관과 간 동맥을 노출시합니다.
Schwartz 마이크로 세정제를 사용하여 가능한 한 간과 가까운 일반적인 담관을 조심스럽게 고정하고 십이지장 유두에 위치하고 췌장 덕트와 일반적인 담관의 조합에 의해 형성된 바터의 암풀라를 식별합니다. 마이크로 Adson 집게를 사용하여 일반적인 담관을 당기려면, 갓 준비된 콜라게나아제 P 용액 3밀리리터를 포함하는 3밀리리터 주사기에 부착된 30 게이지 반인치 바늘을 배의 길이의 약 1/4동안 용기에 평행하게 밀어넣는 바터의 암풀라에 삽입한다. 바늘이 제자리에 있으면 마이크로 Adson 집게로 바늘을 안정시키고 천천히 꾸준히 콜라게나아제 P 용액 3 밀리리터를 덕트에 주입하십시오.
주사는 췌장의 머리, 목, 바디 및 꼬리 영역이 완전히 팽창되는 경우에 성공한 것으로 간주됩니다. 암풀라에 적절한 입력과 일반적인 담관의 캐누레이션은 성공적인 소화 수확에 매우 중요합니다. 덕트 벽을 관통하면 격리의 효능이 줄어듭니다.
곡선 및 마이크로 Adson 집게를 사용하여 비장에서 시작하여 위장과 십이지장을 따라 계속 팽창 된 췌장을 조심스럽게 꺼냅니다. 그런 다음 3 밀리리터의 얼음 차가운 콜라게나아제 P 용액을 포함하는 50 밀리리터 소화 튜브에 췌장을 놓습니다. 섬을 수확하려면 먼저 미세 수술 가위를 사용하여 췌장을 3~5초 간 자른 후 12~13분 동안 분당 100~120회전에서 37도의 수수욕조에 튜브를 배치합니다.
인큐베이션의 끝에서, 부드럽게 미세 모래 와 같은 췌장 조직 입자에 의해 확인된 바와 같이 용액이 균질 될 때까지 조직을 중단하기 위해 약 30 초 동안 튜브를 흔들어. 조직이 소화되는 즉시 튜브를 얼음 위에 놓고 40 밀리리터의 얼음 콜드 스톱 용액을 추가하여 효소 반응을 종료합니다. 펠릿을 부드럽게 방해한 후, 스윙 버킷 원심분리기에서 소화된 조직을 스핀다운한 다음, 세척당 20밀리리터의 신선한 스톱 용액을 가진 2개의 원심분리기가 있습니다.
마지막 세척 후, 마지막 세척 후, 3 개의 추가 세척에 대 한 얼음 차가운 HBSS의 40 밀리 리터에 펠 릿을 다시 중단, 마지막 세척 후 실온 밀도 그라데이션 솔루션의 5 밀리 리터에 펠 릿을 다시. 용액이 균질화 될 때까지 튜브를 저속으로 잠시 소용돌이로 간결하게 한 후 실내 온도 밀도 그라데이션의 5 밀리리터를 튜브에 추가합니다. 이제 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 10 밀리리터의 실온 HBSS를 드롭 와이즈 방식으로 튜브에 부드럽게 천천히 추가하여 그라데이션의 형성을 허용하고 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 밀도 그라데이션 분리에 의해 세포 집단을 격리시킵니다.
원심분리의 끝에서, 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 차가운 HBSS를 사용하여 밀도 그라데이션과 HBSS 사이의 섬 층의 5~10 밀리리터를 수집합니다. 섬들을 신선한 얼음 차가운 HBSS 20 밀리리터를 포함하는 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고 스윙 버킷 원심분리기에서 원심분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄의 마지막 3밀리리터를 제외한 모든 것을 조심스럽게 흡인시키고 세척당 20 밀리리터의 신선한 HBSS로 적어도 세 번 이상 섬을 씻으십시오.
마지막 세척 후, 37섭씨 RMPI 1640 배지의 4밀리리터로 상퍼를 교체하고 튜브를 부드럽게 소용돌이어 펠릿을 빼냅니다. 즉시 100mm 페트리 접시에 섬을 붓고 다른 섬과 함께 세척을 풀링 남아있는 섬을 수집하기 위해 신선한 RPMI 1640 매체의 다섯 밀리리터로 튜브를 씻어. 그런 다음 해부 현미경과 20 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 페트리 접시의 매끄러운 표면이있는 건강한 구형 또는 직사각형 황금 갈색 섬을 선택하여 완전한 RPMI 1640 배지 10 밀리리터를 포함하는 새로운 페트리 접시로 옮깁니다.
모든 섬이 수집되면 섬섬을 멸균 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소5%를 밤새 가습공기에 넣습니다. 좋은 건강한 섬은 매끄러운 둥근 모양을 가지고 있는 것처럼 보이며 손상된 섬은 거친 가장자리를 나타낸다. 소화되지 않은 외분 조직은 외관에 반투명하고 불규칙한 모양을 보여줍니다.
콜라게나아제 P 효소의 적절한 수분 및 분포는 췌장의 비장 부분의 인플레이션에 의해 확인될 수 있다. 낮은 포도당 매체에서 하룻밤 잠복은 섬의 인슐린 분비 용량에 대한 통찰력을 허용하는 다음 날에 포도당 자극 인슐린 분비 분석섬을 프라임 할 수 있습니다.
