우리 박사 지 앤 Horng 레이 연구소의 해양 생물학과, 국립 대만 해양 대학 3 플라스 미드 구조물을 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구에 의해 그랜트 106-2311-B-197-001-과학의 부 및 기술 (대부분)에서 지원 되었다.

1입니다. 준비
<ol><li>곤충 세포 배양<ol>
<li>세포 배양의 50 mL를 준비 합니다. 이렇게 하려면 추가 항생제의 500 µ L (암포 B = 0.25 µ g/mL, 페니실린 단위/100ml, 스 = = 100 µ g/mL) 및 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS 또는 항생제) 없이 혈 청 무료 세포 배양에서의 5 mL. 참고: 사용 하기 전에 물 욕조에 30 분 동안 65 ° C에서 소 태아 혈 청을 열.</li>
		<li>Spodoptera frugiperda 를 유지 (나비목: Noctuidae), sf9 곤충 세포. 분리 ca. 25 cm2 셀 문화 플라스 크에서 세포의 80%는 플라스 크를 흔들어 하 고 가벼운 현미경 검사 법에서 확인. 다음, 새로운 25 cm2 셀 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액의 50%를 전송 하 고 실 온에서 15 분 동안 연결할 셀을 허용. 5 mL 신선한 세포 배양 매체와 매체를 대체 하 고 28 ° c.에 인큐베이터에서 성장 통로 세포 세포 성장에 따라 2 ~ 3 일 마다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 transfection 플라스 미드의 준비<ol>
<li>삽입 대상 DNA 파편 (예: Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 유전자와 그것의 삭제 구조) pDHsp/V5-그의 PCR 기반 복제 방법11. 확인 식민지에 의해 변형 된 식민지의 성장을 PCR PCR 마스터 믹스 (X 2) pDhsp-f 2/Op-IE2R 뇌관을 사용 하 여 설정 합니다. 상업적인 시퀀싱 서비스 여 플라스 미드 시퀀스를 확인 합니다. 참고: 표 1 뇌관 PCR 및 해당 구문 사용을 보여 줍니다.</li>
		<li>문화 단일 시퀀스 세균성 식민지, 200 mL 파운드 매체 포함 하에서 상기 플라스 미드 구조물 (1.2 단계)를 포함 하는 항생제 (50 µ g/mL), 각각 선택 합니다.</li>
		<li>제조 업체의 지침12에 따라 미디 플라스 미드 키트를 사용 하 여 교양된 대장균 에서 플라스 미드를 추출 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 배양 매체와 8.5 mL 혈 청 무료 세포 배양 매체의 1.5 mL를 혼합 하 여 도금 매체를 준비 합니다.</li>
	<li>악티노마이신 D (ActD) 세포 배양 세포 배양 매체의 10 mL로 ActD 주식 (1 mg/mL)의 1.5 µ L을 추가 하 여 준비 (최종 농도 = 150 ng/mL). 4 ° c.에 게</li>
</ol>2. 단백질 과도 식
<ol><li>시드 셀<ol>
<li>Sf9 셀 문화 플라스 크를 흔들어 수확, 전복 그리고 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에가 P10 피펫으로 여 hemocytometer를 10 µ L를 전송. 가벼운 현미경 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>실 온에서 15 분 동안 24-잘 접시에 각 음에 3 × 105 sf9 세포를 플레이트. 중 도금의 0.5 mL에 매체를 바꿉니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스 미드의 transfection<ol>
<li>희석 세포 transfection 시 약: 100 µ L 세럼 무료 세포 배양 매체에 혼합 1 vortexing에 의해 세포 transfection 시 약의 희석 8 µ L s.</li>
		<li>혈 청 무료 세포 배양 매체와 혼합의 100 µ L에 플라스 미드 DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의)의 2 µ g 1에 대 한 vortexing에 의해 추가 (그림 2).</li>
		<li>희석된 플라스 미드 DNA 및 희석된 세포 transfection 시 약 (210 µ L), 결합 하 고 실 온에서 30 분 동안 1 미 품에 대 한 vortexing에 의해 혼합.</li>
		<li>P1000 피 펫에 의해 셀에 dropwise DNA transfection 시 혼합물의 210 µ L를 추가 합니다. 28 ° C 5 h에서 품 어.</li>
		<li>P1000 피 펫을 사용 하 여 세포 배양 매체의 0.5 mL에 도금 매체를 바꿉니다. 24-잘 접시 테이프로 밀봉 하 고 셀을 16 h 28 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열 충격 transfected 세포: (물 표면에 떠 있는) 42 ° C 물 욕조에 접시를 넣어. 30 분 동안 열 고 28 ℃ 배양 기에 24-잘 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>단백질 발현의 탐지<ol>
<li>1 h 5 h 열 충격 후, 셀 1 x PBS 버퍼의 0.5 mL을 짧게 세 번 씻어. 참고: 9 mL 소독 ddH2O 10 x PBS 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 PBS 버퍼 PBS 버퍼 x 1 배 희석</li>
		<li>아래로 pipetting으로 SDS 로드 염료 x 1의 40 µ L로 세포를 lyse. 참고: PBS 버퍼 x 1의 30 µ L SDS 샘플 버퍼 x 4의 10 µ L를 혼합 하 여 SDS 로드 염료 x 4를 희석.</li>
		<li>10 분 열 블록에 98 ° C에서 단백질 견본을가 열 하 고 1 분 동안 스핀 다운 서쪽 오 점 분석 결과 대 한 얼음에 넣어.</li>
		<li>서쪽 오 점 분석 결과 Eslami 및 Lujan13에서 서쪽 오 점 분석 결과의 절차를 따릅니다. SDS 페이지 젤14실행: Coomassie 파란 얼룩 (각 로드 단백질 견본의 수량 잘 같은 금액은 확인 하기 위한 로딩 제어)를 받게 한 젤과 다른 서쪽에 들어서는 오 점 분석 결과, Eslami와 Lujan13 .</li>
		<li>토끼 안티-v 5 항 체 (5 mg/mL) (1: 5000 희석 농도 1 µ g/mL 작업 TBST 버퍼에서)와 염소-토끼 IgG-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 공액 (0.8 mg/mL) (1:10000 희석 작업 TBST 버퍼에서 V5 태그 융해 단백질 검출 농도 0.08 µ g/mL)입니다. 참고: Polyacrylamide 17.5%의 비율을 조정 하면 될 단백질 분자량 < 17 kDa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 안티-apoptotic 활동 분석 결과
<ol><li>유전자 유도 세포 apoptosis: 2.3 2.1에서 상기 절차를 반복. 공동 1 µ g의 플라스 미드 DNA와 pDHsp/D-rpr/플래그-그의 플라스 미드 DNA (포함 apoptosis 유도 유전자)의 1 µ g transfect [pDHsp70/V5-그의 벡터 (부정적인 제어), pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 (긍정적인 제어), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각.]. 5 h 후 열 충격 치료, 세포 생존 능력 분석 실험 (그림 2)을 수행 합니다.</li>
	<li>화학 유도 세포 apoptosis: 2.3 2.1에서 상기 절차를 반복. 2.1.2 단계에서 6 잘 플레이트의 각 음에 1 x 106 셀 sf9 플레이트. 플라스 미드 DNA의 4 µ g transfect [pDHsp70/V5-그의 벡터 (부정적인 제어), pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 (긍정적인 제어), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각.]. 5 h 후 열 충격에 16 h ActD 세포 배양 매체의 2 mL와 sf9 세포를 치료 하 고 세포 생존 능력 분석 실험 (그림 2)를 수행 합니다. 참고: 6 잘 플레이트의 한 잘 커버를 최소 볼륨 1 mL 이다.</li>
	<li>위의 안티 apoptotic 활동 분석 결과 실험, 3.1과 3.2 triplicates에 포함을 수행 합니다.</li>
</ol>4. 세포 생존 능력 분석 실험
<ol><li>3 시간 1 분 1 x PBS 버퍼의 1 mL를 추가 하 여 치료 세포를 씻어. Pipetting 1 mL 1 x PBS 버퍼 0.04 %trypan 파랑을 포함 하 여 셀을 resuspend 하 고 실내 온도에 3 분 동안 얼룩. 세포 현 탁 액 1.5 mL microtube 전송할. 참고: 1 x PBS 버퍼 및 1 mL 0.4 %trypan 블루 솔루션의 9 mL를 혼합 하 여 0.4 %trypan 블루 솔루션을 희석.</li>
	<li>P10 피 펫과 hemocytometer를 10 µ L trypan 블루 스테인드 세포 현 탁 액을 전송 하 고 가벼운 현미경 가능한 그대로 셀.</li>
	<li>통계 분석<ol>
<li>기록 된 데이터를 계산 하 고 모든 계산에 대 한 의미 ± 사 우 스 다코타 존재.</li>
		<li>Microsoft Excel과 학생의 두 꼬리 t-검정에 의해를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. P로 통계적으로 중요 한 데이터를 정의-값 < 0.05.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculoviruses+as+gene+expression+vectors.">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li><li>Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family+Baculoviridae.">Family Baculoviridae.</a> Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).</li><li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleopolyhedrovirus'+taxonomic+position.">Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position.</a> Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).</li><li>Friesen, P. D., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+baculovirus+early+gene+expression.">Regulation of baculovirus early gene expression.</a> The Baculoviruses. , 141-170 (1997).</li><li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li><li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+development+of+baculovirus+expression+vectors.">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li><li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors.">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li><li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap.">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li><li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+(IAP)+from+the+tiger+shrimp,+Penaeus+monodon.">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li><li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells.">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li><li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculoviral+IAP2+and+IAP3+encoded+by+Lymantria+xylina+multiple+nucleopolyhedrovirus+(LyxyMNPV)+suppress+insect+cell+apoptosis+in+a+transient+expression+assay.">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017)</li><li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+(IAPs).">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

열 충격 기반 pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템의 개념 처음 클레 멘 타인 외. 19948에 의해 설명 되었다. Baculoviral 유전자 발기인 (IE1)와 초파리 hsp70 의 비교는 hsp70 모기 셀10높은 효율을 했다 보여주었다. 또한, 열 충격 유도 때문 단백질 식의 타이밍은 열 충격 처리 후 정확 하 게 제어할 수 수 있습니다. 이 시스템은 다음 새우와 nucleopolyhedroviru...

두 단백질 표정 시스템 단백질 생산을 위해 일반적으로 사용 되었습니다: 원핵생물 단백질 표정 시스템 (대장균 유전자 표현 시스템) 및 진핵생물 단백질 표정 시스템. 하나의 인기 있는 진핵생물 단백질 식 시스템은 잠재 식 벡터 시스템 (BEVS)1. Baculoviruses 먼저 농업의 전세계 생물 관리 요원으로 사용 되었다 산림 해충 및. 지난 몇 년간, baculoviruses 단백질 표정 벡터도를 위한 바이오 도구로 개발 되었다. 더블-좌초 원형 DNA 및 엔벌로프된 nucleocapsids2baculoviruses의 게놈에 의하여 이루어져 있다. 날짜 하려면, seventy-eight 잠재 이상 격리 시퀀스3되었습니다. 호스트 곤충 세포에서 baculoviral 유전자 식의 시간적 cascade를 바탕으로, 유전자 전사 4 시간 계곡, 즉시 초기 지연-초기, 늦은, 그리고 매우 늦은 유전자4등으로 분류 될 수 있습니다.
매우 늦은 유전자 발기인 (즉, 다면체 또는 p10 발기인) 대상 유전자 재조합 잠재 동종 재결합에 의해 생성 하는 동안 운전 하는 데 사용 되었다 BEVSs 지정 되었다. 재조합 잠재 하 여 곤충 세포에서 외국 단백질의 표정은 포유류 단백질 (당단백질 생산에 적합 한) 포스트 번역 상 수정에서의 비슷합니다. 따라서,는 잠재 널리5,,67되었습니다. 그러나, 한 가지 한계 곤충 세포7다른 N glycosylation 통로의 존재입니다.
따라서, 새로운 잠재 식 시스템, 변이 유전자 표현 시스템 개발 되었다. 이 시스템은 곤충 세포에서 baculoviral 즉시 초기 발기인 (발기인즉-1 )의 드라이브에서 외국 유전자를 표현합니다. 이 시스템을 사용 하 여 대상 단백질 표현할 수 있습니다 즉시 즉-1 발기인의 통제에 곤충 세포에서 N glycosylation 통로 더 나은 N 연결 oligosaccharides7에 결과 수정 하는 동안. 또한, baculoviral 즉시 이른 유전자 호스트 세포 RNA 중 합 효소 II에 의해 복사할 수 있습니다 그리고 어떤 바이러스 성 요인 활성화4에 대 한 필요 하지 않습니다. 따라서, 외국 단백질 곤충 세포는 짧은 시간 내에 표현할 수 있습니다. 날짜 하려면, 과도 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 잠재 또는 외국 단백질의 기능을 분석 하는 시스템을 적용할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 변이 유전자 표정 시스템 중 하나는 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 및 OpIE1 발기인)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인을 기반으로 합니다.
그러나, 곤충 세포에서 외국 유전자의 식 저수준은 여전히 문제가 OpIE 과도 유전자 발기인 기반 식 시스템은 사용된8,,910. 따라서, 다른 변이 유전자 표현 시스템 초파리 열 충격 단백질 70 (hsp70) 유전자8,9발기인에 따라 건설 되었다. H s p 70의 발기인 baculoviral IE 발기인 곤충 세포10열 충격에 의해 유도 된 때 보다 더 효율적으로 작동 합니다. 이 시스템에서 대상 유전자는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 드라이브에서 표현 되었다. 외국 유전자 PCR 기반 복제 방법으로 일시적인 유전자 식 플라스 미드에 쉽게 복제 수 있습니다. 또한, 열 충격 유도 의해 유전자 발현에 대 한 타이밍의 제어를 수행할 수 있습니다.
이 보고서에서 우리는 접근 따르고 (apoptosis 3의 억제 물, iap3 Lymantria xylina MNPV에서에서) baculoviral 유전자의 3 개의 다른 잘림 열 충격에 기초를 둔 일시적인 단백질 식 시스템을 사용 하 여 표현 하 고 추가 안티-apoptotic 활동 분석에이 표현한 단백질을 적용 합니다. 이 시스템 수 중 외국 단백질 신속 하 게 또는 또한 다른 단백질 활동 분석 실험에 적용할 가능성을 하면서 sf9 세포에서 단백질 안티 apoptotic 활동의 평가에 적용할 추가.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>for insect cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Bioind</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 II SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10902096</td>
			<td>serum-free cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 cell culture flask</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscopy</td>
			<td>WHITED</td>
			<td>WHITED WI-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC HIT Competent Cell</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>RH618-J80</td>
			<td>Escherichia coli (DH5&#945;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L.B. Broth (Miller)</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>LBL407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Bacteriological Grade</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>AGR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>selection antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>PIE25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Gizmo Supply Co</td>
			<td>B-CNT-SLDE-V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Multidish</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher</td>
			<td>142475</td>
			<td>24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10362100</td>
			<td>cell transfectin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215;SDS Loading Dye</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>PVDF membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell system</td>
			<td>BIO-RED</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Blotting device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>6226-79-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-V5</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>V8137</td>
			<td>rabbit anti-V5 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>817072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Multidish</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher</td>
			<td>145380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 % trypan blue solution</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Symbio</td>
			<td>PPS7</td>
			<td>24 well tape ( 19 mm&#215;36 M)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of foreign genes in insect cells (sf9) for protein functional assay

변이 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 이 시스템은 과도 식 플라스 미드에 baculoviral 발기인의 통제 익스프레스 외국 유전자를 개발 되었다. 또한,이 시스템은 자체 잠재 또는 외국 단백질 기능 분석 결과에 적용할 수 있습니다. 가장 광범위 하 게 그리고 상업적으로 사용 가능한 변이 유전자 식 시스템 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인에 따라 개발 된다. 그러나, 낮은 식 수준 외국 유전자 곤충 세포에서 관찰 되었다. 따라서, 일시적인 유전자 표현 시스템 단백질 식 향상을 위한 건설 되었다. 이 시스템에서 재조합 플라스 미드는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 통제 대상 시퀀스를 포함 하도록 건설 되었다. 이 프로토콜의이 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 (6 히스티딘와 V5 epitope) 응용 프로그램 선물 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템; 이 시스템은 또한 곤충 세포에서 후보 단백질의 안티-apoptotic 활동을 평가 하기 위한 유전자 발현 뿐만 아니라 가능 하다. 또한,이 시스템 중 한 재조합 플라스 미드와 페 수 또는 두 개의 잠재적으로 기능적으로 대립 곤충 세포에서 재조합 플라스 미드를 페 공동. 프로토콜이이 시스템의 효율성을 설명 하 고이 기술의 실용적인 사례를 제공 합니다.

전체 길이 LyxyMNPV에서 Ly-IAP3의 다른 두 잘림 (BIR 및 도메인) 했다 overexpressed sf9 셀에는 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 기반 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템. pDHsp/V5-그의 초파리 열 충격 단백질 발기인, 셀룰러 transcriptional 요인과 번역 시스템 (그림 1)8 를 사용 하 여 다운스트림 유전자 발현 온도 42 ° C 조건에서 드라이?...

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Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

12.2K 조회수.  National Ilan University. 이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

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Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

연구

유전학

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms to questions surrounding insect's interactions with their host plants. Genomic resources are available for several aphid species, and with advances in the next-generation sequencing, transcriptomic studies are being extended to non-model organisms that lack genomes. Furthermore, aphid cultures can be collected from the field and reared in the laboratory for the use in organismal and molecular experiments to bridge the gap between ecological and genetic studies. Last, many aphids can be maintained in the laboratory on their preferred host plants in perpetual, parthenogenic life cycles allowing for comparisons of asexually reproducing genotypes. Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid, provides one such model to study insect interactions with toxic plants using both organismal and molecular experiments. Methods for the generation and maintenance of the plant and aphid cultures in the greenhouse and laboratory, DNA and RNA extractions, microsatellite analysis, de novo transcriptome assembly and annotation, transcriptome differential expression analysis, and qPCR verification of differentially expressed genes are outlined and discussed here.

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

The aphid Aphis nerii colonizes on highly-defended plants in the dogbane family (Apocyanaceae) and provides numerous opportunities to study plant-insect interactions. Here, we present a series of protocols for the maintenance of plant and aphid cultures, and the generation and analysis of molecular and -omic data for A. nerii.

생물 학적 문화와 진딧물 nerii에 유전자 발현 측정 유지: 식물 곤충 상호 작용에 대 한 비-모델 시스템

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth defects. The goal of this protocol is to quickly detect ZIKV in both human and mosquito samples. The current gold standard for ZIKV detection is quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR); reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) may allow for a more efficient and low-cost testing without the need for expensive equipment. In this study, RT-LAMP is used for ZIKV detection in various biological samples within 30 min, without first isolating the RNA from the sample. This technique is demonstrated using ZIKV infected patient urine and serum, and infected mosquito samples. 18S ribosomal ribonucleic acid and actin are used as controls in human and mosquito samples, respectively.

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

This protocol provides an efficient and low-cost method to detect Zika virus or control targets in human urine and serum samples or in mosquitoes by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method does not require RNA isolation and can be done within 30 min.

반대로 Zika 바이러스 및 내부 관리 유전자 소변, 혈 청, 그리고 모기 샘플에 대 한 분석 결과 전사 루프 중재 하는 등온 증폭 (RT-램프)

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome editing, embryonic stem (ES) cell-based gene-targeting technology does not have these shortcomings and is widely used to modify animal/mouse genome ranging from large deletions/insertions to single nucleotide substitutions. Notably, identifying the relatively few homologous recombination (HR) events necessary to obtain desired ES clones is a key step, which demands accurate and reliable methods. Southern blotting and/or conventional PCR are often utilized for this purpose. Here, we describe the detailed procedures of using those two methods to identify HR events that occurred in mouse ES cells in which the endogenous Myh9 gene is intended to be disrupted and replaced by cDNAs encoding other nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). The whole procedure of Southern blotting includes the construction of targeting vector(s), electroporation, drug selection, the expansion and storage of ES cells/clones, the preparation, digestion, and blotting of genomic DNA (gDNA), the hybridization and washing of probe(s), and a final step of autoradiography on the X-ray films. PCR can be performed directly with prepared and diluted gDNA. To obtain ideal results, the probes and restriction enzyme (RE) cutting sites for Southern blotting and the primers for PCR should be carefully planned. Though the execution of Southern blotting is time-consuming and labor-intensive and PCR results have false positives, the correct identification by Southern blotting and the rapid screening by PCR allow the sole or combined application of these methods described in this paper to be widely used and consulted by most labs in the identification of genotypes of ES cells and genetically modified animals.

Here, we present a detailed protocol for identifying homologous recombination events that occurred in mouse embryonic stem cells using Southern blotting and/or PCR. This method is exemplified by the generation of nonmuscle myosin II genetic replacement mouse models using traditional embryonic stem cell-based homologous recombination-mediated targeting technology.

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Bemisia tabaci Cytogenetic 기술을 사용 하 여 계란 수정 속도 결정

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...