이 연구는 비엔나의 도시 및 Österreichische 분야에 Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie 시장의 의료 과학 기금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드를 동물 관리 및 사용 위원회 비엔나의 의학 대학에 의해 승인 하 고 따라는 연맹의 유럽 실험실 동물 과학 협회 (FELASA)을 실시 되었습니다. 하시기 바랍니다이 프로토콜에서 설명 하는 모든 절차만 해야 참고 기관 및 정부 승인 후 뿐만 아니라 기술적으로 능숙 한 직원에 의해 수행.
1. HFD 먹인 쥐
참고: 음식 및 물 무료 12 h 명암 주기 모든 C57BL/6J 생쥐를 유지 합니다.
<ol><li>나이의 6 주, 장소 마우스, 비만 유발 하는 HFD (40-60% 지방 칼로리)에 8-12 주 동안 먹이 상체 제어 그룹 (LFD) 낮은-지방 다이어트를 하는 동안 (10% 지방 칼로리).</li>
	<li>주간 기준 생쥐의 몸 무게를 결정 합니다. 체중 곡선 HFD 먹이 그룹에서 더 높은 사면 두 그룹에서 유사한 패턴을 표시 합니다.</li>
</ol>2입니다. OGTT
참고: 경우 혈액 샘플링 시간 점 마다 15 분 OGTT 중 선택, 실험 수행 되어야 한다 병렬로 15 마우스의 최대 마우스 당 적어도 1 분 처리 시간을 위해.
<ol><li>OGTT 전날에 준비<ol>
<li>쥐 식용 수에 접근이 보장 하면서 신선한 침구와 빠른 그들 (14 h)를 테스트 하기 전에 하룻밤 새에 쥐를 전송 (예를 들어, 오후 6 시 시작 시간 오전 8시 다음날 아침에 대 한 음식을 제거). 그러나 참고: 금식 쥐 하룻밤은 표준 접근 짧은 빨리 (5-6 h)는 더 쥐 (자세한 내용 참조)에 대 한 생리.</li>
	</ol></li>
	<li>(하지만 실험 전에) 실험의 날 준비<ol>
<li>20% 포도 당 용액 10 mL를 준비 (분해 D-(+)-증류수에 포도 당). 참고: 동물에 관리 되는 모든 시 약 약리학 학년 될 필요가 및 살 균.</li>
		<li>5 µ L로 각 샘플링 시간 지점과 각 마우스에 대 한 하나의 잘 작성 하 여 플라즈마 컬렉션에 대 한 96 잘 접시를 준비 NaEDTA (0.5 M EDTA, pH 8.0에서 0.9 %NaCl, RT에 저장). 실험 하는 동안 얼음에이 접시를 저장. 참고: 자세한 검사 목록에 대 한 보충 그림 1 을 참조 하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>모든 쥐의 몸 무게를 측정 하 고 (예를 들어, 마우스 1 = 1 대시, 마우스 2 = 2 대시, 등) 쥐 쉽게 구별할 수 있도록 영구 표시와 함께 그들의 꼬리를 표시 합니다.</li>
	<li>혈당 측정 및 혈액 샘플링 (그림 2)<ol>
<li>신중 하 게 날카로운가 위를 ("변형 A" 그림2에서)를 사용 하 여 꼬리 끝의 1-2 m m 잘라. 항상 용 혈 또는 혈액 포도 당 결정에 대 한 새로운 혈액 샘플을 채취 하기 전에 조직 액으로 오염 방지 하려면 혈액의 첫 번째 드롭 다운을 닦아내십시오. glucometer와 함께 (= 시간 포인트 0) 기저 혈액 포도 당 수준 측정 하기 위한 작은 혈액 샘플 (~ 3 µ L)를 그립니다. 주의: 확인 하 고는 glucometer에 테스트 스트립의 충전 수를 조정 합니다. 참고: 대체 혈액 샘플링 방법으로 닉 마우스의 측면 꼬리 정 맥 날카로운 메스 칼 날 ("변형 B" 그림2에서). 측면 꼬리 정 맥 보통 여러 샘플에 대 한 꼬리의 기지에 쪽으로 이동 하는 꼬리 끝에서 꼬리의 길이 따라 약 1 / 3에 액세스 합니다. 현지 마 취 크림의 사용을 권장 합니다. 적어도 30에 대 한 부드러운 조직에 손가락 압력을 적용 하 여 혈액의 흐름을 중지 s 동물의 감 금 소에 반환 되기 전에.</li>
		<li>신선한 세관 (세관 수평 유지)를 사용 하 여 혈액 샘플 (약 30 µ L)를 수집 합니다. 모 세관 튜브 끝의 상단에 피 펫 팁으로 신중 하 게 공기 방울을 피하고 있는 동안 96 잘 접시의 우물에 수집 된 혈액을 추진 한 피 펫을 사용 하 여 모 세관 튜브를 비어 있습니다. 한 번에 하나씩 모든 마우스-이 절차를 반복 합니다. 참고: 혈액, 수집 또는 수집의 드롭 올바른 볼륨 (예를 들어, 30 µ L)으로 조정 하는 피 펫을 사용 하는 모 세관 튜브를 통해 혈액 컬렉션에 대 한 대안 혈액 파라핀 필름과 피펫으로에 꼬리에서 그것은 EDTA 솔루션으로. 엄격 하 게 하지 마십시오 혈액 또는 glucometer 테스트 스트립, 석유 젤리의 접촉을 그것 이후 포도 당 및 인슐린 측정에 영향을 미칠 수 있습니다. 주의:는 OGTT는 마우스에 대 한 매우 스트레스: 마른 쥐 잃을 수 있다 약 그들의 체중의 15%는 하룻밤 빠른 동안. 또한, 다른 시간 지점에서 혈액 샘플링 혈액의 상당한 손실에 지도 한다. 쉽게 혈액 샘플링, 신중 하 게 석유 젤리 mouse-tail 마사지 가능 하다. 참고: 기관 지침 설정된 기간 내 수집한 혈액의 허용 가능한 금액을 제한할 수 있습니다. 샘플링 볼륨 및 timepoints 허용 된 최대값을 초과 하지에 조정 되어야 한다. 쥐의 몸 무게 총 계산 하는 데 사용할 한다 혈액 철수 허용.</li>
	</ol></li>
	<li>몸 무게 (1 g 포도 당/kg 몸 무게, 3g/kg까지 증가 될 수이 있습니다)에 따라 포도 당 솔루션의 필요한 볼륨 계산 모든 마우스에 대 한 구강 관리를. 예를 들어 30 g의 몸 무게로 마우스 30 mg의 포도 당을 관리 하는 20% 포도 당 솔루션의 150 µ L를 해야 합니다. 참고: 마우스의 무게에 포도의 복용량을 기반 하는 표준 절차입니다. 신체 구성 데이터를 사용할 수 있는 경우 혈당의 복용량 OGTT를 계산 해야 하는 대에 따라는 엎드려 서 체 질량 (자세한 내용 참조).</li>
	<li>혈당 관리<ol>
<li>준비 everythingthat 사전에 전체 실험 기간 동안 필요 하다 (타이머, 실험 기록 시트, 포도 당 모니터와 스트립, 모세 혈관, 주사기, 포도 당 솔루션, 96 잘 접시, 메스, 계산기, 균형, 영구 마커, 벤치 서류는 팁와 장갑 플라스틱).</li>
		<li>포도 당 응용 프로그램에 대 한 단단히 아저씨에 의해 그것을 파악 하 여 마우스를 제 지. 제 지에서 왜곡에서 마우스를 방지 하 고 제대로 다시 머리를 기울이고 목 피부에 충분 한 견고를 적용 합니다. 또한 마우스 숨을 제대로 쉴 수 있는 확인 합니다. 참고: 포도 당 관리 시작 되 면 좋은 시간 관리 매우 중요 하다.</li>
		<li>조심 스럽게 먹이 바늘을 사용 하 여 위장에 직접 (단계 2.5 기준) 포도 당 솔루션을 관리할 수 있습니다. 조심 스럽게 직접 식도 쪽으로 입을 통해 먹이 바늘. 바늘을 삼 키는 마우스 허용: 바늘 전적으로 마우스의 낮은 식도/위장에 싱크. 다음에 포도 당 솔루션 (그림 3a) 주사.<ol>
<li>어떤 저항을 만났다 또는 동물 투쟁 즉시 바늘을 철회 하 고 위치를 변경할. 첫 번째 gavage 직후 타이머를 시작 하 고 1 분 간격으로 다른 모든 쥐에 포도 당을 관리. 참고: 그것은 핥 아 삼 키는, 먹이 바늘의 쉽게 삽입을 촉진 자극 마우스의 입에 한 방울 포도 당 솔루션의 먹이 바늘에서 직접 적용할 도움이 될 수 있습니다. 이 심각 하 게 동물을 다치게 수 있습니다으로 먹이 바늘을 삽입할 때에 압력을 적용 되지 않습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>15 분 후에 glucometer와 혈액 포도 당 수준을 측정 하 고 또한 걸릴 각 마우스 (2.4 단계에서에서 설명한 세부)로 혈액 샘플 (~ 30 µ L) 동일한 순서 대로 그들은 주입 했다. 참고: 시간 관리는 매우 중요 하다; 최대한 gavage에 관해서는 동일한 시간 간격을 사용 하 여 밀접 하 게 따라 합니다. 결과 수정할 수 있습니다 스트레스를 줄이기 위해 가능한 및 전체 절차 동안 최소한으로 억제 하는 제한으로 자유롭게 이동 하는 쥐를 보자. 한 손으로 꼬리를 우유와 다른 혈액을 수집 합니다.</li>
	<li>예상된 결과 (예를 들어, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 및 180 분 포도 당 행정 후에)에 따라 선택한 시간 지점에서 2.7 단계를 반복 합니다. 선택한 시간 포인트 120 분 보다 더 긴 경우에, 쥐 식 수에 액세스할 확인 합니다. 생쥐는 항상 식 수에 대 한 액세스를 확인 하십시오. 실험으로 완료 되 면 자신의 집 새 음식 및 물에 쥐를 반환 합니다. 주의:는 OGTT는 쥐에 대 한 매우 소진. 따라서는 ITT 같은 다음 대사 시험을 수행 하기 전에 적어도 일주일 기다려.</li>
	<li>실험 후 원심 g, 30 분, 4 ° C x 2500에서 혈액 샘플 분석까지-20 ° C에서 접시의 우물을 저장 하는 상쾌한 (플라즈마)를 전송 합니다.<ol>
<li>존재 하는 경우 샘플의 혈을 기록 (섹션 3 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>상용 ELISA를 사용 하 여 플라스마 인슐린 레벨 키트 ( 테이블의 자료를 참조) 결정의 키트 제조 업체의 지침에 따라. 참고: 금식 상태 물론 조사 생쥐의 신진 대사에이 분석 하는 동안 문제가 발생할 수 있습니다: 하룻밤 금식 인슐린 레벨 (0 번 포인트)은 매우 낮은 하 고 그러므로 검출 한계에 가까운. 이 문제를 방지 하려면 권장된 플라즈마 볼륨의 수량을 두 번 하 고 따라 ELISA 분석 실험의 결과 이등분 합니다. 다른 한편으로, 마우스 HFD 먹인 쥐에 (서) 특히 OGTT, 동안 인슐린 피크에 도달 하면, 인슐린 수치가 검출 한계를 초과할 수 있습니다: 샘플 희석 (예를 들어, 10 0.9 %NaCl) ELISA 분석 결과 반복 하 고. 플라즈마 샘플에 혈 판독 값의 감소의 결과로 인슐린의 저하로 이어질 수 있습니다. 저하는 시간, 온도, 샘플에서 헤모글로빈 농도에 따라 다릅니다. 감기 또는 인슐린 저하를 줄이기 위해 얼음에 항상 hemolyzed 샘플을 유지.</li>
</ol>3입니다. ITT
참고: OGTT (쥐, 혈액, glucometer, 및 석유 젤리 사용의 처리)에 대 한 설명 같은 예방 조치는 ITT 수행할 때 적용 될도 있다. 예를 들어 모든 주사 한다 실시 15 분 이내 1 분 간격으로 15 마우스 동시에 테스트 하는 경우. ITT, 모 세관 튜브와 혈액 샘플의 후속 컬렉션 선택 사항입니다.
<ol><li>실험 전에 준비<ol>
<li>빨리 쥐 쥐 식용 수에 접근이 보장 하면서 인슐린 주입 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 (예를 들어, 오전 8 시 음식 제거, 마우스 테스트 후 2-5 h).</li>
		<li>0.9%에서 인슐린 1:1,000 희석 NaCl (재고: 100 U/mL 인슐린; 작업 농도 0.1 U/mL) 20% 포도 당을 준비 하 고 (D-(+)-포도 당 솔루션에 녹아 증류수) 쥐 될 혈당 관리를. 참고: 그렇지 않으면 하룻밤 사이에 발생할 수 있습니다는 저 혈당을 피하기 위해 짧은 빠른 동물 금식 후는 ITT 수행 일반적으로 됩니다. 동물에 관리 되는 모든 시 약 약리학 학년 될 필요가 및 살 균.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스의 bodyweight 측정 하 고, 꼬리를 표시 하 고 날카로운가 위를 사용 하 여 꼬리 끝을 잘라 한 앞에서 설명한 단계 2.4에서에서 OGTT에 대 한 기저 혈액 포도 당 수준을 측정.</li>
	<li>인슐린 주입<ol>
<li>Intraperitoneally 인슐린 주사를 (0.75 U 인슐린/kg 몸 무게, 미리 계산), 아저씨 방법으로 마우스를 억제.</li>
		<li>신선한을 사용 하 여, 메 마른 27 또는 30 게이지 바늘을 불편과 어떤 주사 사이트 감염의 위험을 피하기 위해 각 동물에 대 한. 참고: 피부의 살 균 인슐린 관리, 기간을 연장할 수 있습니다 고 따라서 동물에 추가적인 장애를 발생할 수 있습니다. 따라서, 그것은 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>노출 동물의 복 부 측에 약간의 각도에서 아래로 마우스 머리 기울기. 동물의 복 부 (그림 3b)의 더 낮은 오른쪽 사분면에 메 마른 바늘 및 30 ° 각도로 경사와 함께 배치 합니다. 첫 번째 마우스 주입 후에 즉시 타이머를 시작 합니다. 참고: 낮은 복용량 ITTs (0.1 U/kg) 구체적으로 간 인슐린 감도 평가 하기 위해 수행할 수 있습니다. 관해서는 OGTT, 몸 무게에 따라 주입 볼륨 계산은 표준 절차, 복용량을 내놓고 하는 동안 상체를 신체 질량에 선호 신체 구성 데이터 사용할 수 있는 경우.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선택한 시간 지점 (예를 들어, 15, 30, 45, 60 및 90 분 후)에서 혈당을 측정 합니다. 참고: 인슐린 쥐13에서 ~ 10 분의 짧은 하프 타임으로, 인슐린 관리 (예를 들어, h 2 후) 후 늦은 차이 인슐린 활동의 직접적인 영향을 반영 하지 않을 수 있습니다. 20% 포도 당 솔루션 경우 마우스 된다 혈당 관리 (혈액 포도 당 수준 35 mg/dl)과 죽음의 위험에.</li>
	<li>마지막으로 점, 후 음식과 물을 듬뿍 준비 자신의 집 새에 다시 쥐를 놓습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

당뇨병 및 세계의 인구에 관련 된 질병의 높은 보급은 분자 메커니즘,19질병 치료와 예방, 해결 하는 연구에 대 한 강한 요구. 제시 프로토콜에서는 OGTT와 ITT, 전신 대사 변경의 평가 대 한 강력한 도구는의 전도 서 대사 연구에 사용 되는 강력한 동물 모델 HFD 쥐의 세대에 대 한 확고 방법을 설명 합니다. 같은 인슐린 저항. 이 문서에 소개 된 방법이 의심된 유전자, 환경 요인 뿐만 아니라 몸 전체 포도 당 대사9,10에 약물, 식이, 신체, 또는 유전자 치료의 역할을 연구 하기 유용할 수 있습니다. 제시 프로토콜 (co-)에 의해 수정 될 수 있습니다 포도 당에는 OGTT는 인슐린 분 비에 대 한 주 자극 역할을, 하는 동안 다른 macronutrients 등 호르몬 인슐린 응답2수정 하 알려진 다른 물질을 적용. 마찬가지로, ITT 프로토콜의 개별 연구 질문에 따라 다른 물질 (예를 들어, 글 루카 곤 또는 catecholamines) (co-) 응용 프로그램에서 수정할 수 있습니다. 설명된 OGTT와 ITT 프로토콜의 주요 정보는 혈액 포도 당 및 인슐린 농도; 그러나, 글 루카 곤, 지방산, 고 단백 수준 등 다른 혈액 매개 변수 뿐만 아니라 mRNA와 단백질 수준에 다양 한 대사 마커의 측정 연구의 목적에 따라 유용 하지 수도 있습니다.
조사자는 저 혈당, 인슐린 분 비, 인슐린 행동 뿐만 아니라 전반적으로 대사 표현 형 신경 내 분 비 응답 강하게 쥐10의 유전적 배경에 따라 알고 있어야 합니다. 여기, 우리가 마우스 C57BL/6J 유전 배경으로 활용 당뇨병, HFD 유도 모델 중재 하는 포도 당 인슐린 분 비 때문에 니코틴아미드 뉴클레오티드 transhydrogenase 유전자에서 자연스럽 게 발생 삭제에서에서 부분 장애를가지고 20, 인슐린 저항8,9관련 공부 비만 대 한 적합 한 모델 들을 만들고. 그러나 프로토콜은 여기에 설명 된 5 월 또한 metabolically 인슐린 저항 및 당뇨병, monogenic 장애에 또는 β-세포21, 의 화학 파괴에 따라 일반적으로의 대체 마우스 모델의 특성을 활용 22 , 23. 나이24와 같은 섹스에서 쥐에 실험 수행 추가 인슐린 감도 하락으로 쥐 나이 일치 하는 테스트를 포함 하는 실험 설계 시 주의 사항. 유전자 변이 치료 섹스25,26따라 다른 고기 발생할 수 있으므로, 그것은 서로 별도로 남녀를 조사 하는 것이 좋습니다 수도 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 혈액 샘플링 방법을 마 취, 심장 박동, 혈액 흐름, 그리고 비 생리 적인 결과10저조한 포도 당 대사에 영향을 미칠 수 있는 필요 하지 않습니다. 또는, 동맥 카 테 테 르는 혈관 샘플링, 실험 기간 동안 스트레스를 취급 하지 않고 있지만 또한 실험 동물 손실의 위험 뿐만 아니라 노력, 비용을 추가, 이식 될 수 있습니다. OGTT에 대 한 마우스는 일반적으로 금식 하룻밤 (14-18 h), 쥐, 강하게 간 glycogen 매장을 없애고 catabolic 상태를 불러 일으키. 비록이 기준선 혈액 포도 당 수준에 있는 가변성을 감소, 장기간된 빠른 신진 대사 속도 감소 하 고 인간10,27상황 달리는 마우스에서 포도 당 이용을 향상 시킵니다. 쥐의 먹이 패턴 또한 인간 행동 모방 하지 않습니다, 그것은 있을 수 있습니다 따라서 더 짧은 빠른 후는 OGTT를 수행 하는 생리. Circadian 리듬 조직의 포도 당 물질 대사28에 강한 효과가지고, 그것은 하루 중 어느 시간에 여기에 설명 된 실험을 실시 하는 고려 하는 것이 중요. 그들의 활성 기간 (어두운 단계) 동안 쥐의 대사를 조사 하기 위하여 반전된 빛 어두운 주기에 더 많은 생리 적 결과 생성 하기 위해 유용할 수 있습니다.
관리의 설명한 경로 또한 테스트 되 고 특정 가설에 따라 다양 수 있습니다. 포도의 포도 당 내성 검사 동안 구강 관리 리드 더 가변 인슐린 분 비, 위 비우는, 위장 운동 성, 호르몬 (incretins), 및 신경 입력 수정 하 고 연장 인슐린 응답2, 10. 잘 동안 설명 "incretin 효과", 내장 리드에서 포도 당의 흡수를 위장 호르몬 GLP1, 구두 포도 당 전달 인슐린 출시29potentiates 등의 출시. 이러한 효과 우회 하는 포도 당 bolus도 관리 될 수 있습니다 정 맥 (IVGTT) 또는 intraperitoneally (IPGTT). 포도 당 및 인슐린 여행 선택한 배달 경로 따라 크게 다릅니다. OGTT에 비해 포도 당의 복 관리 리드 플라스마 포도 당 수준에 증가 하 고 장기간 피크 플라즈마 인슐린 수준 지연, 하지만 더 많은 지속적인된 패션30상승 하는 동안. 마찬가지로, 정 맥 포도 당 행정 지연된 인슐린 응답31특징 이다. 더 강력한 인슐린 AUC 데이터는 OGTT 동안 얻은 인슐린 수준에 날카로운 증가 포도의 구두 전달 있을 수 있습니다에서 포도 당 대사에 변경 감지에 더 민감한 HFD 먹인 쥐30, 대 차 먹이 제안 31. intragastric와 복 납품은 동물 및 기술적 난이도 대 한 심각도 측면에서 비슷한 정 맥 행정은 일반적으로 더 어려운 뿐만 아니라 더 쥐32에 대 한 스트레스. 구강 관리 추가 창 자 루멘 또는 포도 당 배달 및 재배포33,34의 속도 영향을 줄 수 있는 복 부에 복 주사 하는 동안 오류 요금의 10-20%를 제거 합니다.
그것은 포도 당 배달의 가장 생리 적 경로, 전체 식사 또한 단백질, 복합 탄수화물, 지방, 섬유, 그리고 미 량 영양소를 포함 하는 동안만 포도 당 흡수를 위한 회계는 OGTT 제한 됩니다. OGTT 동안 표준 방법은 포도 당 복용량을 마우스의 몸 무게 기준 일반적으로 포도 당/kg 몸 무게의 1-3 g 관리35,36는 것입니다. 경우에 따라 1 g/kg 보다는 더 높은 포도 당 로드 장애인된 포도 당 내성30필요할 수 있습니다. 상체를 신체 질량 (근육, 뇌, 그리고 간), 포도 당 처리의 주요 사이트는 비례적으로 변경 되지 않습니다 동안 비만 당뇨병의 많은 마우스 모델 변경 신체 구성, 지방 질량, 특히 거 대 한 증가에 의해 특징 이다. 몸 무게를 기존의 정규화 방법은 포도 당 비만 마우스에 마른 조직 노출 비 비만 마우스에 비해 disproportionally 높은 복용량에 따라서 발생 합니다. 이 바이어스는 더 높은 포도 당 량30증가. 따라서, 최적의 포도 (OGTT) 당 뿐만 아니라 인슐린 (ITT)의 복용량 해야 수 기준으로 계산 상체를 신체 질량, 신체 구성 데이터 사용할 수37있다면. 신체 구성 평가 기술 한계 때문에 가능 하지 않으면 먹이 지는 수행 되어야 합니다 (보충 그림 2), 몸 무게에 따라 경우 최후의 수단 이어야 한다 인간의 OGTT에와 같은 고정 된 복용량을 적용 하는 동안 쥐10,,3536에서 이러한 테스트를 수행. 제시 프로토콜에서 휴대용 전체 혈액 모니터는 작은 혈액 볼륨의 여러 샘플링을 필요로 하는 OGTT와 ITT 같은 테스트에서 유리한 혈액 포도 당 수준을 측정 하 사용 되었다. 그러나,이 장치는 인간의 피를, 동적 범위를 감소 하는 데 설계 되었습니다. 또는 포도 당 수준을 측정 될 수 있다 수집된 플라즈마 샘플, 예에 의해 완벽 하 게 자동화 일상적인 실험실에서 화학 분석기. 뿐만 아니라 인슐린, C-펩 티 드 인슐린38,39달리 간장에 의해 추출 되지 않습니다 β-세포 분 비 기능에의 더 직접적인 지표로 설명된 프로토콜에 측정 수 있습니다. Gluconeogenesis를 부과 하는 경우 pyruvate 내성 시험 (PTT) 적용할 수 있습니다, 여기 설명된 프로토콜, glycemic 여행 pyruvate bolus40의 관리 후 모니터링의 또 다른 변종입니다.
OGTT와 ITT의 여기 설명된 접근 종종 포도 당 내성에 관찰된 차이 설명 하 고 어떤 후속, 더 정교한 실험은 다음 실시 한다 제안 더 제공할 수 있다 (예를 들어, hyperglycemic 클램프 또는 격리 된 독도에 연구)입니다. 요약 하자면, 우리는 HFD 유도 마우스 모델의 생성에 대 한 간단한 프로토콜을 제시 하 고 더 OGTT와 ITT, 강력한 도구 평가 vivo에서 대사 표현 형의 변경 하 고 공부에 도움이 될 수 설명 물질 대사 관련 질환 메커니즘 뿐만 아니라 소설 치료 접근.

선진국에서 비만 당뇨병 물리적인 비활동 및 가공된 식품의 과도 한 소비는 급속 한 도시 화, 산업화로 세계화에 의해 구동 됩니다 효과 전염병 차원에 도달. 비록 연구 인슐린 저항 및 그것의 공동 morbidities, 혈과 동맥 경화, 지난 십년 동안 돌기를 얻고 있다와 같은 건강 및 질병에 신진 대사를 조절 하는 복잡 한 생물 학적 메커니즘 남아 불완전 하 게 이해 여전히 방지 하 고 치료이 질병1새로운 치료 modalities에 대 한 긴급 한 필요가 있다.
그것의 counter-regulatory 호르몬 글 루카 곤과 인슐린, 세포 에너지 공급 및 다량 영양소 균형, 따라서 또한 적절 한 조직의 혈액 포도 당 농도2유지의 주 레 귤 레이 터 역할을 합니다. 다른 macronutrients, 체액 성 요인으로 신경 입력 추가 수정이 응답 하는 동안 자체 포도 당 췌 장 β-세포, 인슐린 분 비의 주요 자극 제 중 하나로 작동 합니다. 인슐린 근육 및 지방 세포에 과잉 혈액 포도 당의 확산을 촉진 및 추가 분해로 단백질-또는 지방산 합성을 각각 활성화 하 여 결과적으로 먹이 상태 근육 프로세스를 트리거합니다. 또한, 인슐린 gluconeogenesis를 억제 함으로써 간 포도 당 출력을 억제 합니다. 만성 과도 한 에너지 소비와 메타 염증으로 이어질 hyperinsulinemia 주변 인슐린 저항 인슐린 수용 체 식으로 변경 따라서 장애인 인 하류 신호 통로에 다운 레 귤 레이 션 때문 인슐린 중재 하는 포도 당 처리 뿐만 아니라 간 포도 당 생산3,4,,56의 부족 한 억제에 감도.
질병의 유전, 영양, 또는 실험적인 유도 동물 모델의 광범위 인슐린 저항 및 당뇨병의 동반 질환7의 다양 한 형태의 분자 메커니즘 연구를 우수한 도구 수 입증 된 . 대표적인 예는 특징 조합에서 증가 식이 섭취로 인해 급격 한 체중 증가 인슐린 저항8, 의 결과로 감소 신진 대사 효율, 널리 사용 되 고 잘 설립 HFD 유도 마우스 모델은 9. 단식 혈액 포도 당 및 인슐린 수치에 상승 인간과 동물 모델에서 혈당 관리를 장애 허용 오차 있습니다 인슐린 저항의 자주 사용된 지표 및 포도의 다른 조직의 변경 대사입니다. 모니터링 혈액 포도 당 및 인슐린 수치 또는 자극 후 기저 상태에 따라서 쉽게 접근할 수 있는 정보입니다.
현재 프로토콜 설명 두 자주 사용된 방법, 구두 포도 당 내성 검사 (OGTT) 및 인슐린 저항 테스트 (ITT), 대사 표현 형의 특성을 조사 하는 유용한 HFD 먹인 쥐의 생성 포도 당 대사에 변경입니다. 우리는 세부 사항에, 시간이 지남에 구두로 관리 포도 당 부하 및 인슐린 분 비의 처리를 평가 OGTT 설명 합니다. 또한, 우리는 ITT 인슐린 응답을 bolus로 혈액 포도 당 농도 모니터링 하 여 전신 인슐린-행동 조사를 수행 하는 방법에 지침을 제공 합니다. 이 문서에서 설명 하는 프로토콜 잘 설립 하 고 여러 연구10,,1112에 사용 되었습니다. 약간의 수정 성공을 증가 하는 데 도움이 될 수 있습니다, 뿐만 아니라 실험적인 디자인 및 데이터 분석으로 유용한 힌트 잠재적인 함정을 피하기 위해에 대 한 지침을 제공 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 몸 전체 포도 당 대사와 인슐린 저항 등의 관련된 질환에 유전, 약물, 식이, 및 기타 환경 요인의 영향을 조사 하기 위해 매우 강력한 도구가 될 수 있습니다. 포도 당 또는 인슐린 자극, 이외에 다른 화합물의 다양 한 개별 연구의 목적에 따라 자극을 위해 사용할 수 있습니다. 이 원고를의 범위 밖에 있지만 다른 많은 다운스트림 응용 프로그램에서 수행할 수 있습니다 그려진된 혈액 샘플의 혈액 포도 당 및 인슐린 (예를들면, 지질 및 지단백 프로필) 값의 분석 등 자세한 뿐만 아니라 신진 대사 마커 (예를 들어, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR), 서쪽 오 점 분석 및 Enzyme-Linked Immunosorbent 분석 결과 (ELISA))의 분석. 더 cytometry 교류 하 고 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) transcriptomic, proteomic, 및 metabolomic 접근 타겟이 불분명 한 분석을 위해 활용 될 수 있습니다 하는 동안 고유한 단일 세포 인구에 효과 조사 하기 위해 적용 될 수 있습니다.
전반적으로, 우리 또한 전신 대사 변경는 OGTT와 질병 병 인 공부를 위한 유용한 도구가 될 수 있는 ITT 공부 두 가지 강력한 방법을 설명 하면서 HFD 유도 마우스 모델을 생성 하는 간단한 프로토콜을 제공 하 고 특히 인슐린 저항 및 당뇨병 등 대사 관련 질환의 분야에서에서 새로운 치료를 개발.

<table><tbody><tr><td>Mouse strain: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>LFD/HFD</td></tr><tr><td>Accu Chek Performa - Glucometer</td><td>Roche</td><td>6870228</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>Accu Chek Performa - Strips</td><td>Roche</td><td>6454038</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td>OGTT</td></tr><tr><td>Actrapid - Insulin</td><td>Novo Nordisk</td><td>417642</td><td>ITT</td></tr><tr><td>Reusable Feeding Needles</td><td>Fine Science Tools</td><td>#18061-22</td><td>OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)</td></tr><tr><td>Omnifix-Fine dosing syringes</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>Sterican Insulin needle (30G x 1/3&quot;; &amp;oslash; 0.30 x 13 mm)</td><td>Braun</td><td>304000</td><td>ITT; lean mice</td></tr><tr><td>Sterican (G 27 x 3/4&quot;; &amp;oslash; 0.40 x 20 mm)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td>ITT; mice on HFD</td></tr><tr><td>96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>SP0016</td><td>OGTT</td></tr><tr><td>Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Crystam Chem</td><td>90080</td><td>OGTT</td></tr><tr><td>Rodent Diet with 60% kcal% fat</td><td>Research Diets Inc</td><td>D12492</td><td>mice on HFD</td></tr><tr><td>Rodent Diet with 10% kcal% fat.</td><td>Research Diets Inc</td><td>D12450B</td><td>mice on LFD</td></tr><tr><td>BRAND micro haematocrit capillary</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR749321</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>Vaseline - creme</td><td>Riviera</td><td>P1768677</td><td>OGTT/ITT</td></tr></tbody></table>

study of in vivo glucose metabolism in high-fat diet-fed mice using oral glucose tolerance test (ogtt) and insulin tolerance test (itt)

비만 2 형 당뇨병, 인슐린 자극 포도 당 통풍 관을 조직의 포도 당 물질 대사의 총에서는 저항이 특징인 질병의 병 인에 가장 중요 한 단일 위험 요소를 나타냅니다. 포도 당 대사에 대 한 이해에 상당한 진행에도 불구 하 고 건강과 질병의 규제의 분자 메커니즘 아래 조사 동안 남아 소설 접근 방지 하 고 당뇨병 치료는 급하다. 파생 된 포도 당 인슐린, 먹이 주 동안 세포질 단백 동화 과정의 주 레 귤 레이 터로 서 역할 하 고 따라서 혈당 균형의 췌 장 분 비를 자극 하는 다이어트는 조직의 에너지 상태를 유지 하기 위해 레벨. 만성 지나치게 트리거 메타-염증, 주변 인슐린 수용 체 관련 변경에 이르게 신호 하 고 따라서 인슐린 중재 하는 포도 당 처리에 감도 감소 시킨다. 이러한 이벤트 궁극적으로 귀 착될 감소 뿐만 아니라 높은 단식 포도 당 및 인슐린 수치에 포도 당 내성에 인슐린 저항의 중요 한 지표 역할을. 여기, 우리 세대 및 높은 지방 다이어트 (HFD)의 변화 특성에 대 한 프로토콜을 제시-다이어트 유발 된 인슐린 저항의 자주 사용 모델 생쥐를 먹이. 우리는 구두로 관리 포도 당 부하 및 인슐린 분 비에는 시간이 지남에 따라 주변 처리 모니터링 경구 포도 당 내성 검사를 (OGTT), 자세히 보여 줍니다. 또한, 인슐린 내성 검사 (ITT) 전신 인슐린 작업 모니터링을 위한 프로토콜 선물이. 함께, 이러한 메서드 및 다운스트림 응용 프로그램 강력한 도구를를 구체적으로 평가 하는 포도 당 대사에 변경으로도 쥐의 일반적인 대사 표현 형의 특성을 나타냅니다. 그들은 인슐린 저항, 당뇨병 및 비만 치료 내정간섭의 효과 테스트로 뿐만 아니라 병의 더 나은 이해를 제공의 광범위 한 연구 분야에 특히 유용할 수 있습니다.

그림 1 규정식에 쥐의 대사 형질에 대 한 도식 시간 테이블을 보여 줍니다. LFD 그룹 컨트롤 그룹으로 될 수 있습니다 약 6 주 나이, 마우스는 HFD에 배치 한다. 중요 한 것은, 몸 무게는 몸 무게 예상된 증가 관찰을 매주 결정 되어야 합니다. 어떤 종류의 스트레스 (예를 들어, 잡음 또는 공격적인 남성 행동) 몸 체중을 방해할 수 있습니다 하 고 즉시 제거 되어야 합니다. 때문에 이러한 다이어트 실험은 시간이 걸리는, outliers 자주 (예를 들어, 마우스 무게 또는 비정상적인 포도 당 또는 인슐린 수치와 쥐를 얻지 않는) 다이어트 실험을 위해 쥐의 각 코 호트 10 쥐로 이루어져야 합니다. 선택한 기간 (연구 가설 및 예상된 변경에의 시간 포인트)에 따라, 후 OGTT와 ITT 포도 당 포용 력 그리고 인슐린 활동의 평가 대 한 수행할 수 있습니다. 이 논문에서는, 신진 대사 테스트에 대 한 늦은 시간 포인트 선정 됐다.
중요 한 것은, 이러한 실험 상당한 혈액 손실 하 고 따라서 마우스에 대 한 매우 스트레스 OGTT와 ITT 사이 적어도 1 주 복구 시간 이어야 합니다. 혈액 컬렉션 볼륨 감소 (예를 들어, 추가 혈 없이 ITT를 먼저 수행 하는 경우) 인 경우이 복구 기간도 단축 되거나 생략, 동물14, 여러 피 무에 대 한 지침에 따라 15,,1617.
이 큰 연구에서 총에서 60 C57BL/6J 마우스, 쥐의 절반에서 설정 HFD 또는 LFD 6 주의 나이에 (n = 30/그룹) 및 신체 체중 증가 다이어트 16 주 동안 모니터링 했습니다. HFD의 소비 그림 4와 같이 체중에 있는 뜻깊은 증가 귀착되는. 나이의 6 주, 몸 무게 두 그룹에서 20.2 g 이었다. LFD에 쥐 보였다 일관성, 약간 관찰된 기간 동안 몸 무게 (31.2 g ± 2.7)를 증가 하는 반면 HFD에 쥐, 특히 첫 번째 주 동안 자신의 몸 무게를 증가 하 고 다이어트 16 주 후 몸 무게 최대에 도달. 비록 체중 곡선 실험 기간 동안 비슷한 패턴을 보여, 1.5-를 2 배 더 높은 몸 무게 (44.4 g ± 4.0)에 도달 했습니다 HFD 그룹의 쥐 LFD 먹인 쥐에 비해.
두 동료의 대사 표현 형 조사, OGTT (그림 5)와 (그림 6) ITT 수행 했다. 로 혈액 볼륨 작은 설치류에서 제한 됩니다, 당뇨병 인간 (glucometer)에 대 한 포인트의 케어 (POC) 분석 결과 이러한 대사 형질 실험 동안 혈당을 모니터링 하는 데 사용 되었다. 그림 2에서처럼 혈액 포도 당 모니터는 사용 하기 쉬운, 필요 단지 작은 혈액의 드롭 및 문서에 대 한 초 이내에 혈당을 표시. 그림 5 는 OGTT 동안 절대 포도 (그림 5a-b)과 절대 인슐린의 시간 과정 (그림 5c) 수준을 제공합니다. 일반적으로, 그것의 첨단을 도달 정상적인 포도 당 내성 가진 건강 한 마우스 표시 특성 급속 한 증가 혈액에 포도 당, 포도 당 도전 후 15-30 분.
이후 포도 당 통풍 관, 근육, 지방 조직, 그리고 간 조직에 의해 주로 실시 혈액 포도 당 농도의 점진적 감소에 지도 한다. 모든 실험, LFD 먹인 쥐 포도 당 허용 제어 그룹으로에 따라서 성취 예상된 신진 대사 프로필: ~ 240 mg/dl 혈액 포도 당 수준의 피크는 혈당 관리, 후 약 15 분을 즉시 도달 했다 다음 적절 한 포도 당 제거를 나타내는 포도 당 도전 후 기초 수준 약 60 분에 도달 감소. 예리한 대조에서는, HFD-쥐 ~ 320 mg/dL 혈당 약에 만족 하 고 포도 당 저항을 나타내는 포도 당의 거의 아무 처리를 보여주었다. 이미 두 그룹 간의 혈액 포도 당 수준 다 (같이이 대표) 금식 상태에서 때 초기 혈당 이상 (AUC) 곡선 아래 면적의 계산 결과 (그림 5a- 를 확인 위해 수행 되어야 합니다. b)입니다.
또한, 순환 혈액 인슐린 수준 인슐린 ELISA 시험 (그림 5c)를 사용 하 여이 모델에 기본 이상에 대 한 자세한 정보를 제공 하기 위해 결정 했다. 반면 인슐린 수치 제어 그룹에서 거의 변경 되지 않았습니다, 쥐 먹이 HFD 보여주었다 16-fold 높은 수준으로 보상 hyperinsulinemia HFD 유도 나타내는 크게 증가 인슐린 응답 뿐 아니라 제어 그룹에 비해 금식 한 시도 맞출 줄된 포도 당 제거 용량, 인슐린 저항에 의해 발생할 수 있습니다. 그러나,이 테스트 직접 인슐린 행동을 평가 하지 않습니다 고 문을 인슐린 저항에 대 한 결론을 사용할 수 없습니다-는 OGTT 결과 해석 하는 하지 유의 하십시오.
HFD 먹인 쥐에 있는 인슐린 감도 측정 하는 ITT OGTT (그림 6a) 후 1 주 수행 되었다. 이 분석 결과 혈액 포도 당 농도 인슐린 관리를 다음 정도 전신 인슐린 활동의 효율성을 나타냅니다. HFD 먹인 쥐 따라서 인슐린 저항을 제안 LFD 먹이 제어 그룹 ITT, 동안 모든 시간 시점에 비해 혈당의 손상된 감소를 보였다. ITT 결과 일반적으로 포도 당 수준, 하지만 또한 또한 초기 포도 당 아래 AUC 그림 6b에서 같이 표시 될 수 있습니다 역의 시간 과정으로 제공 됩니다. 비교 되는 그룹 (이 경우가 아니라면이 실험에서) 유사한 단식 혈액 포도 당 수준이 있다, ITT 동안 포도 당 수준은 기저 혈당의 백분율로 제시 또한 수 있습니다. 마우스에서 인슐린에 대 한 counter-regulatory 응답 활성화 혈액 포도 당 수준18~ 80 mg/dL 보다 낮을 경우: 특정 마우스 모델에서 counter-regulatory이 응답에는 결함 수 있습니다 인슐린 감도 증가로 잘못 해석 될. 동안에 HFDs 그리고 이후의 대사 phenotypic 실험, outliers 자주 발생할 수 있습니다. HFD에 무게 또는 비정상적인 단식 포도 당 및 인슐린 수치를 보여주는 그를 얻지 않는 쥐 분석에서 제외 해야 합니다. 후반 2 개에 대 한 국외 자 테스트를 수행할 수 있습니다 각 실험 그룹 별도로 (예를 들어, 그 럽 테스트)
이 연구에서 예를 들어 우리 보였다 vivo에서대사 실험의 데이터를 해석, 인슐린 저항, 포도 당 옹 졸와 다이어트 유발 된 비만 생쥐에 실시 고 정상 몸 무게로 제어 그룹에 그들을 비교. 예상 했던 대로, 거기 되었고 장애인된 포도 당 포용 력; 나이 일치 하는 컨트롤 쥐에 비해 인슐린 저항으로 일관 된 비만 생쥐에서 hyperinsulinemia 이것은 상대적으로 쉽게 수행할 수 있는 잘 설립, 신뢰할 수 있는, 시간 및 예산 친화적인 방법을 사용 하 여 적용 했다. 인슐린 레벨 뿐만 아니라 인슐린 감도, 마찬가지로 모두 OGTT와 ITT의 제시 방법에 의해 얻은, 포도 당 내성에 차이가 수 자주와 같은 더 정교한 실험을 포함 될 수 있는 연구의 다음 단계를 계획 하는 데 도움이 됩니다. hyperglycemic 또는 hyperinsulinemic 클램프로 고립 된 췌 장 독도와 실험.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56672/56672fig1.jpg"> 그림 1입니다. 도식 시간 테이블 제안된 다이어트 정권에 대 한 신진 대사 vivo에서실험. 쥐에서 HFD의 대사 효과 조사 하기 위하여 실험 그룹의 동물에 배치 됩니다 HFD 나이의 대략 6 주에 동안 컨트롤 그룹은 LFD를 받습니다. 쥐의 몸 무게 적절 한 체중 증가 평가 하는 주간을 기준으로 결정 되어야 합니다. 약 12 주 다이어트 (또는 연구 가설에 따라 선택한 시간 지점), 후 쥐의 대사 표현 형 복구 시간과 이후에 ITT의 1 주 뒤에 OGTT에 의해 평가 됩니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56672/56672fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56672/56672fig2.jpg"> 그림 2입니다. 신진 대사 실험 중 혈액 샘플링 방법. 신중 하 게 날카로운가 위를 (변형 A), 꼬리 끝의 뒤에 glucometer와 혈액 포도 당 수준의 결정 한 1-2 m m 조각 절단을 통해 혈액을 그리기 권장 반복된 혈액 샘플링이 필요한, ITT에 관해서는 OGTT와 또한 인슐린 수준 및 다른 관련 혈액 값을 결정 하는 모 세관으로 혈액의 컬렉션입니다. 또는, 혈액 (변형 B) 꼬리 정 맥 또는 동맥 도관 법 (표시 되지 않음) 하 여 샘플링 또한 수도 있습니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56672/56672fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56672/56672fig3.jpg"> 그림 3입니다. 포도 당 (a)와 복 인슐린 주입 (b)의 구강. OGTT (는) 동안 먹이 바늘과 ITT (b) 중 복 인슐린 주사를 사용 하 여 구두 포도 당 관리의 대표 이미지. 프로토콜에 대 한 자세한 내용은 참조 하십시오. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56672/56672fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56672/56672fig4.jpg"> 그림 4입니다. HFD 먹이 LFD 먹이 C57BL/6J 생쥐의 체중 증가 몸. C57BL/6J 쥐 60에 설정 했다 HFD, 또는 10 %%20 주 동안 컨트롤을 LFD. HFD에 쥐 특히 다이어트에 첫 주에에서 몸 무게에 예상된 증가 보였다, 반면 LFD 먹이 마우스 관찰된 기간 동안 거의 일정 한 몸 무게를 보여주었다. 결과 평균 ± SEM. *p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. n = 그룹 당 30. ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트 차이 대 한 테스트에 사용 되었다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56672/56672fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56672/56672fig5.jpg"> 그림 5입니다. HFD 먹이 LFD 먹이 C57BL/6J 동물에서 OGTT 수행. OGTT 동안 (는) 포도 당 수준. 하룻밤 빠른 후 포도 (mg/dL) 당 수준 구두 gavage (1 g 포도 당/kg)를 통해 포도 당 솔루션 관리 후 금식 상태 및 15, 30, 45, 및 60 분에 측정 되었다. HFD-그룹에서 포도 당 수준은 포도 당 도전 후에 뿐만 아니라 금식 상태에서 상승 했다. 15 분 지연 및 느린 후 절정에 도달 증가 감소. 결과 평균 ± SEM. *p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001. n = 그룹 당 30. 통계 분석 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트를 사용 하 여 수행 되었다. (b) 포도 당 OGTT 동안 곡선 (AUC) 지역. 초기 수정 AUC를 계산 하려면 기저 포도 당 레벨 (0 번 포인트) 모든 나중 각 마우스에 대 한 혈액 포도 당 수준을 개별적으로 취득, 개별 AUCs의 계산에서 공제 했다. 초기 포도 당 위에 AUC HFD 먹인 쥐에 포도 당 저항을 보여 줍니다. 통계 분석 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트 (포도 당 수준) 또는 학생의 두 꼬리 t를 사용 하 여 수행 되었다-테스트 (AUC). (c) OGTT 동안 인슐린 수준입니다. 인슐린 (ng/mL) 수준은 포도 당 솔루션 gavage (1 g 포도 당/kg)를 통해 구두로 관리 후 4 h 및 15, 30, 60 분의 금식 기간 후 측정 했다. HFD 먹인 쥐 혈액 인슐린 수준에 더 높은 증가 함께 포도 당 주입에 대 한 보상 뿐만 아니라, 그들은 또한 시작 하 고 제어 그룹에 비해 높은 인슐린 수치는 OGTT 끝났다. 결과 평균 ± SEM. *p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001. n = 그룹 당 30. 통계 분석 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트를 사용 하 여 수행 되었다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56672/56672fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56672/56672fig6.jpg"> 그림 6입니다. ITTs HFD 먹이 LFD 먹이 C57BL/6J 동물에서. ITT 동안 (는) 포도 당 수준. 포도 당 (mg/dL) 수치는 인슐린의 주입 후 intraperitoneally 금식 상태 및 15, 30, 45, 및 60 분에 측정 되었다 (0.75 U 인슐린/kg). ITT, 동안 HFD 먹인 쥐 높은 포도 당 수준으로 나타났다. 혈액 포도 당 수준은 했다 하지 적절 하 게 인하 HFD 먹인 쥐에서 인슐린 주사 후. 결과 평균 ± SEM. *p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001. n = 그룹 당 30. 통계 분석 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트를 사용 하 여 수행 되었다. (b) 포도 당 지역 ITT 동안 곡선 (AUC). 초기 수정된 역 AUC를 계산 하려면 기저 포도 당 레벨 (시간 포인트 0) 개별적으로 각 마우스에 대 한 모든 후 얻은 혈액 포도 당 수준에서 공제 했다. 값은 거꾸로 (곱하기-1), 개별 AUCs의 계산에 의해 따라. 때문에 OGTT 동안 HFD 먹인 쥐에서 더 높은 포도 당 수준, 기준선 AUC 했습니다 HFD 먹인 쥐 추가 제안 줄된 인슐린 감도 제어 마우스에 비해 낮은 역 수정. 통계 분석 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트 (포도 당 수준) 또는 학생의 두 꼬리 t를 사용 하 여 수행 되었다-테스트 (역 AUC). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56672/56672fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1입니다. 실험 준비를 위한 체크 리스트. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56672/Suppl_Figure1.pdf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 2입니다. ITTs는 동안 인슐린 수준. 두 그룹에서 인슐린 주사 후 플라즈마 인슐린 수준에 유사한 역학을 보여주었다 HFD 먹이 그룹 대 LFD 먹이에 ITT 동안 플라즈마 인슐린 수준. 예상 했던 대로, HFD 마우스 제어 그룹에 비해 강하게 증가 기저 인슐린 수치를 전시. 또한, HFD 먹인 쥐에서 인슐린 수준에 증가 했다 강한, 어떤 부분적으로 경우 발생할 수 있습니다 마른 신체 질량의 과대평가 의해 주입 된 인슐린의 양을 전체 신체 질량 (기존의 정규화 방식)를 기준으로 계산 됩니다. 로이 실험에서 수행 합니다. 그러나, 인슐린 응답 HFD 먹이 그룹 (부족 감소 플라스마 포도 당 수준)에서 손상 되었다, 따라서 더 강조 하는이 동물에 있는 인슐린 저항 상태. 결과 평균 ± SEM. *p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001. 통계 분석 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트를 사용 하 여 수행 되었다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56672/Suppl_Figure2.tif">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

높은 지방 다이어트를 먹이 쥐 경구 포도 당 내성 검사 (OGTT)과 인슐린 내성 검사 (ITT)를 사용 하 여 포도 당 대사 Vivo에서 의 연구

현재 문서 생성 및 다이어트 유발 된 인슐린 저항 및 비만 모델 높은 지방 다이어트를 먹이 쥐의 대사 특성에 설명합니다. 그것은 더 상세한 프로토콜 경구 포도 당 내성 검사 및 포도 당 물질 대사에서 vivo에서의 전신 변경 모니터링 인슐린 내성 검사 수행을 갖추고 있습니다.

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

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Nanyang Technological University

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Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

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67.4K 조회수.  Medical University of Vienna. 현재 문서 생성 및 다이어트 유발 된 인슐린 저항 및 비만 모델 높은 지방 다이어트를 먹이 쥐의 대사 특성에 설명합니다. 그것은 더 상세한 프로토콜 경구 포도 당 내성 검사 및 포도 당 물질 대사에서 vivo에서의 전신 변경 모니터링 인슐린 내성 검사 수행을 갖추고 있습니다.

비디오: Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

의식 억제 마우스에 인슈린 과다 - euglycemic 클램프

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

연구

의학

Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical profiles, inclusive of blood glucose levels in both the fed and fasted state, HbA1c, insulin levels, clinical history of diet, body composition, and body weight status, an assessment of normal and abnormal glycemic control can be made. Interpretation of an IVGTT is done through measurement of changes in glucose and insulin levels over time in relation to the dextrose challenge. Critical components to be considered are: peak glucose and insulin levels reached in relation to T0 (end of glucose infusion), the glucose clearance rate K derived from the slope of rapid glucose clearance in the first 20 min (T1 to T20), the time to return to glucose baseline, and the area under the curve (AUC). These IVGTT measures will show characteristic changes as glucose homeostasis moves from a healthy to a diseased metabolic state5. Herein we will describe the characterization of nonhuman primates (Rhesus and Cynomolgus macaques), which are the most relevant animal model of Type II diabetes (T2D) in humans and the IVGTT and clinical profiles of these animals from a lean healthy, to obese dysmetabolic, and T2D state 8, 10, 11.

The goal of this protocol is to present a standard method to perform intravenous glucose tolerance tests (IVGTTs) to assess glycemic control in nonhuman primates and assess their metabolic status from healthy to dysmetabolic.

정맥 당부 하 검사와 비인간 영장류의 대사 상태의 특성

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

복 포도 당 내성 검사, 폐 기능 측정 및 폐의 고정 비만 및 장애인된 대사 폐 결과에 미치는 영향 연구

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

면역학 및 감염병학

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

의 최적화 분석<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 간 지방증

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

신체 구성 및 높은 지방 연 준 쥐에서 대사 배우면 분석

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that involves measurement of blood glucose levels over time following a single intraperitoneal injection of insulin. Given that it is performed in the conscious state and blood is often collected via a tail snip, it has the potential to elicit a stress response from animals due to anxiety associated with handling and blood collection. As such, a stress-induced rise in blood glucose can occur, making it difficult to detect and interpret the primary endpoint measure, namely an insulin-mediated reduction in blood glucose. This has been seen in many mouse strains, and is quite common in diabetic db/db mice, where glucose levels can increase, rather than decrease, after insulin administration. Here, we describe a method of acclimating mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test. We find that this lowers stress-induced hyperglycemia and results in data that more accurately reflects whole body insulin sensitivity.

Stress-induced elevations in glucose levels can confound interpretation of data derived from a conscious intraperitoneal insulin tolerance test in mice. In this article, we describe a method to acclimate the mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test in order to limit stress-induced hyperglycemia.

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

다낭성 난소 증후군 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산의 평가

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

쥐에서 등칼로리 2:1 간헐적 단식의 대사 효과의 평가

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...

생물학

마우스의 고혈당 및 저혈당 클램프의 외과적 설치

Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, and adipose tissues (Type2 DM). Insulin injection treats DM patients but leads to hypoglycemia as a side effect. Cortisol and catecholamines are released to activate glucose production from the liver to recover hypoglycemia, called counter-regulatory responses (CRR). In DM research using rodent models, glucose tolerance tests and 2-deoxy-glucose injection are used to measure insulin release and CRR, respectively. However, blood glucose concentrations change persistently during experiments, causing difficulties in assessing net insulin release and CRR. This article describes a method in which blood glucose is kept at 250 mg/dL or 50 mg/dL in conscious mice to compare the release of insulin and CRR hormones, respectively.
Polyethylene tubing is implanted in the mice's carotid artery and jugular vein, and the mice are allowed to recover from the surgery. The jugular vein tubing is connected to a Hamilton syringe with a syringe pump to enable insulin or glucose infusion at a constant and variable rate. The carotid artery tubing is for blood collection. For the hyperglycemic clamp, 30% glucose is infused into the vein, and blood glucose levels are measured from the arterial blood every 5 min or 10 min. The infusion rate of 30% glucose is increased until the blood glucose level becomes 250 mg/dL. Blood is collected to measure insulin concentrations. For hypoglycemic clamp, 10 mU/kg/min insulin is infused together with 30% glucose, whose infusion rate is variable to maintain 50 mg/dL of blood glucose level. Blood is collected to measure counter-regulatory hormones when both glucose infusion and blood glucose reach a steady state. Both hyperglycemic and hypoglycemic clamps have the same surgical procedure and experimental setups. Thus, this method is useful for researchers of systemic glucose metabolism.

저자 스포트라이트: 비용 효율적인 고혈당 및 저혈당 클램프 기법을 사용하여 쥐 뇌의 혈당 항상성 조사

A hyperglycemic clamp is used for measuring insulin release with a maintained higher blood glucose concentration. A hypoglycemic clamp is for measuring glucose production induced by counter-regulatory responses. Both methods use the same surgical procedure. Here, we present a clamp technique to assess systemic glucose metabolism.

의식이 있는 쥐의 고혈당 클램프 및 저혈당 클램프

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, ...