우리는 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B GFP-α-tubulin 표현 HeLa 세포를 공유 하기 위한 동북 대학, 일본의 박사 고조 다나카에 감사. 이 작품은 DV (R00CA178188)에 NCI 그랜트와 노스웨스턴 대학에서 창업 자금 지원 되었다.

1. 더블 티 미 딘 블록 및 릴리스: 시 약 준비
<ol><li>500 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 매체와 10 %FBS, 페니실린, 스 보충을 확인 합니다.</li>
	<li>살 균 물과 aliquots-80 ° c.에 있는 매장에서 티 미 딘 100 m m 재고 확인</li>
</ol>2. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 1A)의 고정된 셀 이미징에 대 한
<ol><li>6 잘 플레이트 커버 슬립 (70% 에탄올과 UV 방사선 살 균)과 DMEM 매체의 2 mL의 우물으로 하루 1, 105 HeLa 세포 x 씨 ~ 2. 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 습도 인큐베이터에서 세포 성장.</li>
	<li>1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 철저 하 게 신선한 DMEM 미디어 (100 m m 재고, 2mm 최종 농도)에 티 미 딘의 필요한 볼륨을 혼합.</li>
	<li>티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 셀 6-우물의 각 음에 미디어 접시 및 18h에 품 어.</li>
	<li>3 일에 매체를 발음 하 고 씻고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀과 신선한 prewarmed DMEM; 한 번 9 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체에서 세포를 성장 한다.</li>
	<li>2차 티 미 딘 블록: 다시 티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 셀 6 잘 플레이트의 각 음에.</li>
	<li>또 다른 18 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>4 일에 매체를 발음 하 고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀 및 신선한 prewarmed DMEM 한 번 씻어.</li>
	<li>(제어 및 Cdt1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체에 혼합 그들이 함께 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.</li>
	<li>차단 해제 4% 커버 슬립에 셀을 수정 하 9-10 h 37 ° C에서 세포를 품 어 PFA 실시간에서 20 분 주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용.</li>
	<li>
Immunostain 셀, RT에서 10 분 동안 0.5% (v/v) 세제 permeabilizing 및 5 분의 1 x PBS로 두 번 셀을 세척 후.
	<ol>
<li>1 시간 뒤에 1% (w/v)에 1 차 항 체 (마우스 안티-α-tubulin 항 체 1:1, 000, 토끼 안티-Zwint1 항 체 희석 1:400, 및 안티-인-ɣ H2AX 희석 1:300에서 마우스에 희석)의 50 µ L로 세포를 치료 하는 RT에 대 한 1 x PBS에서 1 %BSA (w/v)으로 세포를 차단 1 x 1 h 37 oc.에 대 한 PBS에 BSA</li>
		<li>씻은 후 1 x PBS로 세포 밖으로 몇 번이 고, 실시간에 1 시간에 50 µ L의 각 커버 유리 (알 렉 사 488와 1% (w/v) BSA 1 x PBS에서 1: 250 희석에 Rhodamine 빨간색)에 대 한 2 차 항 체와 세포 치료</li>
		<li>씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, DAPI와 세포 치료 (0.1µg / mL 1 x PBS에) 실시간에서 5 분</li>
		<li>씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, 셀 분명 현미경 슬라이드에 적절 한 설치 미디어를 직면 하 고 커버 슬립을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 X 100 X 1.4 나 계획 Apochromatic DIC 기름 침수 목표와 immunostained 단백질에 대 한 셀 필요한 이미지의 품질에 대 한 필요에 따라 적절 한 카메라를 장착 하는 거꾸로 높은 해상도 confocal 현미경에 장착 된 이미지.</li>
	<li>Z-스택 소프트웨어를 사용 하 여 0.2 µ m 두께의 현미경에 적합으로 실 온에서 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>3. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 3A)의 라이브 셀 이미징에 대 한
<ol><li>하루에 1, 씨앗 약 0.5-1 x 105 HeLa 세포 안정적 DMEM 매체의 1.5 mL와 35 m m 유리 하단 요리에 mCherry H2B GFP-α-tubulin (약간 세포 유형 및 표현 하는 단백질을 기준으로 변수) 표현 하 고는 습도에 그들을 성장합니다 37 oC, 5% CO2에서 24 h에 대 한 보육.</li>
	<li>1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 셀 접시 (100 m m 티 미 딘, 2mm 최종 농도)에 미디어.</li>
	<li>18 h에 품 어.</li>
	<li>3 일에 티 미 딘을 포함 하는 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어.</li>
	<li>(제어 및 Hec1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체와 함께 그들을 혼합 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.</li>
	<li>8 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체의 1.5 ml에서 세포 성장.</li>
	<li>2차 티 미 딘 블록: 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 접시에 셀.</li>
	<li>또 다른 18 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>하루에 4, 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어. 그런 다음 셀을 성장에서 신선한 prewarmed Leibovitz의 (L-15) 중간 보충 10 %FBS 20 mM HEPES 8 h 블록에서 셀 출시를 위한 pH 7.0에서.</li>
	<li>이미 무대와 실험 온도 안정 시키기 위해 이미징 시작 하기 전에 적어도 30 분에 전환 했다는 고해상도 confocal 현미경에 설정 온도 제어 챔버에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>셀 표시 될 때까지 60 x 목적으로 밝은 분야에 초점을 맞춥니다 다음 수동으로 선택의 영역에는 무대를 구별 합니다.</li>
	<li>빛과 레이저 전원/노출, 이미지 수집 매개 변수 및 선택의 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 실험 기간을 설정 합니다. GFP (488 여기; 385 nm 방출) 및 mCherry (561 nm 여기 및 385 nm 방출) 이미지에 대 한 필터를 사용 합니다.</li>
	<li>별도로 최대 16 h 동안 펄스 전송된 빛과 형광 이미지 마다 10 분을 획득 하 여 시간 경과 실험을 수행 합니다.</li>
	<li>현미경에 적합 한 소프트웨어를 사용 하 여 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 9 h는 12 1.0 µ m 구분 된 z 비행기로 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>Mitotic 진행에 대 한 개별 셀을 추적 하는 이미지를 분석 하 고 마지막으로 소스 소프트웨어 피지/ImageJ 해당 영화를 조립.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid.">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li><li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle,+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation.">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. 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S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly.">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1,+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis.">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li><li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+procedures.">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li><li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis.">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li><li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li><li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1.">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li><li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment.">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li><li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells.">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li><li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border.">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li><li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1/Mad2.">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li><li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment.">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).</li><li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment.">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li><li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction.">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li></ol>

저자 들은 경쟁 금융 관심 선언 합니다.

이중 티 미 딘 동기화의 가장 중요 한 장점은 이러한 세포 유사 분열 염색체 맞춤, 양극의 분석 또한 활성화 한 마음으로 입력의 많은 짧은 시간 창에 mitotic 세포의 증가 샘플 크기 제공 훨씬 더 높은 효율성과 형성과 염색체 분리를 주축.
많은 규제 단백질 복합물 및 신호 통로 유사 분열을 통해 정상적인 진행을 보장에 헌신 하는 고이 과정의 규제 완화 수 있습니다 tumorigenesis. 라이브 셀 이미징 HeLa 세포 안정적으로 mCherry H2B와 GFP tubulin 그리고 대부분 제어 셀 코 (그림 3B) 후 anaphase 약 60 분 이내에 그들의 염색체 분리 이중 티 미 딘 블록 쇼에서 발표의. 다른 한편으로, Hec1 기능을 보여줍니다 대부분 셀 고르지 염색체 anaphase 발병 또는 apoptosis (그림 3C)와 오랜 기간 동안 mitotic 단계에 머물와 교란된 HeLa 세포의 세포 이미징 라이브.
초과 티 미 딘 따라서 G1/S 단계11에서 세포를 차단 S 단계에서 DNA 합성 억제. 이중 티 미 딘 블록 동기화는 가장 일반적으로 사용 되는 방법 세포 주기 및 mitotic 진행의 연구에서 하나이 방법의 제한 사항 중 일부의 중요 한 필요 합니다. 중요 한 것은, 그것은 그 화학 물질은 씻 겨 밖으로 철저 하 게 (h를 위한 7-8) 효과 되돌릴 하 고 세포를 세포 주기의 나머지 부분을 통해 정상적으로 진행 하는 것을 보장 될 필요가 있다. 셀 수 있습니다 그렇지 않으면 부적절 한 진행 하지만 유사 분열 일으키는 두 번째 주기를 입력 하지. 동기화 된 셀의 비율 단일 티 미 딘 블록으로 충분히 높은 되지 않을 수 있습니다 그리고 하나는 유사 분열의 특정 단계를 공부에 관심이 있는 경우에 특히 이중 티 미 딘 블록 동기화 된 셀의 수를 증가 하는 데 필요한 수 있습니다. 티 미 딘 치료 기간 셀 형식 생성 시간에 따라 다른 감도 때문에 낙관 되어야 한다. 예를 들어 햄스터 세포의 생성 시간 16 h 있고 최적의 동기화1711 h 티 미 딘으로 취급 됩니다. 이 연구에서 우리는 HeLa 세포에 티 미 딘과 16-18 h에 대 한 치료. 또한, 초과 티 미 딘 뿐만 아니라 DNA 종합을 방지 하지만 또한 고 수 있습니다 셀11,,1218 의 중요 한 부분을 죽 일이 손실 모니터를 지불 될 필요가 관심을 닫습니다. 이 연구에 사용 된 티 미 딘 재고 솔루션 멸 균 증류수에 준비 되어야 한다 고 세포 배양 세포 페 siRNA의 미디어를 추가 후 그것의 강 수를 방지 하 고 또한 그것의 균질 성 보장에 철저 하 게 혼합 한다 배양된 세포 주위 분포입니다.
Mitotic 진행 하는 동안 대상 mitotic 단백질의 기능을 공부, 셀 이상적으로 것으로 치료 siRNA 최저에 관심사의 단백질의 레벨 1st 티 미 딘 블록 또는 1st에서 출시 하는 동안 티 미 딘 블록, 효율적인 단백질 최저19,20,21을 얻을 하는 데 필요한 시간에 따라. 다른 한편으로, 유사 분열 동안 Cdt1 등 다기능 단백질의 역할을 연구, 그것은 G2/M 특정 소모를 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 하는 동안 siCdt1 가진 세포를 치료 하는 데 필요한. Cdt1는 DNA 복제 기원15의 라이선스에서 중요 한 선수 이다. 라이선스의 역할을 방해 하지 않고 유사 분열 동안 그것의 전문화 된 역할을 이해, Cdt1 해야 효율적으로 더블 티 미 딘 동기화를 통해 달성 될 수 있다, G2/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 다른 리조트 필요가 피 실행 하기 어려운 유사 분열 전용 섭 동 접근. 비동기 문화에서 Cdt1의 고갈 것 차례로 muddled이 단백질에 대 한 가능한 함수의 분석 유사 분열 동안 DNA 복제 근원의 라이센스의 중단으로 인해 DNA 손상 응답 유도. 따라서, 이중 티 미 딘 동기화 기술은 정상적인 g 1과 S 단계 수술 하지만 g 2와 M 단계 Cdt1 기능 부족 셀 생성 하 독특한 실험 방식을 제공 합니다. 우리의 동기화 프로토콜의 특별 한 의미 (G2/M) 유사 분열 동안 그들의 소설 기능을 공부 하는 특정 단계에서 다기능 단백질의 그것의 억제에 있다. 따라서,이 방법은 뿐만 아니라 단백질 기능을가지고 여러 다른 세포 주기 단계 뿐만 아니라 염색체 정렬, kMT 첨부 파일, 및 염색체 분리 과정 mitotic 단백질 어떤의 그의 역할을 연구 하기 유용할 것 이다.
이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 라이브 셀 이미징에 대 한 미리 따뜻하게 Leibovitz (L-15)에서 세포를 incubated 매체 화상의 시작까지 10-20 %FBS 보충. 셀 셀 유형에 따라 티 미 딘 블록에서 출시 후 가변 시간 지점에서 유사 분열을 입력합니다. 이미지 캡처 또는 고정 시작 시간 셀 유형에 따라 최적화가 필요 합니다. 라이브 셀 이미징에 대 한 전통적인 confocal 현미경 검사 법의 활용 장기 이미징 동안 photobleaching를 발생할 수 있습니다. 다른 한편으로, 높은 해상도 confocal microcopy photobleaching 효과의 최소 범위를 명확 하 고 고해상도 이미지를 제공합니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 티 미 딘 치료 기간에 티 미 딘, siRNA transfection의 타이밍 그리고 영상의 시작 타이밍의 적절 한 유실.

세포 주기에서 세포 그들의 게놈 및 확산의 정확한 복제에 대 한 높은 규제 하 고 일시적으로 제어 이벤트의 시리즈를 받 다. 포유류에서 세포 주기 interphase 및 M으로 구성 됩니다. Interphase에 구성 된 3 단계-G1, S, 및 g 2 셀 그것의 게놈을 복제 하 고 정상적인 세포 주기 진행1,2에 필요한 증가 겪 습. M-단계에서 이루어진 유사 분열 (의향, prometaphase, 분열, anaphase, 및 telophase) cytokinesis, 부모의 셀 두 유전으로 동일한 딸 세포를 생성 합니다. 그 뒤 분열 중 기 격판덮개 (분열)에 그들의 정렬 드라이브 유사 분열, 중복 된 게놈의 chromatids 압축된 (의향) 이며 조립된 mitotic 스핀 들 (prometaphase)의 microtubules 잡혀 자신의 kinetochores에 자매 들 자매 chromatids는으로 분할 하 고 반대 스핀 들 이송 기둥 (anaphase) 분리를 동등한. 2 개의 딸 세포는 걸 기반으로 수축 성 반지 (telophase 및 cytokinesis)의 활동에 의해 물리적으로 구분 됩니다. kinetochore chromatids의 centromeric 지역에서 조립 전문된 배치할 구조 이며 스핀 들 microtubules에 대 한 첨부 파일 사이트 역할. 그것의 주요 기능은 염색체 캡처, 맞춤, 운전 하 여 염색체 분리3,4의 충실도 유지 하기 위해 스핀 들 어셈블리 검사점을 중재 하는 동안 부적 절 한 스핀 들 microtubule 첨부 파일 수정에 도움이입니다.
셀 동기화의 기술은 세포 주기 진행에 관련 된 분자 구조 이벤트를 이해 하기 위한 이상적인 도구 역할을 합니다. 이 접근은 다양 한 형태의 분석, 유전자 발현의 프로 파일링을 포함 하 여 세포질 생화학 과정의 분석 및 단백질의 subcellular 지 방화의 검출에 대 한 특정 단계에서 세포 인구를 풍부 하 게 사용 되었습니다. 개별 유전자 제품의 연구 뿐만 아니라 전체 게놈 유전자 식5, 미르 식 패턴6, microarray 분석 등의 분석을 포함 하는 방법에 대 한 동기화 된 포유류 세포를 사용할 수 있습니다. 변환 규칙7, 그리고 단백질 수정8의 proteomic 분석. 동기화는 또한 세포 주기 진행에 유전자 발현 이나 단백질 노크 다운 또는 노크-아웃, 또는 화학 물질의 효과 연구에 사용할 수 있습니다.
세포 세포 주기의 여러 단계에서 동기화 할 수 있습니다. 물리적, 화학적 방법은 널리 셀 동기화에 사용 됩니다. 셀 동기화에 대 한 가장 중요 한 기준은 동기화 되도록 noncytotoxic 하 고 되돌릴 수 있습니다. 동기화 약리학 대리인에 의해 세포의 잠재적인 불리 한 세포 결과, 때문에 화학 종속 방법을 공부 하는 주요 세포 주기 이벤트에 대 한 유리한 수 있습니다. 예를 들어 hydroxyurea, amphidicolin, mimosine, 그리고로 바 스타 틴, G1/S 단계에서 셀 동기화에 사용할 수 있습니다 하지만, 그들이 억제 생화학 경로에 그들의 효력 때문에 그들은 세포 주기 검문소 메커니즘을 활성화 하 고 중요 한 죽 셀9,10일부 다른 한편으로, "티 미 딘 블록"로 알려진 성장 매체에 티 미 딘을 추가 하 여 DNA 복제의 피드백 저해 특정 포인트11,,1213에 세포 주기를 체포 수 있습니다. 또한 nocodazole와로-33069,14처리 하 여 셀 G2/M 단계에 동기화 수 있습니다. Nocodazole, microtubule 어셈블리를 방지 하는 상대적으로 높은 세포 독성. 또한, nocodazole 체포 셀 interphase 조 mitotic 미끄럼으로 돌아갈 수 있습니다. 이중 티 미 딘 블록 체포 셀 g 1/S 단계에서 블록에서 출시 후, 셀 통해 G2 및 유사 분열으로 동시 진행을 찾을 수 있습니다. 티 미 딘 블록에서 발표 하는 세포의 세포 주기의 정상적인 진행 셀 고정 또는 라이브 영상으로 높은 해상도 confocal 현미경에서 관찰할 수 있습니다. 셀 입력 하 고 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 유사 분열을 통해 진행 하는 경우에 특히 mitotic 단백질의 섭 동 효과 공부 될 수 있다. Cdt1, 다기능 단백질 DNA 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 관련 된 이며, 유사 분열15중 kinetochore microtubule 첨부 파일에 대 한 필요 이기도. 유사 분열 동안 Cdt1의 기능을 공부 하나는 복제 라이센스만 G2/M 단계 동안 특히 그것의 소모를 초래 하는 동시에 g 1 단계에 고갈의 효과 방지 하는 방법을 채택 해야 합니다. 여기, 우리는 고정 및 라이브 셀 이미징에 의해 이중 티 미 딘 블록 세포 주기의 다른 단계 동안 여러 기능을 수행 하는 단백질의 mitotic 역할을 연구 하기에 따라 상세한 프로토콜 제시.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s (1x) L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Serum reduced medium (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>319-85-070</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063 (Pen Strep)</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Dharmafect2</td><td>GE Dharmacon</td><td>T-2002-02</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>103056</td><td>Dissolved in sterile distiled water</td></tr><tr><td>Cdt1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 10</td></tr><tr><td>Hec1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 13</td></tr><tr><td>HeLa cells expressing GFP-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells expressing GFP-&amp;alpha;-tubulin and mCherry H2B</td><td>Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>F8775</td><td>Toxic, needs caution</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>D9542</td><td>Toxic, needs caution</td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;alpha;-tubulin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc32293</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Rabbit ant-Zwint1</td><td>Bethyl</td><td>A300-781A</td><td>1:400 dilution</td></tr><tr><td>Mouse anti-phospho-&amp;gamma;H2AX (Ser139)</td><td>Upstate Biotechnology</td><td>05-626, clone JBW301</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Rodamine Red-X</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>BioLite 6 well multidish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass bottom dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TiE inverted microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning disc for confocal</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 888 EM-CCD Camera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>4 wave length laser</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubation System for Microscopes</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>NIS-elements software</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combining mitotic cell synchronization and high resolution confocal microscopy to study the role of multifunctional cell cycle proteins during mitosis

연구 단계에 종속적으로 세포 주기의 다양 한 규제 이벤트의 세포 성장 및 부문에 대 한 명확한 이해를 제공합니다. 세포 인구 세포 사이클의 특정 단계에서 동기화 실험적인 노력에 매우 유용 하 게 발견 되었습니다. 치료는 상대적으로 덜 독성 화학 물질에 의해 세포의 동기화 연구 결과 세포 주기 이벤트 하 고 선택한 mitotic 단계의 특정 농축을 위한 약리 억제 약물의 사용을 통해 유리한 수 있습니다. 동기화 인간의 세포는 세포의 여러 단계에서 S 단계 및 이중 티 미 딘 블록와 M 단계 모두를 포함 하 여 주기 고 염색체 정렬에 mitotic 단백질의 기능을 공부에 대 한 절차를 공개 프로토콜 설명 하는 여기, 그리고 분리입니다. 이 프로토콜 설립된 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할을 공부 하는 데 매우 유용 했습니다. 우리의 경우에서 Cdt1, 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 대 한 중요 한 단백질의 mitotic 역할 수 수 공부 효과적으로 g 2/M-특정 Cdt1 고갈 될 수 있는 경우에. 우리는 더블 티 미 딘 동기화를 사용 하 여 g 2/M-특정 Cdt1의 고갈에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 셀 고정, 프로토콜을 설명 하 고 라이브 셀 이미징 티 미 딘 릴리스 후 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여. 방법은 하나 고정 및 라이브 셀 mitotic 세포의 큰 샘플 크기를 수 있습니다 Hec1, 복잡 한, Ndc80의 구성 요소와 같은 생리 적 및 교란 조건에서 mitotic 단백질의 기능을 분석 하는 데 유용도 분석으로 우리가 여기에 표시.

Mitotic 진행 및 셀에서 microtubule 안정성의 연구에서 출시 후 두 티 미 딘 블록 고정 Cdt1 g 1 단계에서 DNA 복제 근원의 라이선스에 포함 된다. 그것은 S 단계 저하 하지만 다시 G2/M 단계에 축적. 공부 하 고 유사 분열에서의 역할, 생 Cdt1를 사용 하 여 가장 적합 한 셀 동기화 기법, 더블 티 미 딘 블록15G/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 필요가 있다. 셀에에서 있을 때 셀 S 단계 및 시간에 의해 또한 Cdt1 기능 필요, g 1에서 복제 근원의 라이선스 오래 완료 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 직후 siRNAs와 페 했다. 9 h siCdt1 transfection와 더블 티 미 딘 블록 출시 후 Cdt1 고갈 부 럽 (그림 1B)에 의해 검증 되었다. 고정 셀 9 h 이중 티 미 딘 블록에서 릴리스 보여줍니다 대부분 세포 분열 단계에서 제어 및 Cdt1 siRNA는 후의 transfected 세포. 그러나 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 셀 10 h의 고정 제어 셀 anaphase 입력 하 고 정상적으로 예상된 (그림 1C로 그들의 염색체를 분리 하는 동안 대부분 Cdt1 siRNA 치료 셀 prometaphase 단계에서 체포 여전히는 보여준다 ). Kinetochore-microtubule (kMT) 안정성에 Cdt1 고갈의 영향을 이해 하 셀 고정 했다 9 h에서 출시 후 더블 티 미 딘 블록 뒤에 감기 치료만 안정적인 kinetochore-microtubules (kMTs)를 유지. Cdt1 고갈 세포의 kMTs는 제어 셀 (그림 1D)에 비해 감기 치료 후 상대적으로 덜 강력한. 따라서,이 방법을 사용 하 여, 관심의 mitotic protein(s)의 함수의 섭 동 후 정상적인 mitotic 세포의 진행 수 수 공부 효과적으로, 라이브 셀 이미징의 사용 없이.
그림 2 는 DNA 복제 근원의 라이선스는 하지 불안정 세포는 또한 제어 셀에서 관찰 되었다 우리의 프로토콜을 사용 하 여 G2/M 단계 Cdt1 고갈 하는 경우를 보여 줍니다. 셀 g 2/M 단계 Cdt1의 고갈; 후속 g 2 단계 phosphorylated ɣH2AX, DNA 손상에 대 한 표시자의 축적을 유도 하지 않았다 반면 비동기 문화 Cdt1 고갈의 siRNA transfection 부적절 한 DNA 복제 라이센스에 의해 유도 된 DNA 손상으로 인해 인 ɣH2AX 양성 foci의 축적을 유도 한다.
라이브 셀 이미징에 의해 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 셀에 mitotic 진행의 연구 핵 붕괴 (코), 후 (기능 mitotic 단백질에 의해 섭 동 부재)에 정상 세포 유사 분열을 입력 하 고 약 30-60 분 (그림 3B) 내에서 유사 분열에서 종료 하려면 anaphase 발병을 받 다. 하지만 RNAi 중재 최저 Hec1, 강력한 kMT 첨부 형성에 필요한 키 kinetochore 단백질의 정상적인 mitotic 진행 지연 발견 된다. 이 시나리오에서 대부분 셀 코, 후 유사 분열을 입력 하지만 anaphase 발병을 받아야 하거나 마십시오 지연 유사 분열 (그림 3C)의 몇 시간 후에 유사 분열에서 종료. 마찬가지로, localizes kinetochores 또는 함수 유사 분열 동안에 다른 단백질의 최저 RNAi 중재의 효과 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 라이브 셀 이미징 사용 하 여 효과적으로 관찰 수 있다 따라서. Mitotic 진행, 지연 및 체포의 자연 공부, 함께이 메서드를 사용 하 여 분석 될 수 있는 다른 주요 mitotic 현상의 일부 염색체 정렬, mitotic 스핀 들 형성 및 활성화 위치 및의 입을 포함는 스핀 들 어셈블리 검사점입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56513/56513fig1.jpg"> 그림 1: mitotic 진행과 더블 티 미 딘 동기화 후 고정된 셀에 kinetochore microtubules의 안정성의 분석. (A) A 셀 동기화, 고정, 및 면역 형광의 도식 적인 표현입니다. (B) 2 티 미 딘 블록에서 방출의 9 h 후 Cdt1의 최저에 대 한 서쪽 오 점. (C) 표시 mitotic 세포 면역 형광 현미경 더블 티 미 딘 블록 및 제어 (위) 또는 Cdt1 siRNA (아래) 치료에서 출시 후 9, 10 h 고정. 빨간색에서은 α-tubulin 얼룩, DNA는 그린 셀 GFP 히스톤 H2B 익스프레스. 눈금 막대 = 10 µ m. Prometaphase 및 분열 세포 노란색을 사용 하 여 표시 됩니다 및 화살촉을 각각 화이트. (D) 헬러 세포 제어 siRNA (상단 패널)과 치료 후과에서 출시 후 9 h Cdt1 고갈 (하단 패널) 후 두 티 미 딘 블록 뒤에 얼음 처럼 차가운 Leibovitz (L-15) 치료 매체 및 고정. 세포 면역-스핀 들 MT (녹색) 및 Zwint1 (빨간색)와 흑인과 백인 dna DAPI kinetochore 마커 얼룩이 있었다. 눈금 막대 = 5 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56513/56513fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56513/56513fig2.jpg"> 그림 2: G2/M 단계 Cdt1 고갈 복제 라이센스 교란 하지 않습니다. 비동기 HeLa 세포 제어 luciferase (상단 패널)로 치료 또는 cdt1 siRNAs (중간 패널) 또는 더블 티 미 딘 동기화 HeLa 세포는 2nd 티 미 딘 워시 아웃 뒤에 10 h에 고정 하는 동안 cdt1 siRNA로 치료 릴리스 (하단 패널) 후 DAPI (의사 색된 녹색)와 안티-인-ɣH2AX 항 체 (레드) 얼룩이 있었다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56513/56513fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56513/56513fig3.jpg"> 그림 3: 라이브 셀 이미징에 의해 mitotic 진행의 분석 동기화 셀. (A) A 셀 동기화 및 라이브 셀 이미징의 도식 적인 표현입니다. 헬러 세포를 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B 표현 그리고 GFP-α-tubulin 8 h S 단계 체포에서 G2/M 단계로 진행을 위한 이중 티 미 딘 블록에서 발표 했다. 라이브 이미지는 티 미 딘 블록에서 셀을 공개 하 고 그 시점에서 최대 16 시간 계속 후 8 h를 시작 하는 높은 해상도 confocal 현미경을 사용 하 여 실시 되었다. 여기은 캡처한 모든 mitotic 단백질 (B)의 섭 동 없이 제어 세포 또는 세포는 Hec1 소 단위 복잡 한 Ndc80의 (C)의 고갈에 대 한 모든 10 분 비디오에서 스틸 이미지입니다. 스케일 바 = 10 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56513/56513fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

combining-mitotic-cell-synchronization-high-resolution-confocal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K 조회수.  Northwestern University. 선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

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Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

연구

유전학

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

발생학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

생물학

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

생체공학

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial 태아

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...