Wir sind dankbar, dass Dr. Kozo Tanaka der Tohoku University, Japan für den Austausch von HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck mCherry-Histon H2B und GFP-α-Tubulin. Diese Arbeit wurde durch ein NCI Zuschuss an DV (R00CA178188) und Starthilfe von der Northwestern University unterstützt.

1. doppelter Thymidin sperren und freigeben: Reagenz Vorbereitungen
<ol><li>Machen 500 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) Medium mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin ergänzt.</li>
	<li>Machen Sie 100 mM Lager von Thymidin in sterilem Wasser oder Store in Aliquote bei-80 ° C.</li>
</ol>2. Protokoll für feste Cell Imaging der mitotischen Progression (Abbildung 1A)
<ol><li>Am Tag 1, Samen ~ 2 x 105 HeLa-Zellen in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit einem Deckglas (mit 70 % Ethanol und UV-Bestrahlung sterilisiert) und 2 mL DMEM Medium. Wachsen Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>1St Thymidin Block: am 2. Tag, mischen Sie die erforderliche Menge Thymidin in frischen DMEM Medien (100 mM Lager, 2 mM Endkonzentration).</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL Thymidin-haltigen Medien auf die Zellen in jede Vertiefung des 6-Well Platte und 18 h inkubieren.</li>
	<li>Am 3. Tag aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM; wachsen Sie Zellen in frisch vorgewärmte DMEM Medium für 9 h Zellen aus Block freizugeben.</li>
	<li>2Nd -Thymidin-Block: erneut hinzufügen 2 mL Thymidin-haltigen Medien (2 mM Endkonzentration) auf die Zellen in jede Vertiefung des 6-Well-Platte.</li>
	<li>Ein weiterer 18 h inkubieren.</li>
	<li>Am Tag 4 aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM.</li>
	<li>Verdünnte SiRNAs (Kontrolle und Cdt1) und Transfection Reagens in Serum frei Wachstumsmedium für 10 min. separat mischen sie zusammen und 20 min bei RT inkubieren Die Endkonzentration von SiRNA verwendet in jeder Transfektion betrug 100 nM. Fügen Sie das Reaktionsgemisch auf die Zellen, die aus Thymidin gewaschen worden sind.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 9-10 h von der Blockierung lösen und befestigen der Zellen auf der Abdeckung rutscht mit 4 % PFA für 20 min bei RT Achtung: PFA ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.</li>
	<li>
Immunostain Zellen, nach dem permeabilizing mit 0,5 % (V/V) Reinigungsmittel für 10 min bei RT und die Zellen zweimal mit 1 X PBS für 5 min waschen.
	<ol>
<li>Sperren von Zellen mit 1 % BSA (w/V) mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei RT gefolgt von Behandlung von Zellen mit 50 µL Primärantikörper (Maus Anti-α-Tubulin Antikörper verdünnt 1:1, 000, Kaninchen-Anti-Zwint1-Antikörper verdünnt 1: 400 und Maus, die Anti-Phospho-ɣ H2AX bei 1: 300 verdünnt) bei 1 % (w/V) BSA mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei 37 oC.</li>
		<li>Nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS dreimal, Behandlung von Zellen mit 50 µL Sekundärantikörper für jedes Cover-Glas (Alexa 488 und Rhodamine Red bei 1: 250 Verdünnungen in 1 % (w/V) BSA mit 1 X PBS-Puffer) für 1 h bei RT</li>
		<li>Nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS zweimal für jeweils 5 min., Behandlung von Zellen mit DAPI (0.1µg / mL in 1 X PBS) für 5 min bei RT</li>
		<li>Legen Sie nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS zweimal für 5 min, das Deckglas mit Blick auf Zellen an die entsprechenden Montage-Medien auf einer klaren mikroskopische Folie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bild der Zellen für die Immunostained Proteine mit 60 X oder 100 X 1,4 NA Plan-apochromatische DIC Öl eintauchen Ziel auf eine invertierte hochauflösende confocal Mikroskop, ausgestattet mit einer geeigneten Kamera als notwendig für die Qualität der Bilder erforderlich montiert.</li>
	<li>Abrufen von Bildern bei Raumtemperatur Z-Stapel von 0,2 µm Dicke mit Software für das Mikroskop nach Bedarf.</li>
</ol>3. Protokoll für Live Cell Imaging der mitotischen Progression (Abbildung 3A)
<ol><li>Am 1. Tag Saatgut ca. 0,5-1 x 105 HeLa-Zellen stabil mCherry-H2B und GFP-α-Tubulin (leicht variabel je nach Zelle Art und die Proteine, die sie zum Ausdruck bringen) in 35 mm unten Glasschalen mit 1,5 mL DMEM Medium ausdrücken und in eine befeuchtete wachsen Inkubator für 24 h bei 37 oC und 5 % CO2.</li>
	<li>1St Thymidin Block: am 2. Tag, fügen Sie 1,5 mL Thymidin-haltigen Medien, um die Zellen in der Schale (100 mM Thymidin, 2 mM Endkonzentration).</li>
	<li>18 h inkubieren.</li>
	<li>Am 3. Tag aspirieren Sie Thymidin-haltigem Medium und waschen Sie die Zellen dreimal, zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM.</li>
	<li>Verdünnte SiRNAs (Kontroll- und Hec1) und Transfection Reagens mit Serum frei Wachstumsmedium für 10 min. separat mischen sie zusammen und 20 min bei RT inkubieren Die Endkonzentration von SiRNA verwendet in jeder Transfektion betrug 100 nM. Fügen Sie das Reaktionsgemisch auf die Zellen, die aus Thymidin gewaschen worden sind.</li>
	<li>Wachsen Sie Zellen in 1,5 mL frisch vorgewärmte DMEM Medium für 8 h, Zellen aus Block freizugeben.</li>
	<li>2Nd -Thymidin-Block: Fügen Sie 1,5 mL Thymidin-haltigen Medien (2 mM Endkonzentration) auf die Zellen in der Schale.</li>
	<li>Ein weiterer 18 h inkubieren.</li>
	<li>Am 4. Tag aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal, zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM zu. Dann wachsen Zellen in frisch vorgewärmte Leibovitz ist (L-15) Medium ergänzt mit 10 % FBS und 20 mM HEPES bei pH 7,0 für 8 h, Zellen aus dem Block freizugeben.</li>
	<li>Legen Sie die Schale in die Temperatur Kontrollkammer inmitten der hochauflösende confocal Mikroskop, die bereits auf mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung zur Stabilisierung der Temperaturen auf der Bühne und experimentelle gewechselt hat.</li>
	<li>Fokussieren im Hellfeld mit Objektiv 60 X bis Zellen sichtbar sind, und klicken Sie dann manuell in die Region der Wahl der auf der Bühne zu sichten.</li>
	<li>Licht und Kraft/Laserbelichtung, Erwerb Bildparameter und Dauer des Experiments mit der Mikroskop-Bild-Datenerfassungs-Software der Wahl einrichten. Verwenden Sie Filter für GFP (488 Erregung; 385 nm Emission) und mCherry (561 nm Anregung und 385 nm Emission) Bilder zu erwerben.</li>
	<li>Führen Sie die Zeitraffer-Experiment durch gepulste Durchlicht separat zu erwerben und Fluoreszenz Bilder alle 10 Minuten für einen Zeitraum bis zu 16 h.</li>
	<li>Abrufen von Bildern zwölf 1,0 µm getrennt Z-Ebenen um 9 Uhr nach der Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block mit Software das Mikroskop nach Bedarf.</li>
	<li>Analysieren Sie die Verfolgung einzelner Zellen für mitotischen Progression Bilder zu und schließlich montieren Sie den entsprechenden Film mit den Fidschi-Inseln/ImageJ-Source-Software.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid.">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li><li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle,+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation.">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li><li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+and+miracles+of+kinetochores.">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li><li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function.">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).</li><li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases.">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li><li>Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microRNA+expression+profiles+during+the+cell+cycle+in+synchronized+HeLa+cells.">Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells.</a> BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).</li><li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly.">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1,+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis.">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li><li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+procedures.">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li><li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis.">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li><li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li><li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1.">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li><li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment.">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li><li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells.">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li><li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border.">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li><li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1/Mad2.">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li><li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment.">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).</li><li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment.">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li><li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction.">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierendes finanzielles Interesse haben.

Der wichtigsten Vorteil der doppelten Thymidin-Synchronisation ist, dass es eine höhere Stichprobengröße der mitotischen Zellen in einem kurzen Zeitfenster viele dieser Zellen in Mitose unisono bietet, wodurch auch Analysen von Chromosom Ausrichtung, bipolar Spindel-Bildung und Chromosom Segregation mit wesentlich höheren Wirkungsgrad.
Viele regulatorische Proteinkomplexe und Signalwege sind dafür normale Progression durch Mitose gewidmet und Deregulierung dieses Prozesses kann führte zu Tumorgenese. Live Cell Imaging von HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck mCherry-H2B und GFP-Tubulin und befreit die doppelte Thymidin Block zeigt, dass die meisten Kontrollzellen ihre Chromosomen bei Anaphase innerhalb von ca. 60 min nach NEB (Abb. 3 b) zu trennen. Auf der anderen Seite live Cell Imaging von HeLa-Zellen gestört, mit Hec1-Funktion zeigt, dass die meisten Zellen in der mitotischen Phase über einen längeren Zeitraum mit falsch ausgerichtete Chromosomen gefolgt von Beginn der Anaphase oder Apoptose (Abbildung 3).
Überschüssige Thymidin hemmt DNA-Synthese in der S-Phase, so blockieren Zellen am G1/S Phase11. Doppelte Thymidin-Block-Synchronisation ist, zwar die am häufigsten verwendete Methode in der Studie des Zellzyklus und mitotischen fortschreiten muss man einige Einschränkungen dieser Methode kritisch gegenüber. Wichtiger ist, muss es sichergestellt werden, dass die Chemikalie gründlich (für 7-8 h) gewaschen worden ist so dass der Effekt vollständig reversibel ist und Zellen können im weiteren Verlauf des Zellzyklus normal fortfahren. Zellen können sonst nicht den zweiten Zyklus verursacht unsachgemäße Fortschreiten aber Mitose eingeben. Der Anteil der synchronisierten Zellen möglicherweise nicht hoch genug, mit einem einzigen Thymidin-Block und ein doppelte Thymidin-Block kann erforderlich sein, die Zahl der synchronisierten Zellen, vor allem, wenn man interessiert ist, in einer bestimmten Phase der Mitose zu studieren. Die Dauer der Behandlung Thymidin muss aufgrund der unterschiedlichen Empfindlichkeit unter Zelltypen je nach Generation optimiert werden. Zum Beispiel Hamster Zellen haben 16 h der Generationszeit und mit Thymidin für 11 h für optimale Synchronisierung17behandelt. In dieser Studie behandelt wir HeLa-Zellen für 16-18 h mit Thymidin. Darüber hinaus kann überschüssige Thymidin nicht nur verhindert, dass DNA-Synthese, aber auch töten wichtige Bruchteile von Zellen11,12,18 und schließen Aufmerksamkeit muss bezahlt werden, um diesen Verlust zu überwachen. In dieser Studie verwendeten Thymidin Vorratslösung sollte in sterilem destilliertem Wasser zubereitet werden und sollte in den Zellkulturmedien seinen Niederschlag zu vermeiden, nach Medien von SiRNA hinzufügen Zellen transfizierten und auch die homogenen sicherzustellen gut durchgemischt werden Verteilung um die kultivierten Zellen.
Für das Studium der Funktion einer mitotischen Zielprotein während mitotischen Progression, die Zellen wäre idealerweise mit SiRNA, Zuschlag die Niveaus des Proteins des Interesses behandelt, entweder während der 1St -Thymidin-Block oder die Entlassung aus der 1. Thymidin-Block, je nach Zeitaufwand für effiziente Protein Knockdown19,20,21zu erhalten. Auf der anderen Seite für die Rolle des multifunktionalen Proteine wie Cdt1 während der Mitose zu studieren, ist es notwendig, die Zellen mit siCdt1 während der Freisetzung aus dem 2Nd -Thymidin-Block G2/M bestimmten Erschöpfung zu behandeln. Cdt1 ist eine kritische Spieler bei der Lizenzvergabe für DNA-Replikation Ursprünge15. Um seine spezielle Rolle während der Mitose zu verstehen, ohne seine Rolle bei der Lizenzierung zu stören, muss Cdt1 speziell auf G2/M-Phase, erschöpft sein, die durch doppelte Thymidin Synchronisierung effizient erreicht werden kann, wodurch der Bedarf an anderen Mitose-spezifische Störung Ansätze, die schwierig zu realisieren sind. Erschöpfung der Cdt1 in asynchronen Kulturen induzieren DNA Schäden Reaktion aufgrund der Unterbrechung der Lizenzierung von DNA-Replikation Origins, die wiederum die Analyse einer möglichen Funktion für dieses Protein während der Mitose durcheinandergebracht haben würde. So bietet die doppelte Thymidin-Synchronisation-Technik eine einzigartige experimentelle Herangehensweise um Zellen zu generieren, die unterzog sich eine normalen G1 und S-Phase, aber es fehlte ihm Cdt1 Funktion in G2 und M-Phase. Die besondere Bedeutung unserer Synchronisierung Protokoll liegt in der Hemmung der multifunktionalen Proteine in die konkrete Phase (G2/M), deren neuartige Funktionen während der Mitose zu studieren. Daher wird diese Methode nicht nur um die Rolle von Proteinen, die mehrere Funktionen in verschiedenen Zellzyklus Phasen haben, sondern auch, dass jede mitotische Protein in den Prozess der Chromosom-Ausrichtung, kMT Anhänge und Chromosom Abtrennung zu studieren nützlich sein.
Für das live Cell Imaging, nach der Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block Zellen inkubiert werden sollte, in vorgewärmte Leibovitz (L-15) Medium bis zum Beginn der Bildgebung mit 10-20 % FBS ergänzt. Die entsprechenden Körperzellen gelangen Mitose zu Variablen Zeitpunkten nach Entlassung aus dem Thymidin-Block je nach Zelltyp. Der Zeitpunkt des Beginns der Bildaufnahme oder Fixierung muss je nach Zelltyp optimiert werden. Für das live Cell Imaging, kann die Nutzung der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie Immunofluoreszenz während der langfristigen Bildgebung führen. Auf der anderen Seite gibt die hochauflösende konfokale Microcopy eine klare und hochauflösende Bild mit der geringsten Ausdehnung Immunofluoreszenz Effekte.
Die entscheidenden Schritte in diesem Protokoll sind die Behandlungsdauer Thymidin, richtige Auswaschung der Thymidin, das Timing von SiRNA Transfection und den Start-Zeitpunkt der Bildgebung.

In den Zellzyklus durchlaufen Zellen eine Reihe von stark regulierten und zeitlich gesteuerte Events für die genaue Vervielfältigung ihrer Genom und Verbreitung. Bei Säugetieren bestehend aus den Zellzyklus Interphase und M-Phase. In Interphase, bestehend aus drei Stufen - G1, S und G2, die Zelle seines Genoms dupliziert und Wachstum, die notwendig ist für normale Zellzyklus Progression1,2erfährt. In der M-Phase, bestehend aus Mitose (Prophase, prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase) und Cytokinese, produziert eine elterliche Zelle zwei genetisch identische Tochterzellen. In Mitose, Schwester Chromatiden des doppelten Genoms sind verdichtete (Prophase) und sind an ihren Kinetochore von Mikrotubuli der montierten mitotischen Spindel (prometaphase) erfasst, das treibt ihre Ausrichtung an der Metaphase-Platte (Metaphase) gefolgt von ihrer gleich Trennung, wenn Schwester Chromatiden sind aufgeteilt in Richtung und transportiert zum gegenüberliegenden Spindel (Anaphase) Polen. Die zwei Tochterzellen sind räumlich getrennt von der Aktivität eines Actin-basierte kontraktilen Rings (Telophase und Cytokinese). Das Kinetochor ist eine spezialisierte proteinhaltige Struktur, die in der Zentromer-Region der Schwesterchromatiden montiert und dienen als Befestigung Standorte für Spindel Mikrotubuli. Seine Hauptfunktion ist zu fahren Chromosom erfassen, Ausrichtung, und Hilfe bei der Korrektur unsachgemäße Spindel Mikrotubuli Anlage, bei der Vermittlung des Spindel Baugruppe Prüfpunkt um die Treue des Chromosom Abtrennung3,4zu erhalten.
Die Technik der Zelle Synchronisation dient als ideales Werkzeug für die molekulare und strukturelle Ereignisse im Zellzyklus Fortschreiten zu verstehen. Dieser Ansatz wurde zur Zell-Populationen in bestimmten Phasen für verschiedene Arten von Analysen, einschließlich der gen-Expression profiling Analysen der zelluläre biochemische Prozesse und Erkennung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen zu bereichern. Synchronisierte Säugerzellen können nicht nur für das Studium der einzelnen Gen-Produkte, sondern auch für Ansätze mit Analyse der ganzer Genome Microarray Analyse des Gens Ausdruck5, MiRNA Ausdruck Muster6einschließlich verwendet werden, Translational Regelung7und Proteomic Analyse von Protein-Modifikationen-8. Synchronisation kann auch verwendet werden, Studie zu den Auswirkungen der gen-Expression oder Protein Knock-down oder Knock-out- oder Chemikalien auf Zellzyklus Fortschreiten.
Zellen können in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus synchronisiert werden. Physikalische und chemische Methoden sind für die Zelle Synchronisation verbreitet. Die wichtigsten Kriterien für die Synchronisierung der Zelle sind, dass Synchronisation noncytotoxic und reversibel sein sollte. Wegen der potenziellen nachteiligen zellulären folgen Zellen durch pharmakologische Wirkstoffe zu synchronisieren können chemisch-abhängige Methoden für die Untersuchung wichtigen Zellzyklus Veranstaltungen vorteilhaft sein. Z. B. Hydroxyurea, Amphidicolin, Mimosine und Lovastatin, einsetzbar für Zelle Synchronisation am G1/S-Phase aber, wegen ihrer Wirkung auf die biochemischen Bahnen, die sie hemmen sie Zellzyklus Checkpoint Mechanismen zu aktivieren und töten einen wichtigen Bruchteil der Zellen9,10. Auf der anderen Seite kann Feedback-Hemmung der DNA-Replikation durch Zugabe von Thymidin, Wachstumsmedien, bekannt als "Thymidin-Block" Zellzyklus bei bestimmten Punkten11,12,13verhaften. Zellen können auch durch die Behandlung mit Nocodazole und RO-33069,14in G2/M-Phase synchronisiert werden. Nocodazole, die Montage von Mikrotubuli verhindert, hat eine relativ hohe Zytotoxizität. Darüber hinaus können Nocodazole verhaftet Zellen zurück altklug durch mitotische Schlupf interphase. Doppelte Thymidin Block Verhaftung-Zellen am G1/S-Phase und nach der Entlassung aus dem Block, sind Zellen gefunden, synchron durch G2 und in Mitose vorzugehen. Die normale Progression des Zellzyklus für Zellen befreit Thymidin-Block kann unter hochauflösenden konfokalen Mikroskopie durch Zelle Fixierung oder live Imaging beobachtet werden. Die Auswirkungen der Störung der mitotischen Proteine kann studiert werden, besonders dann, wenn Zellen eingeben und fahren Sie durch Mitose nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Block. Cdt1, ein multifunktionales Protein ist beteiligt an der DNA-Replikation Herkunft Lizenzierung in der G1-Phase und ist auch während der Mitose15für Kinetochor-Mikrotubuli-Anlagen erforderlich. Um die Funktion des Cdt1 während der Mitose zu studieren, braucht man eine Methode zu verabschieden, die die Wirkung von seiner Erschöpfung zur Replikation Lizenzierung während der G1-Phase, während gleichzeitig bewirken seine Erschöpfung speziell in der G2/M-Phase nur vermeidet. Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle basierend auf der doppelten Thymidin-Block zur Untersuchung der mitotischen Rolle von Proteinen, die mehrere Funktionen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus von festen und live-Cell Imaging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s (1X) L-15 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21083-027</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum reduced medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>319-85-070</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063 (Pen Strep)</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmafect2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>103056</td>
			<td>Dissolved in sterile distiled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdt1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hec1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-H2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-&#945;-tubulin and mCherry H2B</td>
			<td>Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc32293</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit ant-Zwint1</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-781A</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-&#947;H2AX (Ser139)</td>
			<td>Upstate Biotechnology</td>
			<td>05-626, clone JBW301</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodamine Red-X</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 6 well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35MM Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TiE inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc for confocal</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 888 EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 wave length laser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation System for Microscopes</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements software</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining mitotic cell synchronization and high resolution confocal microscopy to study the role of multifunctional cell cycle proteins during mitosis

Studie der verschiedenen Ereignisse, Regulierung des Zellzyklus in einer Phase-abhängigen Weise liefert ein klares Verständnis über Zelle Wachstum und Teilung. Die Synchronisation von Zell-Populationen in bestimmten Phasen des Zellzyklus wurde festgestellt, als sehr nützlich in diesem experimentellen bemühen. Synchronisation von Zellen durch Behandlung mit Chemikalien, die relativ weniger toxisch sind kann vorteilhaft sein, über die Verwendung von pharmakologischen hemmenden Medikamenten für die Studie der konsequente Zellzyklus Ereignisse und spezifische Anreicherung von ausgewählten mitotischen Phasen zu erhalten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Synchronisierung menschliche Zellen in den verschiedenen Phasen der Zelle Zyklus, einschließlich der beiden in S und M-Phase mit einem doppelten Thymidin-Block und Verfahren zur Untersuchung der Funktionalität der mitotischen Proteine im Chromosom Ausrichtung lassen und Segregation. Dieses Protokoll wurde äußerst nützlich für das Studium der mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die etablierten Interphase Funktionen besitzen. In unserem Fall kann die mitotische Rolle der Cdt1, entscheidend für die Replikation Herkunft Lizenzierung in G1-Phase, ein Protein effektiv studiert werden, nur wenn G2/M-spezifischen Cdt1 aufgebraucht werden können. Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Abbau der G2/M-spezifischen Cdt1 mit doppelten Thymidin-Synchronisation. Wir erklären das Protokoll der Zelle Fixierung auch live Cell Imaging mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie nach Thymidin-Release. Die Methode ist auch nützlich für die Analyse der Funktion der mitotischen Proteine unter physiologischen und gestörten Bedingungen wie z. B. für Hec1, ein Bestandteil der Ndc80 Komplex, da es eine zu große Stichproben der mitotischen Zellen für feste und live Zelle ermöglicht Analyse wie wir hier zeigen.

Studie der mitotischen Progression und Mikrotubuli Stabilität in den Zellen fest nach Entlassung aus dem Thymidin-block Cdt1 engagiert sich bei der Lizenzierung der DNA-Replikation Ursprünge in der G1-Phase. Es wird abgebaut, während der S-Phase aber wieder sammelt sich im G2/M-Phase. Um ihre Rolle bei der Mitose zu untersuchen, muss der endogenen Cdt1 speziell auf die mit der am besten geeigneten Zelle Synchronisation Technik, die doppelte Thymidin Block15G/M-Phase aufgebraucht sein. Zellen wurden unmittelbar nach Entlassung aus der 2Nd -Thymidin-Block mit SiRNAs transfiziert, wenn Zellen in der S phase und in welcher Zeit die Lizenzierung von Replikation Ursprung in G1, das auch Cdt1 Funktion benötigt, lange abgeschlossen wurde. Die Erschöpfung der Cdt1 nach 9 h siCdt1 Transfektion und doppelte Thymidin Blockunterricht wurde von Western blotting (Abbildung 1 b) validiert. Fixierung der Zellen 9 h nach Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block zeigt, dass die meisten Zellen in der Metaphase Stadium Kontrolle und Cdt1 SiRNA transfizierten Zellen. Fixierung der Zellen 10 h nach der Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block zeigt aber, dass die meisten Cdt1 SiRNA-behandelten Zellen noch im Spätstadium prometaphase verhaftet sind, während Kontrollzellen geben Sie Anaphase und normalerweise ihre Chromosomen zu, als erwartet (Abbildung 1 trennen ). Um die Wirkung der Cdt1 Erschöpfung am Kinetochor-Mikrotubuli (kMT) Stabilität zu verstehen, wurden Zellen um 9 Uhr nach Entlassung aus dem fixiert doppelte Thymidin Block gefolgt von Kältebehandlung, die behält nur stabile Kinetochor-Mikrotubuli (km). Die km Cdt1 erschöpft Zellen sind relativ weniger robust nach Kältebehandlung im Vergleich zu der Kontrollzellen (Abbildung 1). Somit kann mit diesem Ansatz, das Fortschreiten der normalen mitotischen Zellen nach der Störung der Funktion der mitotischen benutzt von Interesse wirksam, auch ohne die Verwendung von live Cell Imaging untersucht werden.
Abbildung 2 zeigt, dass die Lizenzierung der DNA-Replikation Herkunft nicht gestört ist, wenn Zellen des Cdt1 aufgebraucht sind, in der Phase G2/M mit unserem Protokoll, das auch in Kontrollzellen beobachtet wurde. Zellen in der Phase G2/M der Cdt1 erschöpft nicht dazu veranlassen, Anhäufung von phosphorylierten ɣH2AX, ein Marker für DNA-Schäden, während die nachfolgenden G2-Phase; während SiRNA Transfektion von asynchronen Kulturen, Cdt1 zum Abbau Anhäufung von Phospho-ɣH2AX-positiven Herde, möglicherweise aufgrund von DNA-Schäden durch unsachgemäße DNA Replikation Lizenzierung induzierte induziert.
Studie der mitotischen Progression in Zellen nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Block von live Cell imaging Nach der Kernhülle Zusammenbruch (NEB) normale Zellen (in Abwesenheit von Störung durch eine funktionale mitotischen Protein) geben Sie Mitose und Anaphase Beginn zum Verlassen der Mitose innerhalb von ca. 30-60 min (Abb. 3 b) zu unterziehen. Aber RNAi-vermittelten Knockdown von Hec1, ein wichtiger Kinetochor-Protein, das für robuste kMT Anlage Bildung benötigt wird festgestellt, dass um normale mitotischen Fortschreiten zu verzögern. In diesem Szenario die meisten Zellen Mitose nach der NEB, treten aber nicht unterziehen Anaphase Beginn oder Ausstieg aus Mitose auch nach mehreren Stunden Verzögerung bei der Mitose (Abbildung 3). Ebenso kann die Wirkung der RNAi-vermittelten Knockdown von anderen Protein, das Kinetochore oder mit einer Funktion während der Mitose lokalisiert so effektiv beobachtet werden, mithilfe von live Cell Imaging nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Blöcke. Neben dem Studium der Natur der mitotischen fortschreiten, Delay und Festnahme, die anderen wichtigen mitotischen Phänomene, die mit dieser Methode untersucht werden können gehören Chromosom Ausrichtung, mitotischen Spindel Bildung und Positionierung der Aktivierungs und Schweigen der der Spindel Montage Checkpoint.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56513/56513fig1.jpg"> Abbildung 1: Analyse der mitotischen Progression und die Stabilität der Kinetochor-Mikrotubuli in festen Zellen nach Thymidin-Synchronisation. (A) A schematische Darstellung der Zelle Synchronisation, Fixierung und Immunfluoreszenz. (B) Western-Blot für Knockdown von Cdt1 nach einer Entlassung aus dem 2. Thymidin-Block 9 h. (C) Immunfluoreszenz Mikrographen, der mitotischen Zellen zeigen feste 9 und 10 h nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Block und Behandlung mit Kontrolle (oben) oder Cdt1 SiRNA (unten). Α-Tubulin Färbung ist in rot, DNA ist in grün, wie Zellen GFP Histone H2B ausdrücken. Maßstabsleiste = 10 µm. Prometaphase und Metaphase Zellen sind gekennzeichnet mit gelben und weißen Pfeilspitzen bzw.. (D) HeLa Zellen nach Behandlung mit Kontrolle SiRNA (Oberseite) und Cdt1 Erschöpfung (Bodenplatte) für 9 h nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin Block gefolgt von der Behandlung mit eiskalten Leibovitz (L-15) Medium und Fixierung. Zellen waren immun für Spindel MT (grün) und ein Kinetochor-Marker, Zwint1 (rot) und DAPI für DNA in schwarz und weiß gefärbt. Maßstabsleiste = 5 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56513/56513fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56513/56513fig2.jpg"> Abbildung 2: Cdt1-Abbau in der Phase G2/M nicht durcheinanderbringen Replikation Lizenzierung. Asynchrone HeLa-Zellen mit Kontrolle Luciferase (Oberseite) behandelt oder cdt1 SiRNAs (Mitte Platte) oder doppelte Thymidin synchronisiert HeLa-Zellen während der 2Nd Thymidin auswaschen gefolgt von Fixierung um 10 h mit cdt1 SiRNA behandelt nach der Entlassung (Bodenplatte) waren voller Flecken mit DAPI (Pseudo-grün) und Anti-Phospho-ɣH2AX Antikörper (rot). Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56513/56513fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56513/56513fig3.jpg"> Abbildung 3: Analyse der mitotischen Progression von live Cell imaging in synchronisiert Zellen. (A) A schematische Darstellung der Zelle Synchronisation und live Cell Imaging. HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck mCherry-Histon H2B und GFP-α-Tubulin erschienen von doppelten Thymidin-Block für 8 h, G2/M-Phase von S Phase Verhaftung gehen lassen. Live Bildgebung erfolgte mit einem hochauflösenden konfokalen Mikroskop ab 8 h nach Freigabe der Zellen von Thymidin-Block und weiterhin für bis zu 16 h ab diesem Zeitpunkt. Hier sind die Standbilder aus dem Video erfasst alle 10 min für Kontrollzellen ohne Störung mitotischen Protein (B) oder Zellen von der Hec1-Untereinheit des komplexen Ndc80 (C) erschöpft. Maßstabsleisten = 10 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56513/56513fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

combining-mitotic-cell-synchronization-high-resolution-confocal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Aufrufe.  Northwestern University. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.

Serie: Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Forschung

Biologie

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this yeast model is relevant to many organisms, including humans, since DNA repair and DNA damage response factors are well conserved across diverse species. However, S. cerevisiae has not yet been used to fully address whether the rate of accumulating mutations changes with increasing replicative (mitotic) age due to technical constraints. For instance, measurements of yeast replicative lifespan through micromanipulation involve very small populations of cells, which prohibit detection of rare mutations. Genetic methods to enrich for mother cells in populations by inducing death of daughter cells have been developed, but population sizes are still limited by the frequency with which random mutations that compromise the selection systems occur. The current protocol takes advantage of magnetic sorting of surface-labeled yeast mother cells to obtain large enough populations of aging mother cells to quantify rare mutations through phenotypic selections. Mutation rates, measured through fluctuation tests, and mutation frequencies are first established for young cells and used to predict the frequency of mutations in mother cells of various replicative ages. Mutation frequencies are then determined for sorted mother cells, and the age of the mother cells is determined using flow cytometry by staining with a fluorescent reagent that detects bud scars formed on their cell surfaces during cell division. Comparison of predicted mutation frequencies based on the number of cell divisions to the frequencies experimentally observed for mother cells of a given replicative age can then identify whether there are age-related changes in the rate of accumulating mutations. Variations of this basic protocol provide the means to investigate the influence of alterations in specific gene functions or specific environmental conditions on mutation accumulation to address mechanisms underlying genome instability during replicative aging.

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Mutation rates in young Saccharomyces cerevisiae cells measured through fluctuation tests are used to predict mutation frequencies for mother cells of different replicative ages. Magnetic sorting and flow cytometry are then used to measure actual mutation frequencies and age of mother cells to identify any deviations from predicted mutation frequencies.

Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Synchronisation<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in the biogenesis of melanosomes, a lysosome-related organelle produced by melanocytes. REs deliver the melanocyte-specific cargo to premature melanosomes during their formation. Blockage in the generation of REs, observed in several mutants of Hermansky-Pudlak syndrome, results in hypopigmentation of skin, hair, and eye. Therefore, studying the dynamics (refer to number and length) of REs is useful to understand the function of these organelles in normal and disease conditions. In this study, we aim to measure the RE dynamics using a resident SNARE STX13.

Recycling endosomes are part of the endosomal tubular network. Here we present a method to quantify the dynamics of recycling endosomes using GFP-STX13 as an organelle marker.

Der mikroskopiebasierte Assay zur Untersuchung und Analyse der Recycling-Endosomen mittels SNARE-Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...