우리는 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B GFP-α-tubulin 표현 HeLa 세포를 공유 하기 위한 동북 대학, 일본의 박사 고조 다나카에 감사. 이 작품은 DV (R00CA178188)에 NCI 그랜트와 노스웨스턴 대학에서 창업 자금 지원 되었다.

1. 더블 티 미 딘 블록 및 릴리스: 시 약 준비
<ol><li>500 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 매체와 10 %FBS, 페니실린, 스 보충을 확인 합니다.</li>
	<li>살 균 물과 aliquots-80 ° c.에 있는 매장에서 티 미 딘 100 m m 재고 확인</li>
</ol>2. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 1A)의 고정된 셀 이미징에 대 한
<ol><li>6 잘 플레이트 커버 슬립 (70% 에탄올과 UV 방사선 살 균)과 DMEM 매체의 2 mL의 우물으로 하루 1, 105 HeLa 세포 x 씨 ~ 2. 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 습도 인큐베이터에서 세포 성장.</li>
	<li>1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 철저 하 게 신선한 DMEM 미디어 (100 m m 재고, 2mm 최종 농도)에 티 미 딘의 필요한 볼륨을 혼합.</li>
	<li>티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 셀 6-우물의 각 음에 미디어 접시 및 18h에 품 어.</li>
	<li>3 일에 매체를 발음 하 고 씻고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀과 신선한 prewarmed DMEM; 한 번 9 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체에서 세포를 성장 한다.</li>
	<li>2차 티 미 딘 블록: 다시 티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 셀 6 잘 플레이트의 각 음에.</li>
	<li>또 다른 18 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>4 일에 매체를 발음 하 고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀 및 신선한 prewarmed DMEM 한 번 씻어.</li>
	<li>(제어 및 Cdt1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체에 혼합 그들이 함께 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.</li>
	<li>차단 해제 4% 커버 슬립에 셀을 수정 하 9-10 h 37 ° C에서 세포를 품 어 PFA 실시간에서 20 분 주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용.</li>
	<li>
Immunostain 셀, RT에서 10 분 동안 0.5% (v/v) 세제 permeabilizing 및 5 분의 1 x PBS로 두 번 셀을 세척 후.
	<ol>
<li>1 시간 뒤에 1% (w/v)에 1 차 항 체 (마우스 안티-α-tubulin 항 체 1:1, 000, 토끼 안티-Zwint1 항 체 희석 1:400, 및 안티-인-ɣ H2AX 희석 1:300에서 마우스에 희석)의 50 µ L로 세포를 치료 하는 RT에 대 한 1 x PBS에서 1 %BSA (w/v)으로 세포를 차단 1 x 1 h 37 oc.에 대 한 PBS에 BSA</li>
		<li>씻은 후 1 x PBS로 세포 밖으로 몇 번이 고, 실시간에 1 시간에 50 µ L의 각 커버 유리 (알 렉 사 488와 1% (w/v) BSA 1 x PBS에서 1: 250 희석에 Rhodamine 빨간색)에 대 한 2 차 항 체와 세포 치료</li>
		<li>씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, DAPI와 세포 치료 (0.1µg / mL 1 x PBS에) 실시간에서 5 분</li>
		<li>씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, 셀 분명 현미경 슬라이드에 적절 한 설치 미디어를 직면 하 고 커버 슬립을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 X 100 X 1.4 나 계획 Apochromatic DIC 기름 침수 목표와 immunostained 단백질에 대 한 셀 필요한 이미지의 품질에 대 한 필요에 따라 적절 한 카메라를 장착 하는 거꾸로 높은 해상도 confocal 현미경에 장착 된 이미지.</li>
	<li>Z-스택 소프트웨어를 사용 하 여 0.2 µ m 두께의 현미경에 적합으로 실 온에서 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>3. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 3A)의 라이브 셀 이미징에 대 한
<ol><li>하루에 1, 씨앗 약 0.5-1 x 105 HeLa 세포 안정적 DMEM 매체의 1.5 mL와 35 m m 유리 하단 요리에 mCherry H2B GFP-α-tubulin (약간 세포 유형 및 표현 하는 단백질을 기준으로 변수) 표현 하 고는 습도에 그들을 성장합니다 37 oC, 5% CO2에서 24 h에 대 한 보육.</li>
	<li>1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 셀 접시 (100 m m 티 미 딘, 2mm 최종 농도)에 미디어.</li>
	<li>18 h에 품 어.</li>
	<li>3 일에 티 미 딘을 포함 하는 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어.</li>
	<li>(제어 및 Hec1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체와 함께 그들을 혼합 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.</li>
	<li>8 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체의 1.5 ml에서 세포 성장.</li>
	<li>2차 티 미 딘 블록: 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 접시에 셀.</li>
	<li>또 다른 18 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>하루에 4, 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어. 그런 다음 셀을 성장에서 신선한 prewarmed Leibovitz의 (L-15) 중간 보충 10 %FBS 20 mM HEPES 8 h 블록에서 셀 출시를 위한 pH 7.0에서.</li>
	<li>이미 무대와 실험 온도 안정 시키기 위해 이미징 시작 하기 전에 적어도 30 분에 전환 했다는 고해상도 confocal 현미경에 설정 온도 제어 챔버에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>셀 표시 될 때까지 60 x 목적으로 밝은 분야에 초점을 맞춥니다 다음 수동으로 선택의 영역에는 무대를 구별 합니다.</li>
	<li>빛과 레이저 전원/노출, 이미지 수집 매개 변수 및 선택의 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 실험 기간을 설정 합니다. GFP (488 여기; 385 nm 방출) 및 mCherry (561 nm 여기 및 385 nm 방출) 이미지에 대 한 필터를 사용 합니다.</li>
	<li>별도로 최대 16 h 동안 펄스 전송된 빛과 형광 이미지 마다 10 분을 획득 하 여 시간 경과 실험을 수행 합니다.</li>
	<li>현미경에 적합 한 소프트웨어를 사용 하 여 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 9 h는 12 1.0 µ m 구분 된 z 비행기로 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>Mitotic 진행에 대 한 개별 셀을 추적 하는 이미지를 분석 하 고 마지막으로 소스 소프트웨어 피지/ImageJ 해당 영화를 조립.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid.">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li><li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle,+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation.">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. 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S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle.">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li><li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly.">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1,+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis.">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li><li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+procedures.">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li><li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis.">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li><li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li><li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1.">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li><li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment.">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li><li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells.">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li><li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border.">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li><li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1/Mad2.">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li><li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment.">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).</li><li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment.">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li><li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction.">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li></ol>

저자 들은 경쟁 금융 관심 선언 합니다.

이중 티 미 딘 동기화의 가장 중요 한 장점은 이러한 세포 유사 분열 염색체 맞춤, 양극의 분석 또한 활성화 한 마음으로 입력의 많은 짧은 시간 창에 mitotic 세포의 증가 샘플 크기 제공 훨씬 더 높은 효율성과 형성과 염색체 분리를 주축.
많은 규제 단백질 복합물 및 신호 통로 유사 분열을 통해 정상적인 진행을 보장에 헌신 하는 고이 과정의 규제 완화 수 있습니다 tumorigenesis. 라이브 셀 이미징 HeLa 세포 안정적으로 mCherry H2B와 GFP tubulin 그리고 대부분 제어 셀 코 (그림 3B) 후 anaphase 약 60 분 이내에 그들의 염색체 분리 이중 티 미 딘 블록 쇼에서 발표의. 다른 한편으로, Hec1 기능을 보여줍니다 대부분 셀 고르지 염색체 anaphase 발병 또는 apoptosis (그림 3C)와 오랜 기간 동안 mitotic 단계에 머물와 교란된 HeLa 세포의 세포 이미징 라이브.
초과 티 미 딘 따라서 G1/S 단계11에서 세포를 차단 S 단계에서 DNA 합성 억제. 이중 티 미 딘 블록 동기화는 가장 일반적으로 사용 되는 방법 세포 주기 및 mitotic 진행의 연구에서 하나이 방법의 제한 사항 중 일부의 중요 한 필요 합니다. 중요 한 것은, 그것은 그 화학 물질은 씻 겨 밖으로 철저 하 게 (h를 위한 7-8) 효과 되돌릴 하 고 세포를 세포 주기의 나머지 부분을 통해 정상적으로 진행 하는 것을 보장 될 필요가 있다. 셀 수 있습니다 그렇지 않으면 부적절 한 진행 하지만 유사 분열 일으키는 두 번째 주기를 입력 하지. 동기화 된 셀의 비율 단일 티 미 딘 블록으로 충분히 높은 되지 않을 수 있습니다 그리고 하나는 유사 분열의 특정 단계를 공부에 관심이 있는 경우에 특히 이중 티 미 딘 블록 동기화 된 셀의 수를 증가 하는 데 필요한 수 있습니다. 티 미 딘 치료 기간 셀 형식 생성 시간에 따라 다른 감도 때문에 낙관 되어야 한다. 예를 들어 햄스터 세포의 생성 시간 16 h 있고 최적의 동기화1711 h 티 미 딘으로 취급 됩니다. 이 연구에서 우리는 HeLa 세포에 티 미 딘과 16-18 h에 대 한 치료. 또한, 초과 티 미 딘 뿐만 아니라 DNA 종합을 방지 하지만 또한 고 수 있습니다 셀11,,1218 의 중요 한 부분을 죽 일이 손실 모니터를 지불 될 필요가 관심을 닫습니다. 이 연구에 사용 된 티 미 딘 재고 솔루션 멸 균 증류수에 준비 되어야 한다 고 세포 배양 세포 페 siRNA의 미디어를 추가 후 그것의 강 수를 방지 하 고 또한 그것의 균질 성 보장에 철저 하 게 혼합 한다 배양된 세포 주위 분포입니다.
Mitotic 진행 하는 동안 대상 mitotic 단백질의 기능을 공부, 셀 이상적으로 것으로 치료 siRNA 최저에 관심사의 단백질의 레벨 1st 티 미 딘 블록 또는 1st에서 출시 하는 동안 티 미 딘 블록, 효율적인 단백질 최저19,20,21을 얻을 하는 데 필요한 시간에 따라. 다른 한편으로, 유사 분열 동안 Cdt1 등 다기능 단백질의 역할을 연구, 그것은 G2/M 특정 소모를 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 하는 동안 siCdt1 가진 세포를 치료 하는 데 필요한. Cdt1는 DNA 복제 기원15의 라이선스에서 중요 한 선수 이다. 라이선스의 역할을 방해 하지 않고 유사 분열 동안 그것의 전문화 된 역할을 이해, Cdt1 해야 효율적으로 더블 티 미 딘 동기화를 통해 달성 될 수 있다, G2/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 다른 리조트 필요가 피 실행 하기 어려운 유사 분열 전용 섭 동 접근. 비동기 문화에서 Cdt1의 고갈 것 차례로 muddled이 단백질에 대 한 가능한 함수의 분석 유사 분열 동안 DNA 복제 근원의 라이센스의 중단으로 인해 DNA 손상 응답 유도. 따라서, 이중 티 미 딘 동기화 기술은 정상적인 g 1과 S 단계 수술 하지만 g 2와 M 단계 Cdt1 기능 부족 셀 생성 하 독특한 실험 방식을 제공 합니다. 우리의 동기화 프로토콜의 특별 한 의미 (G2/M) 유사 분열 동안 그들의 소설 기능을 공부 하는 특정 단계에서 다기능 단백질의 그것의 억제에 있다. 따라서,이 방법은 뿐만 아니라 단백질 기능을가지고 여러 다른 세포 주기 단계 뿐만 아니라 염색체 정렬, kMT 첨부 파일, 및 염색체 분리 과정 mitotic 단백질 어떤의 그의 역할을 연구 하기 유용할 것 이다.
이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 라이브 셀 이미징에 대 한 미리 따뜻하게 Leibovitz (L-15)에서 세포를 incubated 매체 화상의 시작까지 10-20 %FBS 보충. 셀 셀 유형에 따라 티 미 딘 블록에서 출시 후 가변 시간 지점에서 유사 분열을 입력합니다. 이미지 캡처 또는 고정 시작 시간 셀 유형에 따라 최적화가 필요 합니다. 라이브 셀 이미징에 대 한 전통적인 confocal 현미경 검사 법의 활용 장기 이미징 동안 photobleaching를 발생할 수 있습니다. 다른 한편으로, 높은 해상도 confocal microcopy photobleaching 효과의 최소 범위를 명확 하 고 고해상도 이미지를 제공합니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 티 미 딘 치료 기간에 티 미 딘, siRNA transfection의 타이밍 그리고 영상의 시작 타이밍의 적절 한 유실.

세포 주기에서 세포 그들의 게놈 및 확산의 정확한 복제에 대 한 높은 규제 하 고 일시적으로 제어 이벤트의 시리즈를 받 다. 포유류에서 세포 주기 interphase 및 M으로 구성 됩니다. Interphase에 구성 된 3 단계-G1, S, 및 g 2 셀 그것의 게놈을 복제 하 고 정상적인 세포 주기 진행1,2에 필요한 증가 겪 습. M-단계에서 이루어진 유사 분열 (의향, prometaphase, 분열, anaphase, 및 telophase) cytokinesis, 부모의 셀 두 유전으로 동일한 딸 세포를 생성 합니다. 그 뒤 분열 중 기 격판덮개 (분열)에 그들의 정렬 드라이브 유사 분열, 중복 된 게놈의 chromatids 압축된 (의향) 이며 조립된 mitotic 스핀 들 (prometaphase)의 microtubules 잡혀 자신의 kinetochores에 자매 들 자매 chromatids는으로 분할 하 고 반대 스핀 들 이송 기둥 (anaphase) 분리를 동등한. 2 개의 딸 세포는 걸 기반으로 수축 성 반지 (telophase 및 cytokinesis)의 활동에 의해 물리적으로 구분 됩니다. kinetochore chromatids의 centromeric 지역에서 조립 전문된 배치할 구조 이며 스핀 들 microtubules에 대 한 첨부 파일 사이트 역할. 그것의 주요 기능은 염색체 캡처, 맞춤, 운전 하 여 염색체 분리3,4의 충실도 유지 하기 위해 스핀 들 어셈블리 검사점을 중재 하는 동안 부적 절 한 스핀 들 microtubule 첨부 파일 수정에 도움이입니다.
셀 동기화의 기술은 세포 주기 진행에 관련 된 분자 구조 이벤트를 이해 하기 위한 이상적인 도구 역할을 합니다. 이 접근은 다양 한 형태의 분석, 유전자 발현의 프로 파일링을 포함 하 여 세포질 생화학 과정의 분석 및 단백질의 subcellular 지 방화의 검출에 대 한 특정 단계에서 세포 인구를 풍부 하 게 사용 되었습니다. 개별 유전자 제품의 연구 뿐만 아니라 전체 게놈 유전자 식5, 미르 식 패턴6, microarray 분석 등의 분석을 포함 하는 방법에 대 한 동기화 된 포유류 세포를 사용할 수 있습니다. 변환 규칙7, 그리고 단백질 수정8의 proteomic 분석. 동기화는 또한 세포 주기 진행에 유전자 발현 이나 단백질 노크 다운 또는 노크-아웃, 또는 화학 물질의 효과 연구에 사용할 수 있습니다.
세포 세포 주기의 여러 단계에서 동기화 할 수 있습니다. 물리적, 화학적 방법은 널리 셀 동기화에 사용 됩니다. 셀 동기화에 대 한 가장 중요 한 기준은 동기화 되도록 noncytotoxic 하 고 되돌릴 수 있습니다. 동기화 약리학 대리인에 의해 세포의 잠재적인 불리 한 세포 결과, 때문에 화학 종속 방법을 공부 하는 주요 세포 주기 이벤트에 대 한 유리한 수 있습니다. 예를 들어 hydroxyurea, amphidicolin, mimosine, 그리고로 바 스타 틴, G1/S 단계에서 셀 동기화에 사용할 수 있습니다 하지만, 그들이 억제 생화학 경로에 그들의 효력 때문에 그들은 세포 주기 검문소 메커니즘을 활성화 하 고 중요 한 죽 셀9,10일부 다른 한편으로, "티 미 딘 블록"로 알려진 성장 매체에 티 미 딘을 추가 하 여 DNA 복제의 피드백 저해 특정 포인트11,,1213에 세포 주기를 체포 수 있습니다. 또한 nocodazole와로-33069,14처리 하 여 셀 G2/M 단계에 동기화 수 있습니다. Nocodazole, microtubule 어셈블리를 방지 하는 상대적으로 높은 세포 독성. 또한, nocodazole 체포 셀 interphase 조 mitotic 미끄럼으로 돌아갈 수 있습니다. 이중 티 미 딘 블록 체포 셀 g 1/S 단계에서 블록에서 출시 후, 셀 통해 G2 및 유사 분열으로 동시 진행을 찾을 수 있습니다. 티 미 딘 블록에서 발표 하는 세포의 세포 주기의 정상적인 진행 셀 고정 또는 라이브 영상으로 높은 해상도 confocal 현미경에서 관찰할 수 있습니다. 셀 입력 하 고 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 유사 분열을 통해 진행 하는 경우에 특히 mitotic 단백질의 섭 동 효과 공부 될 수 있다. Cdt1, 다기능 단백질 DNA 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 관련 된 이며, 유사 분열15중 kinetochore microtubule 첨부 파일에 대 한 필요 이기도. 유사 분열 동안 Cdt1의 기능을 공부 하나는 복제 라이센스만 G2/M 단계 동안 특히 그것의 소모를 초래 하는 동시에 g 1 단계에 고갈의 효과 방지 하는 방법을 채택 해야 합니다. 여기, 우리는 고정 및 라이브 셀 이미징에 의해 이중 티 미 딘 블록 세포 주기의 다른 단계 동안 여러 기능을 수행 하는 단백질의 mitotic 역할을 연구 하기에 따라 상세한 프로토콜 제시.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s (1X) L-15 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21083-027</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum reduced medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>319-85-070</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063 (Pen Strep)</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmafect2</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Store at 4 degree C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>103056</td>
			<td>Dissolved in sterile distiled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdt1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hec1 siRNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Ref 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-H2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells expressing GFP-&#945;-tubulin and mCherry H2B</td>
			<td>Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corporation</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Toxic, needs caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc32293</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit ant-Zwint1</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A300-781A</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-&#947;H2AX (Ser139)</td>
			<td>Upstate Biotechnology</td>
			<td>05-626, clone JBW301</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodamine Red-X</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 6 well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35MM Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TiE inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc for confocal</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra 888 EM-CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 wave length laser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation System for Microscopes</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements software</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining mitotic cell synchronization and high resolution confocal microscopy to study the role of multifunctional cell cycle proteins during mitosis

연구 단계에 종속적으로 세포 주기의 다양 한 규제 이벤트의 세포 성장 및 부문에 대 한 명확한 이해를 제공합니다. 세포 인구 세포 사이클의 특정 단계에서 동기화 실험적인 노력에 매우 유용 하 게 발견 되었습니다. 치료는 상대적으로 덜 독성 화학 물질에 의해 세포의 동기화 연구 결과 세포 주기 이벤트 하 고 선택한 mitotic 단계의 특정 농축을 위한 약리 억제 약물의 사용을 통해 유리한 수 있습니다. 동기화 인간의 세포는 세포의 여러 단계에서 S 단계 및 이중 티 미 딘 블록와 M 단계 모두를 포함 하 여 주기 고 염색체 정렬에 mitotic 단백질의 기능을 공부에 대 한 절차를 공개 프로토콜 설명 하는 여기, 그리고 분리입니다. 이 프로토콜 설립된 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할을 공부 하는 데 매우 유용 했습니다. 우리의 경우에서 Cdt1, 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 대 한 중요 한 단백질의 mitotic 역할 수 수 공부 효과적으로 g 2/M-특정 Cdt1 고갈 될 수 있는 경우에. 우리는 더블 티 미 딘 동기화를 사용 하 여 g 2/M-특정 Cdt1의 고갈에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 셀 고정, 프로토콜을 설명 하 고 라이브 셀 이미징 티 미 딘 릴리스 후 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여. 방법은 하나 고정 및 라이브 셀 mitotic 세포의 큰 샘플 크기를 수 있습니다 Hec1, 복잡 한, Ndc80의 구성 요소와 같은 생리 적 및 교란 조건에서 mitotic 단백질의 기능을 분석 하는 데 유용도 분석으로 우리가 여기에 표시.

Mitotic 진행 및 셀에서 microtubule 안정성의 연구에서 출시 후 두 티 미 딘 블록 고정 Cdt1 g 1 단계에서 DNA 복제 근원의 라이선스에 포함 된다. 그것은 S 단계 저하 하지만 다시 G2/M 단계에 축적. 공부 하 고 유사 분열에서의 역할, 생 Cdt1를 사용 하 여 가장 적합 한 셀 동기화 기법, 더블 티 미 딘 블록15G/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 필요가 있다. 셀에에서 있을 때 셀 S 단계 및 시간에 의해 또한 Cdt1 기능 필요, g 1에서 복제 근원의 라이선스 오래 완료 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 직후 siRNAs와 페 했다. 9 h siCdt1 transfection와 더블 티 미 딘 블록 출시 후 Cdt1 고갈 부 럽 (그림 1B)에 의해 검증 되었다. 고정 셀 9 h 이중 티 미 딘 블록에서 릴리스 보여줍니다 대부분 세포 분열 단계에서 제어 및 Cdt1 siRNA는 후의 transfected 세포. 그러나 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 셀 10 h의 고정 제어 셀 anaphase 입력 하 고 정상적으로 예상된 (그림 1C로 그들의 염색체를 분리 하는 동안 대부분 Cdt1 siRNA 치료 셀 prometaphase 단계에서 체포 여전히는 보여준다 ). Kinetochore-microtubule (kMT) 안정성에 Cdt1 고갈의 영향을 이해 하 셀 고정 했다 9 h에서 출시 후 더블 티 미 딘 블록 뒤에 감기 치료만 안정적인 kinetochore-microtubules (kMTs)를 유지. Cdt1 고갈 세포의 kMTs는 제어 셀 (그림 1D)에 비해 감기 치료 후 상대적으로 덜 강력한. 따라서,이 방법을 사용 하 여, 관심의 mitotic protein(s)의 함수의 섭 동 후 정상적인 mitotic 세포의 진행 수 수 공부 효과적으로, 라이브 셀 이미징의 사용 없이.
그림 2 는 DNA 복제 근원의 라이선스는 하지 불안정 세포는 또한 제어 셀에서 관찰 되었다 우리의 프로토콜을 사용 하 여 G2/M 단계 Cdt1 고갈 하는 경우를 보여 줍니다. 셀 g 2/M 단계 Cdt1의 고갈; 후속 g 2 단계 phosphorylated ɣH2AX, DNA 손상에 대 한 표시자의 축적을 유도 하지 않았다 반면 비동기 문화 Cdt1 고갈의 siRNA transfection 부적절 한 DNA 복제 라이센스에 의해 유도 된 DNA 손상으로 인해 인 ɣH2AX 양성 foci의 축적을 유도 한다.
라이브 셀 이미징에 의해 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 셀에 mitotic 진행의 연구 핵 붕괴 (코), 후 (기능 mitotic 단백질에 의해 섭 동 부재)에 정상 세포 유사 분열을 입력 하 고 약 30-60 분 (그림 3B) 내에서 유사 분열에서 종료 하려면 anaphase 발병을 받 다. 하지만 RNAi 중재 최저 Hec1, 강력한 kMT 첨부 형성에 필요한 키 kinetochore 단백질의 정상적인 mitotic 진행 지연 발견 된다. 이 시나리오에서 대부분 셀 코, 후 유사 분열을 입력 하지만 anaphase 발병을 받아야 하거나 마십시오 지연 유사 분열 (그림 3C)의 몇 시간 후에 유사 분열에서 종료. 마찬가지로, localizes kinetochores 또는 함수 유사 분열 동안에 다른 단백질의 최저 RNAi 중재의 효과 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 라이브 셀 이미징 사용 하 여 효과적으로 관찰 수 있다 따라서. Mitotic 진행, 지연 및 체포의 자연 공부, 함께이 메서드를 사용 하 여 분석 될 수 있는 다른 주요 mitotic 현상의 일부 염색체 정렬, mitotic 스핀 들 형성 및 활성화 위치 및의 입을 포함는 스핀 들 어셈블리 검사점입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56513/56513fig1.jpg"> 그림 1: mitotic 진행과 더블 티 미 딘 동기화 후 고정된 셀에 kinetochore microtubules의 안정성의 분석. (A) A 셀 동기화, 고정, 및 면역 형광의 도식 적인 표현입니다. (B) 2 티 미 딘 블록에서 방출의 9 h 후 Cdt1의 최저에 대 한 서쪽 오 점. (C) 표시 mitotic 세포 면역 형광 현미경 더블 티 미 딘 블록 및 제어 (위) 또는 Cdt1 siRNA (아래) 치료에서 출시 후 9, 10 h 고정. 빨간색에서은 α-tubulin 얼룩, DNA는 그린 셀 GFP 히스톤 H2B 익스프레스. 눈금 막대 = 10 µ m. Prometaphase 및 분열 세포 노란색을 사용 하 여 표시 됩니다 및 화살촉을 각각 화이트. (D) 헬러 세포 제어 siRNA (상단 패널)과 치료 후과에서 출시 후 9 h Cdt1 고갈 (하단 패널) 후 두 티 미 딘 블록 뒤에 얼음 처럼 차가운 Leibovitz (L-15) 치료 매체 및 고정. 세포 면역-스핀 들 MT (녹색) 및 Zwint1 (빨간색)와 흑인과 백인 dna DAPI kinetochore 마커 얼룩이 있었다. 눈금 막대 = 5 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56513/56513fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56513/56513fig2.jpg"> 그림 2: G2/M 단계 Cdt1 고갈 복제 라이센스 교란 하지 않습니다. 비동기 HeLa 세포 제어 luciferase (상단 패널)로 치료 또는 cdt1 siRNAs (중간 패널) 또는 더블 티 미 딘 동기화 HeLa 세포는 2nd 티 미 딘 워시 아웃 뒤에 10 h에 고정 하는 동안 cdt1 siRNA로 치료 릴리스 (하단 패널) 후 DAPI (의사 색된 녹색)와 안티-인-ɣH2AX 항 체 (레드) 얼룩이 있었다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56513/56513fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56513/56513fig3.jpg"> 그림 3: 라이브 셀 이미징에 의해 mitotic 진행의 분석 동기화 셀. (A) A 셀 동기화 및 라이브 셀 이미징의 도식 적인 표현입니다. 헬러 세포를 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B 표현 그리고 GFP-α-tubulin 8 h S 단계 체포에서 G2/M 단계로 진행을 위한 이중 티 미 딘 블록에서 발표 했다. 라이브 이미지는 티 미 딘 블록에서 셀을 공개 하 고 그 시점에서 최대 16 시간 계속 후 8 h를 시작 하는 높은 해상도 confocal 현미경을 사용 하 여 실시 되었다. 여기은 캡처한 모든 mitotic 단백질 (B)의 섭 동 없이 제어 세포 또는 세포는 Hec1 소 단위 복잡 한 Ndc80의 (C)의 고갈에 대 한 모든 10 분 비디오에서 스틸 이미지입니다. 스케일 바 = 10 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56513/56513fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K 조회수.  Northwestern University. 선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

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Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

연구

생물학

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this yeast model is relevant to many organisms, including humans, since DNA repair and DNA damage response factors are well conserved across diverse species. However, S. cerevisiae has not yet been used to fully address whether the rate of accumulating mutations changes with increasing replicative (mitotic) age due to technical constraints. For instance, measurements of yeast replicative lifespan through micromanipulation involve very small populations of cells, which prohibit detection of rare mutations. Genetic methods to enrich for mother cells in populations by inducing death of daughter cells have been developed, but population sizes are still limited by the frequency with which random mutations that compromise the selection systems occur. The current protocol takes advantage of magnetic sorting of surface-labeled yeast mother cells to obtain large enough populations of aging mother cells to quantify rare mutations through phenotypic selections. Mutation rates, measured through fluctuation tests, and mutation frequencies are first established for young cells and used to predict the frequency of mutations in mother cells of various replicative ages. Mutation frequencies are then determined for sorted mother cells, and the age of the mother cells is determined using flow cytometry by staining with a fluorescent reagent that detects bud scars formed on their cell surfaces during cell division. Comparison of predicted mutation frequencies based on the number of cell divisions to the frequencies experimentally observed for mother cells of a given replicative age can then identify whether there are age-related changes in the rate of accumulating mutations. Variations of this basic protocol provide the means to investigate the influence of alterations in specific gene functions or specific environmental conditions on mutation accumulation to address mechanisms underlying genome instability during replicative aging.

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Mutation rates in young Saccharomyces cerevisiae cells measured through fluctuation tests are used to predict mutation frequencies for mother cells of different replicative ages. Magnetic sorting and flow cytometry are then used to measure actual mutation frequencies and age of mother cells to identify any deviations from predicted mutation frequencies.

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

의 동기화<em&gt; Caulobacter Crescentus</em&gt; 세균 세포주기의 조사에 대한

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in the biogenesis of melanosomes, a lysosome-related organelle produced by melanocytes. REs deliver the melanocyte-specific cargo to premature melanosomes during their formation. Blockage in the generation of REs, observed in several mutants of Hermansky-Pudlak syndrome, results in hypopigmentation of skin, hair, and eye. Therefore, studying the dynamics (refer to number and length) of REs is useful to understand the function of these organelles in normal and disease conditions. In this study, we aim to measure the RE dynamics using a resident SNARE STX13.

Recycling endosomes are part of the endosomal tubular network. Here we present a method to quantify the dynamics of recycling endosomes using GFP-STX13 as an organelle marker.

SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석하는 현미경 기반 분석

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...