이 연구는 생물에 의해 지원 되었다 &#38; 의료 기술 개발 프로그램 국가 연구 재단 (NRF)의 &#38;는 정부에 의해 투자 (MSIP &#38; 보건복지부) (No. 2016M3A9B6904244). 우리는 또한 exosome의 정화의 약용 Bioconvergence 연구 센터의 회원을 감사합니다.

1. 블록 준비, 단면, 얼룩이 지 고는 Exosome의 이미징
<ol>
	<li>1.5 h23에 대 한 100000 x g에서 원심 분리에 의해 HCT116 세포의 문화 상쾌한에서 exosomes을 펠 렛. 표면에 뜨는 문화를 제거 하 고 신중 하 게 순화 exosome 펠 릿 1 mL의 0.1 M 나트륨 cacodylate 솔루션 (pH 7.0) 4 ° c.에 1 시간에에서 2.5%도 해결 0.1 M 나트륨 cacodylate, 160 ml 증류수 (DW) 4.28 g cacodylic 산 분해. 0.1 M HCl 최대 200 mL 증류수와 함께 게와 7.4에 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>정착 액을 제거 하 고 실 온에서 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼의 1 mL와 함께 알 약을 씻어. 각 변경 10 분 지속으로 세 번을 반복 합니다.</li>
	<li>후 4 ° c.에 2% 오스뮴 tetroxide 1 h의 1 mL와 함께 샘플을 수정</li>
	<li>정착 액을 제거 하 고 세 번 0.1 M 나트륨 cacodylate와 린스 버퍼 마다 10 분.</li>
	<li>등급된 아세톤 시리즈와 10 분 동안 품 어 (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 각각) 뿌리에.</li>
	<li>아세톤을 제거 하 고 30 분에 대 한 3:1 아세톤: 낮은 점도 포함 혼합물의 솔루션을 품 어. Exosome 펠 렛 튜브입니다.</li>
	<li>매체를 제거 하 고 1:1 아세톤: 낮은 점도 포함 혼합 매체, 추가 다음 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>매체를 제거 하 고 1:3 아세톤: 낮은 점도 포함 혼합 매체, 추가 다음 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>매체를 제거 하 고 추가 100% 낮은 점도 혼합물을 포함 하 고 하룻밤 실 온에서 품 어.</li>
	<li>65 ° c.에 24 h에 대 한 포함 형과 빵을 사용 하 여 혼합물을 포함 하는 순수한 낮은 점도 샘플 포함</li>
	<li>60 nm 두께 울트라-톰을 통해 섹션을 준비 합니다.</li>
	<li>더블-20 분 동안 2 %uranyl 아세테이트로 얼룩 그리고 10 분 시트르산. 레이놀즈 리드 솔루션에 대 한 총 50 mL 증 류 물 납 질 산 및 나트륨 시트르산의 1.76 g 1.33 g를 추가 합니다.</li>
	<li>전송 전자 현미경 검사 법 80에서 아래의 표에서 관찰 kV.</li>
	<li>"취득"을 클릭 하 고 클릭 "파일" 및 "이름으로 저장" CCD 카메라 시스템 80에서 전자 현미경에 kV. 노출 시간에 대 한 자동 설정을 따릅니다.</li>
</ol>
2. 면역-얼룩 섹션 및 이미징 (그림 1)의
<ol>
	<li>매우 톰을 사용 하 여 60 nm ultrathin 섹션을 잘라 고 니켈 격자에 수집 합니다.</li>
	<li>10 분 무료 알데하이드 그룹을 끄다 0.02 M 글리신의 50 µ L에서에서 격자를 품 어.</li>
	<li>린스에 DW의 100 μ 3 번 각각 1 %BSA 포함 하는 PBS에서 1 시간에 대 한 실 온에서 10 분 품.</li>
	<li>1 시간 (해당 되는 경우 필요한,이 단계 실행 되어야 한다 4 ° C에서 하룻밤.)에 대 한 격자에서 50-100 µ L의 KRS 항 체24 (1: 100 0.1 %BSA 포함 하는 PBS에) 안티를 품 어</li>
	<li>10 분 동안 0.1 %BSA 포함 하는 PBS의 5 별도 방울 (50 µ L)으로 격자를 씻어.</li>
	<li>1 h (안티-토끼 IgG 0.1 %BSA 포함 하는 PBS에 10 nm 금 입자 (1: 100)를 활용)에 대 한 2차 항 체의 방울을 격자를 전송 합니다.</li>
	<li>5 세척 격자 각 10 분 0.1 %BSA 포함 하는 PBS의 방울 (50 µ L)을 구분 합니다.</li>
	<li>더블-얼룩 어두운 조건 하에서 20 분 동안 2 %uranyl 아세테이트와 Reynold의 리드 시트르산 10 분, 각각.</li>
	<li>"취득"을 클릭 하 고 클릭 "파일" 및 "저장" CCD 카메라 시스템 80에서 가장 아래에 kV. 노출 시간에 따라 자동 설정.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56482/56482fig1.jpg"> 
그림 1: 샘플 준비 과정 immunostaining. (A) 이중 고정된 exosome 탈수 이며 저 점도 수 지 혼합물 포함으로 침투. (B) 포함 수 지. (C) 다이아몬드 칼으로 초박형 섹션. 면역-골드 라벨에 대 한 (D) 설정. Ultrathin 섹션 격자는 젖은 종이 타월로 배치 parafilm에 액체 방울에 배치 됩니다. 각 섹션은 50-100 µ L 항 체, 방울과 알을 품을 다음 버퍼로 세척. (E) uranyl 아세테이트와 얼룩 더블 고 시트르산. 뚜껑은 알루미늄 호 일 중 금속 얼룩으로 덮여 있다. (F) 솔루션 얼룩 필터 종이 의해 제거 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56482/56482fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. 부정적인 얼룩이 지기
<ol>
	<li>글로우 방전 발광 방 전자에 의해 1 분 동안 얇은 formvar/탄소 코팅 필름 200 메쉬 구리 EM 격자.</li>
	<li>2%의 1 mL와 함께 순화 exosomes 수정 Paraformaldehyde (PFA) 5 분. 주의: Paraformaldehyde 가스는 유독 합니다. 모든 작업은 통풍이 증기 두건에서 행해져야 한다.</li>
	<li>5-7 µ L exosome 정지 솔루션에 로드 하 고 1 분 동안 품 어. Exosome의 농도가 너무 높은 경우, 희석 농도를 1/2-1/5.</li>
	<li>주사기로 EM 격자의 표면에 필터링 된 1 %uranyl 아세테이트 (UA) 솔루션 ~ 20 방울과 함께 즉시 얼룩.</li>
	<li>필터 종이 그리드 가장자리에 연락 하 여 격자에 과잉 UA 솔루션을 제거 합니다.</li>
	<li>신속 하 게 물 한 방울과 함께 그리드를 헹 구 십시오. 이 단계는 초과 얼룩 솔루션을 제거 합니다.</li>
	<li>그리드 테이블에, 핀셋으로 눌러 놓고 실 온에서 10 분 동안 건조 문화 접시와 부분적으로 그리드를 커버 합니다.</li>
	<li>80 편으로 미래 관측을 위해 EM 격자 상자에 그리드를 저장 kV.</li>
</ol>
4. 전체 산 Immunostaining에 대 한
<ol>
	<li>글로우 방전 얇은 formvar/탄소 필름 코팅 200 메쉬 구리 EM 격자 30 s.</li>
	<li>2%의 1 mL와 함께 순화 exosomes 수정 Paraformaldehyde (PFA) 5 분. 주의: Paraformaldehyde 가스는 유독 합니다. 모든 작업은 통풍이 증기 두건에서 행해져야 한다.</li>
	<li>5-7 µ L exosome 솔루션에 고정 하 고 품 어 PBS의 100 µ L 5 분 린스에 대 한 3 시간 10 분 동안 각각.</li>
	<li>10 분 무료 알데하이드 그룹을 끄다 0.05 M 글리신의 50 µ L로 격자를 취급 합니다.</li>
	<li>30 분 동안 차단 버퍼 (PBS 포함 하는 1 %BSA)의 한 방울을 격자를 전송.</li>
	<li>1 시간 (필요한 경우,이 단계 실행 되어야 한다 4 ° C에서 하룻밤)에 대 한 반대로 PD L1 항 체 (0.1 %BSA 포함 하는 PBS에서 1: 100) 50-100 µ L로 격자를 품 어.</li>
	<li>10 분 동안 0.1 %BSA 포함 하는 PBS의 5 별도 방울 (50 µ L)과 그리드를 씻어.</li>
	<li>1 시간에 대 한 2차 항 체의 하락을 그리드를 전송 합니다.</li></ol>반대로 마우스 IgG 9-11 nm 금 입자에서 0.1 %BSA 포함 하는 PBS에서 1: 100 희석을 활용.
	<li>10 분 동안 0.1 %BSA 포함 하는 PBS의 5 별도 방울 (50 µ L)과 그리드를 씻어. DW의 두 별도 방울 (50 µ L)으로 그리드를 씻어. 3.8 3.4에서 설명한 대로 2 %uranyl 아세테이트와 부정적인 얼룩를 수행 합니다.</li>
	<li>80 편으로 미래 관측을 위해 EM 격자 상자에 그리드를 저장 kV.</li>

<ol>
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이 문서는 자세한 exosome의 구조를 관찰 하 고 그 특정 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜을 표시 합니다. 부정적인 얼룩 exosome17이미징에 대 한 최선의 방법으로 간주 되었습니다. 이 기본 기술을 exosomes의 컵 모양의 구조를 보이고 있다. 그러나,이 컵 모양 인 위 건조 과정으로 인해 발생할 수 있는 형태입니다. 곳을 알아내는 가장 결과 exosomes 용액25,26에 완벽 하 게 구형 구조를가지고 나타났습니다. 곳을 알아내는 가장 기술 자연 구조를 조사 하기 위한 매우 강력한 방법 이지만 면역-골드 메서드를 적용 하기 어렵습니다. 종래의 방법 (전체 마운트-부정적인 얼룩이 지기 방법)에서 건조 지적 Raso와 동료는 컵 모양의 형태에 결과. 이 연구에서 셀 준비 (일상적인 EM, 고정, 탈수, 포함, 및 단면)에 대 한 표준 방법 exosome 건조 효과 줄이기 위해 적용 되었다. 루틴 안에 플라스틱 포함을 사용 하 여 수 피 하거나 유물 (볼륨 및 모양 변경) 변성에 의해 발생을 줄일 수. 화학 기정, cross-linking (아미노 그룹 간의 공유 상호 작용)에 대 한 글 (가) 사용 되었습니다. 일반적으로, 오스뮴 tetroxide (OsO4) 지질 뿐만 아니라 향상 된 대비의 고정에 사용 됩니다.
이 연구에서는 이전 논문21,27,,2829에 보고 되는 exosomes의 일반적인 형태를 확인 도움이 부정적인 얼룩이 지기. 부정적인 얼룩 뿐만 아니라 블록 단면 exosomes (그림 2)의 관찰에 대 한 좋은 방법 또한입니다. Sectioned 이미지 exosome의 내부 구조를 보여주었다, 그러나 반대로 부정적인 스테인드 가장은 exosome의 표면에 주로 나타났다. Sectioned 이미지 (그림 3)에 소포 exosomes30의 구조 기능으로 알려져 있다 루멘 구조를 보여주었다. 이 프로토콜에서 우리 블록 단면, immuno 얼룩이 지 고 가장 이미징 사용. 특히, 블록 구분은 때 이미지 다른 배율에서 필요할 수 있습니다 나중에 분석, 다른 현미경 검사 법 기술, 그리고 면역-골드 라벨 등 다른 분석에 유용 합니다. 단면, 후에 섹션 exosomes의 분류에 대 한 면역 염색을 위해 사용 될 수 있는 표 상자에 저장할 수 있습니다. 예를 들어 우리 exosomes의 기능을 공부 하는 고립 된 exosomes에서 알려진된 exosome 마커14 감지.
Immunogold 라벨 방법 라벨 또는 높은 배경 라벨을 포함 한 몇 가지 기술적인 문제가 있다. 아니 라벨 겪고, 1 차 항 체 농도 및 기본 보육 시간을 확인 하는 것이 좋습니다. 1 차 항 체의 낮은 농도 경우 항 체 적정 최적화 된 immunoreactivity을 찾을 수 될 수 있습니다. 그것은 또한 하룻밤 4 ° C에 외피 시간 증가 도움이 될 수 있습니다. 반면, 1 차 항 체의 농도 너무 높은 또는 높은 온도에서 부 화 시간 너무 오래, 배경 신호 증가 됩니다.

Extracellular 소포 (EVs) 지질 bilayer 소포 세포에 의해 분 비 되며 그들의 크기 범위는 30 300 nm 사이. EVs는 Hodgkin의 질병1환자의 소포에서 증거와 함께 1978 년에 처음 보고 되었다. 이러한 vesicles 40 ~ 120 나노미터 크기에 보고 했다. 1980 년에, 그것은 EVs 응고 시스템 및 혈전 증, 암 환자2혈관 내 혈액 응고의 형성에 관련 된 것으로 알려졌다. 30 년 후, EVs 종양 침공, 면역 탈출 및 신생3홍보 하는 중요 한 요소 되도록 보고 되었습니다. 또한, EVs의 기능 세포의 상호 작용 분야에서 염증, 면역 장애, 신경 질환 및 암4레 귤 레이 터로 공부 되었다. EVs는 특정 생체 단백질, mRNA, 예측에 관한5등 포함, 진단 및 치료에 그들의 잠재적인 응용 프로그램 분석된6,7되었습니다. EVs는 exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, 미, promininosomes, argosomes, 및 그들의 세포질 근원 및 생물학 기능3에 따라 exosome 같은 소포를 포함 한 하위의 구성 범주. 또한, 그들의 속에 따라, 이러한 EVs 수 나눌 수 microvesicles (창 고 microvesicles, 100-1000 nm) 및 exosomes (30-300 nm)8,9. 이러한 가운데,는 exosome 면역 응답10, 암11,12, 및 전염병13셀 의사 소통으로 보고 되었습니다.
조기 진단 위한 바이오 마커도 exosomes에 대 한 관심, 고 정화와 exosomes의 분자 이미징 기술을 함께 동반 되어야 합니다. 다양 한 크기와 exosomes, 그들의 기원과 기능14, 따라의 형태학은 전자 현미경과 같은 높은 해상도와 현미경 기법에 의해 구분할 수 있습니다. 대부분 exosomes 부정적인 스테인드 전송 전자 현미경 (TEM)15,,1617에 의해 시각 했다 그리고이 결과 전체 산 소포에 특정 단백질의 immunolabeling에 의해 확인 되었다 18. 여러 연구 그룹 스캐닝 전자 현미경, 원자 힘 현미경19,20및 Cryo 편21,22를 통해 구조를 보고 있다. 그러나, 이러한 기술은 exosome 구조를 공부 하는 데 유용 하는 동안 그들은 충분 하지 않습니다는 exosome 안에 있는 특정 단백질의 위치를 관찰. 따라서, 우리는 특정 단백질의 라벨로 exosomes 이미징에 대 한 프로토콜 도입. 우리 블록 준비, ultrathin 단면화 및 immunostaining에 있는 exosome 단백질의 자세한 위치를 ascertaining에 대 한 적용. 이 부정적인 얼룩이 지 고는 exosome의 전통적으로 사용 되는 전체 산 immunostaining와 비교 되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="583">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">16200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium cacodylate&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Osmium tetroxide 1 g crystal</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">19100</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">acetone</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>1B2031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Spurr medium</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td style="width:119px;">18108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Ultra-microtome</td>
			<td style="width:81px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">UCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Lead citrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission Electron Microscopy</td>
			<td style="width:81px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">H7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">nickel grid</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">G200-Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Copper grid</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">G200-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">glycine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>022K5404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:81px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:81px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">25557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">1st Antibody</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">purification in manually&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody</td>
			<td style="width:81px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">329710</td>
			<td style="width:167px;">Whole mount Immumogold</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Purified Mouse IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
			<td style="width:81px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">401202</td>
			<td style="width:167px;">Whole mount Immumogold (Control)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle</td>
			<td style="width:81px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">silver paint</td>
			<td style="width:81px;">CANS</td>
			<td style="width:119px;">CTP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">aluminum stub</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">75622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">FIB-SEM</td>
			<td style="width:81px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">AURIGA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission Electron Microscopy</td>
			<td style="width:81px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JEM2200FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:81px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JFC1100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Carbon grid</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">121119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">FCF200-CU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Formvar carbon coated&#160; Nickel Grid (200 mesh)</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">FCF200-NI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy

Exosomes는 나노 크기의 세포 외 체액 분 비 소포 그리고 그들을 분 비 하는 셀의 특성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 내용과 secreted vesicles의 형태 셀 행동 또는 생리 적 상태, 예를 들면 세포 성장, 마이그레이션, 분열, 그리고 죽음을 반영합니다. Exosomes의 역할 매우 크기에 따라 달라질 수 있습니다 따라 다르며 exosomes의 크기 30에서 300 nm. Exosome 이미징에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 부정적인 얼룩, Cryo-전송 전자 현미경, 스캐닝 전자 현미경, 원자 힘 현미경을 기반으로 하는 다른 결과 이다. 전형적인 exosome 형태학 부정적인 얼룩 통해 평가 컵 모양 이지만 더 세부 사항은 아직 명확. 구조 연구를 통해 잘 특징이 있는 exosome 의료 및 제약 분야에서 필요한 특히 이다. 따라서, 함수 종속 형태 라벨 exosome의 상세한 구조에서 특정 단백질 등 전자 현미경 기법에 의해 확인 되어야 한다. 자세한 구조를 관찰, ultrathin sectioned 이미지와 exosomes의 부정적인 스테인드 이미지 비교 되었다. 이 프로토콜에서 부정적인 얼룩이 지기, 전체 마운트 immuno 얼룩이, 블록 준비, 얇은 섹션, 그리고 면역-골드 라벨을 포함 하 여 exosomes의 영상에 대 한 전송 전자 현미경 검사 법 하는 것이 좋습니다.

현재, exosomes 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 크기와 모양 범주로 분류 됩니다. 그림 2 는 부정적인 exosome 및 전체 마운트 상태에 면역 이라는 exosome 스테인드. 그림 3 얇은 단면 후 sectioned exosome와 면역 이라는 exosomes를 보여준다. 면역-골드 얼룩 특정 단백질의 항 체를 사용 하 여 긍정적으로 exosome 식별은 exosome 단백질의 종류를 분류 하는 데 사용 됩니다. 이 종이에 프로토콜 플라스틱 sectioned exosome와 전체 마운트 immunostaining 및 immunostaining를 사용합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56482/56482fig2.jpg"> 
그림 2: 얼룩 및 전체 마운트 면역 얼룩 네거티브. (A) Exosome 형태학 부정적인 얼룩이 지기에 의해 관찰 된다. Exosomes는 그들의 컵 모양의 형태를 보여줍니다. (B, C) (반대로 인간 CD274; 특정 단백질의 위치를 보여줍니다 모든 마운트 면역-골드 얼룩 PD-L1) exosome에. 흰색 화살표의 위치를 나타냅니다. 검정색 화살표는 배경 신호의 위치를 나타냅니다. ((D)) immunostaining 결과의 부정적인 통제. Isotype 제어는 immunostaining 과정에서 1 차 항 체에 의해 사용 되었다. 눈금 막대 = 100 nm.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56482/56482fig3.jpg"> 
그림 3: sectioned exosomes의 전자 현미경 사진. (A) Exosomes' 둥근 모양 형태 (B) 박스 exosome EMAN 프로그램에 "복 서" 도구를 사용 하 여. (C, D) 면역-골드 이라는 중 금속 얼룩과 exosome. 검은색 화살표는 금 입자 (A-D) 규모를 나타냅니다 바 = 100 nm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56482/56482fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

이 프로토콜 전송 전자 현미경 검사 법이 부정적인 얼룩이 지기, 상세한 구조 및 면역-골드 라벨 exosomes에 특정 단백질의 위치를 확인 하려면 ultrathin 단면에 필요한 다양 한 기법을 설명 합니다.

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

sample-preparation-imaging-exosomes-transmission-electron

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

38.6K 조회수.  Asan Medical Center. 이 프로토콜 전송 전자 현미경 검사 법이 부정적인 얼룩이 지기, 상세한 구조 및 면역-골드 라벨 exosomes에 특정 단백질의 위치를 확인 하려면 ultrathin 단면에 필요한 다양 한 기법을 설명 합니다.

비디오: Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

연구

생물학

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.