저자 그들의 지원, S. A. 뮐러 중요 한 토론 및 신중 하 게 읽고 원고, A. Fecteau-LeFebvre EM, 리카 르도 Adaixo, 프랭크와 기술 지원에 대 한 바젤 대학의 Biozentrum의 워크샵을 감사 하 고 싶습니다. 레만 막 단백질에 대 한 테스트 샘플 (C-중국, Biozentrum, 바젤의 대학에서 모두)와 A. 엥 겔, 그의 영감 대화에 대 한 명예 대학 바젤. 테스트 샘플 P. Ringler, M. A. 제공한 친절 하 게 Mahi, T. Schwede (Biozentrum, 바젤의 대학), P. Leiman (구조 생물학 및 생물 물리학, EPFL의 실험실) 및 R. 디아즈-아 (뉴욕 구조상 생물학 센터, 미국). 프로젝트는 스위스 Nanoscience 연구소 (SNI, 프로젝트 P1401, ARGOVIA 프로젝트 MiPIS)와 스위스 국립 과학 재단 (SNF, 프로젝트 200021_162521)에 의해 지원 되었다.

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저자 스테판 A. 아놀드, 헤 닝 Stahlberg와 토마스 브라운 선언 다음 경쟁 금융 이자: cryoWriter 개념은 부분의 특허 출원 PCT / EP2015/065398 및 EP16194230.

'CryoWriter' 악기와 샘플 격자에 대 한 NS 및 곳을 알아내는-EM 크기 nL 총 샘플 볼륨에서 준비 하 고 고전적인 종이 blotting 단계를 완전히 방지 하는 데 필요한 프로토콜도 제공 됩니다. 미세 원칙과 micromechanical 시스템은 이것을 가능 하 게 cryoWriter에 결합 됩니다.
우리의 경험을 보여줍니다이 원고에 소형된 메서드를 사용 하면 EM-그리드 준비에 대 한 매개 변수 공간 고아 한 방법, 그리고 엄격한 사용자 통제 보다 큰. 중요 한 것은, 달성 증가 재현성 샘플 버퍼 시스템, 실제 실험을 수행 하기 전에 최적의 매개 변수를 확인 하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 테스트 단백질 보충 사전 검열 수 있습니다. 이 최소는 절대 관심의 샘플의 소비를 유지 하 고는 것이 좋습니다. 두 NS 및 곳을 알아내는 EM 그리드 준비에 대 한 중요 한 단계는: (i) 못쓰게 펌프 시스템; 하위 nanoliter 볼륨 분배, 시스템의 액체 (물) 고 해야 합니다 degassed 무료 거품. (글로우 방전의 플라즈마 청소 단계; ii) 정밀 하 게 제어 그들 격자의 표면 특성은 재현성 결과 위해 중요 한. (iii) 샘플 컨디셔닝; 컨디셔닝, 예를 들어, NS와 필요한 시간은 microcapillary24의 노즐 형상에 뿐만 아니라 버퍼 유형, 소금 콘텐츠 및 농도 (그림 3)에 따라 달라 집니다. (4) 증발 속도 NS EM 양적 EM;에 대 한 준비에 대 한 커피 고리 효과 NS 그들 준비의 정량 분석을 금지 수 있습니다 그리고 느린 증발 속도 DP-단계에 의해 제어에 의해 억압 해야 합니다.
제시 그리드 준비 방법의 다른 측면은 특정 샘플에 대 한 다양 한 프로토콜의 개발을 수 있도록 자유롭게 결합 수 있습니다. 전형적인 예는 cryo-EM;에 대 한 그리드 준비 전에 컨디셔닝 단계 고해상도 그들, 예를 들어, 글리세롤, 방지 하는 물질의 제거 될 것 이라고 ligands는 격자 준비가; 전에 컨디셔닝에 의해와 같은 중재자 분자의 도입 또는 단일 세포 lysate 여 NS 또는 곳을 알아내는-EM (그림 6)의 검사.
마이크로 및 제시 방법에 최소한의 샘플 금액을 사용 하 여 완전히 종이 blotting 단계에 대 한 필요성을 제거합니다. 이것은 큰 장점은 종이 럽은 단백질, 잠재적으로 원치 않는 이온 샘플 오염 및 본질적으로 이어지는 대규모 샘플 손실에 대 한 가혹한 치료 때문. 다른 한편으로, 잠재적으로 형성 하는 곳을 알아내는-EM 샘플 고전적인 방식으로 준비가 때 얇은 샘플 영화의 공기-물 인터페이스에 의해 발생 하는 효과 cryoWriter 사용 하는 경우를 방지 하지 됩니다. 곳을 알아내는-그들에 대 한 적합 한 격자는 샘플 응용 프로그램 및 vitrification (데이터 표시 되지 않음) 사이의 미만 0.2 s 대기 시간으로 준비 수 있습니다. 그러나, 단백질 보급에 의해 몇 나노초에 나노미터의 몇 가지 tenths 여행, 아직 충분 한 시간이 있다 100 nm 두꺼운 샘플 영화의 공기-물 인터페이스와 여러 번 충돌 하. 그러나, 공기-물 인터페이스에 집착 하는 단백질의이 짧은 시간 간격으로 크게 줄어들 수 있습니다 및 단백질 변성을 방지 수 있습니다 또는 입자 방향 제한. 공기-물 인터페이스에서 중요 한 단백질을 보호할 수 있습니다 또 다른 유망한 방법은 낮은 분자량 표면 활성 물질에 의해 샘플 영화를 커버입니다. 이러한 화합물 그리드 준비 하기 전에 cryoWriter에서 컨디셔닝 단계 빠르게 도입 될 수 있습니다. 미세 시스템의 높은 표면 볼륨 비율 샘플 microcapillary 표면에 난다 흡착에 의해 잠재적으로 손실 될 수 및 입자를 계산 하 여 정량 분석을 방해로 cryoWriter의 더 한계입니다. 문제는 두 가지 방법으로 해결: 먼저, 샘플은 microcapillary 내에서 긴 거리를 여행 하지 않습니다. 실제로, nanoliter 샘플 볼륨 처리를 통해 모 세관 끝에 남아 있습니다. 둘째, 셋째 비교적 큰 내부 직경, 예를 들어, 180 µ m.와 microcapillaries을 사용 하 여 볼륨 비율을 감소 추가,는 microcapillaries의 표면 필요한 경우 쉽게 패 수 있습니다 예를 들어, 그들을 치료 하 여 상업적으로 사용 가능한 polylysine 에탄올 glycols (PLL-PEG)와 함께
EM에 사용 되는 단일 입자 접근 방식에 의해 단백질의 고해상도 분석에는 개별 단백질 입자의 몇 백만 이미지 100000을 필요 합니다. 즉, 미세 기술 구조 조사에 대 한 충분 한 단백질 복합물을 제공할 수 있습니다. 단백질 복합물 (약 1 시간) 최소 셀 금액 (약 40, 000 셀)에서 빠른 격리에 대 한 소형된 면역-강수량 메서드 이전28개발 되었다. 이 메서드는 cryoWriter의 소형된 샘플 준비 단계에 직접 연결 됩니다 이제. 최종 목표는 모든 미만 2 시간을 요구 하는 빠른 단백질 분리 및 곳을 알아내는-EM 그리드 준비에 대 한 통합 된 미세 파이프라인을 개발 하는 것입니다. 또한, 그림 6, 분 양과 샘플 준비와 거의 무손실 컨디셔닝 및 그리드 준비 절차는 cryoWriter를 사용 하 여 달성에 필요한 자료의 볼륨에 의해 증명으로 가능 하 게 단백질 연구 개별 셀 단지 함께, 소형된 면역-강수량 메서드와 cryoWriter 같이 우리가 최근 열 충격 실험24"단일 셀 시각적 proteomics" 라는 새로운 단백질 방법의 기초를 하다. 데이터 분석 알고리즘 "비주얼 proteomics" 이미지의 분석에는 현재 테스트 되 고.

하드웨어 및 소프트웨어 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 단백질 복합물의 구조 분석에 대 한 대규모 최근 몇 년 동안 선진 했다. 개선 사항을 "해상도 혁명"1,2 도를 포장 하 고 근본적으로 구조 연구를 변경. Cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)3,4, 방사선 민감도 감소 방지 하는 동안 생리 적 조건에 가까운 아래 생물 샘플의 준비를 허용의 도래와 함께 시작 하는 혁명 높은 진공에 샘플 증발 전송 전자 현미경5 다음 년에서 증분 기술 진보는 점차적으로 달성 해상도 증가. 이러한 혁신 중 필드-방출 총6,7, 적용 되었고, 더 최근에, 최대 가능성 방법8,9등 데이터 분석 알고리즘을 개선. 직접 전자 탐지기 카메라10,11,,1213, 영화 모드 이미징 및 동반 소프트웨어 개발14,15, 16 , 단일 입자 분석 (대 한 검토 보고 챙, Grigorieff, 외. 생물 학적 샘플에 대 한 원자 해상도 달성 하는 데 필요한 마지막 돌파구를 제공 하는 17, 18). 곳을 알아내는-그들의 중요성 최근 개척자의 3 화학을 위한 노벨상의 포상에 의해 인식 되었다.
가장에 의해 생물 학적 샘플 이미지, 샘플 (이후 "그리드 준비" 라고도 함) 안에 그리드를 로드 하는 데 사용 하는 방법 결과 샘플 레이어 (i) 충분히 얇은 인지 확인 해야 합니다 (< 100 nm) 흩어져 탄력에 의해 광범위 한 소음을 방지 또는 곱하기 전자 현미경의 높은 진공을 견 디는 전자, (ii)와 (iii) 방사선 손상에서는 생체를 보호 합니다. 두 가지 주요 방법 이러한 빌드하거나 수행 하는 데 사용 됩니다: 부정적인 얼룩(NS)19,20 절차 (그림 1A) 얇은 탄소 필름 샘플을 흡착, 비정 질 중 금속에는 생체를 포함 그리고 어셈블리 공기에 건조를 허용 합니다. 이것은 간단 하 고 빠른, 그리고 로드 EM 격자 (이후 "샘플 격자" 라고도 함)는 쉽게 저장 하 고 시간의 연장된 기간에 대 한 유지 될 수 있다 (일반적으로 년). 가장, 준비 NS 인해 높은 콘트라스트를 전시 하 고, cryo-준비 보다 더 높은 전자 복용량을 용납 하지만 해상도 약 20 Å. Cryo-EM 절차 (그림 1B) 고용 홀리 탄소 지원 제한. 샘플 솔루션의 박막 구멍에 걸쳐 스팬 및 EM 그리드 제, 일반적으로 액 화 탄을 급속 하 게 그것은-150 ° c에 뛰어들었다 결과 아 몰 퍼스, vitrified, 50 ~ 100 nm 두꺼운 필름 지원 구멍에서 솔루션의. 이 얇은, 비정 질 영화 견 디는 전자 현미경에서 높은 진공으로, 이상적인 케이스에서 그들의 네이티브 국가에서 생물 학적 구조 합니다. 프로시저에서 고해상도 이미지를 생물 학적 샘플 수 있습니다. 그러나, 샘플 그리드 유지 되어야 한다 온도 아래에서-150 ° C 깡통을 피하기 위해 모든 시간에. 때문에 낮은 온도, 하지만 대비 상대적으로 높은 전자 복용량을 사용 하 여 이미지 수 이며 신호 대 잡음 비율 역시 낮은. 따라서 평균 기술 대비 증가 고용 하 고, 고해상도 3 차원 (3D) 지도 제공 하는 샘플은 다른 각도에서 몇 군데, 개축 될 수 있다. 가장 일반적으로 사용 하 고 매우 성공적인 지금 3D 재구성 방법은 단일 입자 접근. 최근 검토 쳉 여러분18참조.
부정적인 얼룩 가장 (NS-EM) 인지 검사 및 품질 관리에 대 한 중요 한 높은 콘트라스트 필요할 때 제한 된 양의 샘플을 사용할 수 있는 경우 (흡착 탄소 필름에 일반적으로 집중 하 고 샘플). 단일 입자 cryo-그들은 단백질 구조의 고해상도 3D 복원에 대 한 겨냥 한 경우 골드 표준 방법입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> 그림 1: 원리의 가장 그리드 준비 및 클래식 (패널 A, B)와 미세 접근 (패널 C, D) 사이 비교. A) 클래식 NS-EM 그리드 준비: 샘플의 µ L 3에 대 한 지속적인 탄소 필름 (이후에 'NS-EM 격자' 라고도 함)으로 덮여는 그들 격자에 손으로 pipetted는 (i). 약 10 부 화 후 s, 필터 종이 얇은 물 필름에 흡착된 생체를 떠나 측면 (ii)에서 과잉 액체를 멀리 오 점 하는 데 사용 됩니다. 그 후, 단백질 중 금속 소금 솔루션, 예를 들어, 20 2 %uranyl 아세테이트 incubated s (iii), 그리고 다시 액체 필터 종이 (iv)를 사용 하 여 측면에서 blotting에 의해 제거 됩니다. 마지막으로, EM-그리드 건조 한 공기에 남아. B) 클래식 cryo-EM 그리드 준비: 샘플에 대 한 3 µ L 홀리 탄소 필름에 손으로 pipetted는. 얇은 샘플 영화를, 과잉 액체 종이 blotting 얼굴-에 의해 하나 또는 양쪽 (ii)에서 제거 됩니다. 마지막으로, 격자는 급속 하 게 속으로 뛰어들었다 vitrification (iii)에 대 한 액체 탄. C) cryoWriter 설정을 사용 하 여 NS-EM 그리드 준비: A 5 nL 볼륨 (i) microcapillary를 사용 하 여 샘플 재고에서 발음. 샘플 컨디셔닝, microcapillary 팁은 컨디셔닝 솔루션으로, 예를 들어, 2% 염화 아세테이트 포장 되어있습니다. 이온 및 작은 분자 확산 (ii)로 교환 됩니다. 참고는 microcapillary의 크기는 전체 프로세스를 구동 하는 보급을 보장 하는. 단백질 소금 이온 보다 훨씬 낮은 확산 상수 있고24를 크게 잃지는. 마지막으로, 샘플 격자에 적절 하 게 이며 (iii) 건조 수 있었습니다. D) cryoWriter 기반 방법을 사용 하 여 곳을 알아내는-EM 그리드 준비의 원칙: 홀리 탄소 필름으로 커버는 그들 격자 온도 제어 플랫폼의 표면에 놓이고 핀셋에 의해 개최. 플랫폼의 온도 노점 온도 그리드 환경에서 오프셋에서 제어 됩니다. 그리드 샘플을 포함 하는 microcapillary를 기준으로 이동 하 고는 microcapillary 그리드 위에 몇 마이크로미터까지 낮춘 다. 그 후, 샘플의 몇 nanoliters는 적절 하 게 그것에서 무대 나선형 패턴;에 이동 하는 동안 과잉 액체는 다시 발음 (i). 못쓰게는 그들 격자 후는 microcapillary 철회 하 고 격자 온도 제어 플랫폼에서 (그 후이 슬 포인트 (DP) 단계 라고 함) 제어 양의 샘플 증발을 허용 하도록 짧은 시간 동안 남아 있습니다. 동결 하는 식이 대 한 그리드 빠르게 핀셋 (ii)를 사용 하 여 스테이지에서 철수, 수직 위치에 90 °에 의해 뒤집힌 이며 제 목욕 (iii) (이후 ' 선택 및 식이 ' 메커니즘 이라고 함)으로. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
불행히도, NS 및 곳을 알아내는-EM 사용 그리드 준비 방법은 그들은 발명 이후 크게 개선 하지 했습니다. 현재 단점 높은 샘플 소비 (1 mg/mL 단백질의 약 3 µ L) 이며 샘플의 다량 (> 99%) (그림 1A, B)를 잃었다. 또한, 클래식 cryo-그들에 대 한 격자를 준비 하는 데 사용 방법은 단백질에 대 한 가혹한 절차: 먼저, 그것은 포함 한 광범위 한 얼굴에 종이 blotting 단계 (그림 1B, ii), 그리고, 둘째, 단백질은 공기-물 인터페이스에 노출 되 21의 상당한 양에 대 한입니다. 여기, 사전 조건 샘플에 대 한 다른 방법, 샘플 그리드 준비 및 사후 처리 (그리드 건조 또는 vitrification) NS-EM (그림 1C) 또는 곳을 알아내는-EM (그림 1D)에 대 한 제공 됩니다. "CryoWriter" 라는 자체 내장된 설치 소형된 샘플 처리 기술 및 미세 원리를 사용 하 여 발음, 조건 샘플, 피하 종이 완전히 더 럽 히 고 얇은 샘플에 대 한 대체 방법을 제공 하는 걸을 곳을 알아내는-EM. 그것은 크게 샘플 소비를 감소 하 고 전체 샘플 준비에 사용자 제어를 향상. 또한, 메서드 수 소설 실험적인 응용 프로그램; "단일 셀 시각적 proteomics"22,23,,2425라는 접근 방식에서 개별 셀의 격리 된 생물 학적 구성 요소 작성 등

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1079">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Liquid handling</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microcapillary tip</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-100-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 100 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td>FS360-150-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 150 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Conductive sleeve</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>CONGAS-1&#160;</td>
			<td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fused silica tubing</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>TSP-150375</td>
			<td>TSP Standard FS Tubing, 150 &#181;m ID, 363 &#181;m OD, 5 meter</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PressFit Connector</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>2525LD</td>
			<td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10 &#181;l</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>HA-80001</td>
			<td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump controller</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000093</td>
			<td>neMESYS controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump dosing unit</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000095</td>
			<td>neMESYS dosing unit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Dew point sensor</td>
			<td>Meltec</td>
			<td>UFT75-AT</td>
			<td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature sensor</td>
			<td>Sensorshop24.ch</td>
			<td>LS7-PT1000-1.0-3L</td>
			<td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier controller</td>
			<td>Cooltronic</td>
			<td>TC2812&#160;</td>
			<td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier element</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-127-14-15-S</td>
			<td>40x40 mm</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water-cooling block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water pump</td>
			<td>Digitec.ch</td>
			<td>294877</td>
			<td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water heat exchanger block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small water coolers</td>
			<td>PCHC.ch</td>
			<td>223050</td>
			<td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small peltier elements</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-031-10-15-S</td>
			<td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &#176;C, 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mechanics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Linear stage z-axis</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>M-404.2PD</td>
			<td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Stage controller</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>C-863</td>
			<td>Mercury Servo Controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microscope xy-axis stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIL5</td>
			<td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small permanent magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td>S-05-08-N</td>
			<td>Rod magnet &#216; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small electromagnet</td>
			<td>Schramme</td>
			<td>EG1025A02/110</td>
			<td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Controller electromagnet</td>
			<td>Conrad.ch</td>
			<td>MST-1630.001 7</td>
			<td>Electromagnet control PCB board</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Solenoid hub</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>HD8286-R-F-24V100%</td>
			<td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mini tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-M5S-PS</td>
			<td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various optomechanical parts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various mechanical parts</td>
			<td>Workshop Biozentrum, University Basel</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Laser diode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPS780S</td>
			<td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Photo detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">EM grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="15">
			<td height="15" style="height:15px;">DURASIN FILM TEM</td>
			<td>emsdiasum.com</td>
			<td>DTF-03523</td>
			<td>30 nm DuraSiN&#8482; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Buffers / Neg. stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537&#160;SIGMA</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoVan 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain vanadium based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoW 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain tungsten based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">openBEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td colspan="2" height="16" style="height:16px;">CryoWriter control software (openBEB plugin)</td>
			<td></td>
			<td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

최근 기술적 진보 때문 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM) 급속 하 게 원자 해상도로 단백질 복합물의 구조 분석에 대 한 표준 방법 되고있다. 그러나, 단백질 분리 기술 및 그들에 대 한 샘플 준비 방법 병목 현상 유지. 개별 단백질 입자의 비교적 적은 수 (몇 백만에 100000) 단일 입자 그들 접근, 소형된 샘플 처리 기술 및 미세 원칙 하에 의해 단백질의 고해상도 분석에 대 한 이미지 필요 가능.
소형된 종이 blotting 무료 EM 그리드 준비 방법 샘플 사전, EM 그리드 못쓰게 조화와 nanoliter-볼륨 샘플의 사용 후 처리에 대 한 제공 됩니다. 메서드를 사용 하 여 분배 시스템 하위 nanoliter 정밀 제어 액체 통풍 관 및 EM 그리드 못쓰게, 플랫폼 위에 EM 그리드 및 선택-및-다이빙-메커니즘 샘플에 대 한 상대 습도 그로 인하여 결정 격자 온도 제어 vitrification입니다. 곳을 알아내는-EM, EM 격자 온도 제어 스테이지에 배치 및 모 세관으로 발음 하는 샘플은. 모 세관 팁 격자 표면에 근접에서 위치, 그리드 샘플 로드 되 고 초과 microcapillary로 다시 발음입니다. 그 후, 샘플 영화 안정 이며이 슬 포인트를 기준으로 플랫폼 온도 오프셋에 의해 통제 하는 제어 물 증발에 의해 약간 박 형. 주어진된 시점에서 선택 식이 메커니즘 샘플 vitrification에 대 한 액체 탄 액된 EM 그리드 전송 빠르게 실행 됩니다. 또한, 샘플 컨디셔닝 방법 부정적인 얼룩 (NS) 그들에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨을 준비 사용할 수 있습니다.
방법론 크게 샘플 소비 하 고 기존의 방법에서 사용 필터 종이 blotting 단백질, 잠재적으로 유해한 접근을 피하십시오. 또한, 필요한 샘플의 소문자 금액 수 있습니다 빠른 샘플 컨디셔닝, "시각적 proteomics,"에 대 한 단일 셀 세포 또는 정량 분석을 위한 "무손실" 총 샘플 준비와 함께 같은 새로운 실험 전략을 복잡 한 샘플입니다.

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Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

19.5K 조회수.  University of Basel. 악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

비디오: Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

연구

생물학

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.