저자 (그랜트 1012409 제너 시스에 링크 된 프로젝트) 호주 보건 및 의료 연구 위원회의 지원을 인정 한다.

이 프로토콜 남쪽 동부 쪽 시드니 인간의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 대학의 뉴 사우스 웨일즈의 인간 연구 윤리 위원회에 의해 비준 되었다. 탯 줄 혈액 건강 한 기증자 로부터 얻은 의해 시드니 코드 혈액 은행 (시드니, NSW, 호주)를 제공 했다. 볼륨 약 100 mL의이 절차를 위해 사용 되었다.
참고: 클래스 II biosafety 무 균 기술을 사용 하 여 캐비닛에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 코드 혈액 주머니의 외부 오염을 (가 위, 핀셋) 불 임 악기를 사용 하 여이 절차에 대 한.
1. 탯 줄 혈액 세포 준비 및 절연 CD34의+ 세포
<ol>
	<li>살 균 분리 버퍼 (SB) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.2, 그리고 포함 된 0.5% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA를 준비 합니다.</li>
	<li>(혈액 10 mL 당 1 개의 관은 필요) 50 mL 원뿔 관으로 SB의 10 mL를 분배. 10 mL 주사기에 장착 G18 무딘 바늘을 사용 하 여, 혈액 10 mL 가방에서 그리고 포함 하는 SB의 10 mL 50 mL 튜브로 분배.</li>
	<li>두 개의 레이어를 만드는 희석된 혈액을 포함 하는 관의 바닥에 림프 구 분리 미디어 ( 재료의 표참조)의 15 mL를 추가 합니다. 참고: 다른 레이어를 혼합 하지 마십시오 튜브의 하단에 천천히 미디어 분배.</li>
	<li>휴식 및 가속 없이 실 온 (RT)에서 30 분 동안 1200 × g에서 튜브를 원심.</li>
	<li>단 세포 (각 관에서 약 5-10 mL) 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 새로운 50 mL 튜브에 들어 있는 튜브의 중앙 레이어를 전송 합니다. SB 각 관 50 mL의 총 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>실시간 삭제에서 10 분 동안 400 × g에서 원심은 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 셀 펠 릿 하고있다 결합의 5-10 mL에 파스퇴르 피 펫으로 신중 하 게 정지 세포와 볼륨 50 mL SB와 함께.</li>
	<li>수 셀 Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer를를 사용 하 여 또는 자동 세포 카운터 ( 재료의 표참조). CD34의 비율을 확인 하려면+ 세포 샘플, resuspend 2.5 × 105 셀 SB와 얼룩의 100 µ L에 4 ° c.에 15-30 분에 대 한 안티-CD34-PE 항 체의 10 µ L을 추가 하 여 Cytometry (그림 1A) 분석.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리기 튜브 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 단 세포가이 단계에서 동결 수 있습니다.</li>
	<li>108 셀 당 SB의 300 µ L 셀 resuspend FcR 인간 IgG의 100 µ L를 추가 (차단 시 약, 재료의 표참조) 및 100 µ L 108 셀 당 CD34 자석 구슬의. 부드럽게 혼합 하 고 30-40 분 동안 4 ° C에서 품 어. 참고: 단일 셀 서 스 펜 션은 필수 (필요한 경우 통과 셀 30 µ m 필터 시 약을 추가 하기 전에). 또는 그이 하 108 셀에 대 한 여기에 설명 된 시 볼륨을 사용 합니다. 10 이상8 셀에 대 한 시 약 (SB, 솔루션, 그리고 CD34 자석 구슬 차단)를 따라 확장할.</li>
	<li>LS 분리 열 인큐베이션 기간 동안 준비 하 여 마그네틱 홀더에서 LS 열을 배치 하 고 유출 하고있다 삭제의 3 mL로 세척. 참고: LS 분리 열 최대 2 × 108 총 셀으로 로드할 수 있습니다. 작고 큰 열 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5-10 mL SB의 셀 혼합물에 추가 하 고 400 × g에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 1.5 ml SB의 세포 및 세포 현 탁 액 (1.5 mL) LS 열에 로드 합니다. 레이블이 없는 셀 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)에 포함 된을 통해 흐름을 수집 합니다. 액체 드레인과 1.5 mL SB의 열을 씻어 보자.</li>
	<li>(3 mL)를 통해 수집 된 흐름 열에 다시 로드 하 고 동일한 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)을 통해 흐름을 수집. 3 번 3 mL SB와 LS 열 세척. 참고: 필요한 경우 셀 부정적인 분수 (12 mL)에 얼룩이 질 수 있다 안티 CD34 항 체 확인 CD34의 캡처로+ LS 열에 의해 세포.</li>
	<li>마그네틱 구분 기호에서 열을 제거 하 고 2 mL SB의 새로운 15 mL 튜브에 주사기 플런저를 천천히 세포를 플러시.</li>
	<li>다시 열에 자석 분리기 및 로드 셀의 2 mL에 다시 열을 놓습니다. 통해 흐름을 수집 하 고 2 mL SB로 씻어. 이것은 부정적인 분수 #2 (4 mL) 이다.</li>
	<li>자석 분리기에서 LS 열을 제거 하 고는 CD34 수집 주사기 플런저와 꾸준히 고 단단히 하고있다 플러시 세포의 2 개 mL를 추가+ 셀 분수. Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 400 × g에서 긍정적인 분수와 함께 원심 분리기 튜브 폐기는 상쾌한. CD34에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 셀 resuspend+ 셀 (SFM, 재료의 표참조). 참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 셀 수 있는 동결 액체 질소에이 단계에서.</li>
</ol>
2. 순도 확인 격리 된 CD34의+ 세포
<ol>
	<li>10 µ L 안티-CD34-PE 항 체와 20 µ L 안티-CD45-PerCP 항 체 4 ° C (사용 별도 튜브 isotype 컨트롤)에서 15 분에 대 한 긍정적인 분수에서 2 × 104 셀을 얼룩 (그림 1B).</li>
	<li>씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 400 × g에서 원심 SB의 200 µ L 펠 릿 Resuspend.</li>
	<li>흐름 cytometric 분석을 수행 하 고 파편 (그림 1B)을 제외 하도록 라이브 셀 인구 게이트. PE 및 PerCP isotype 컨트롤 (그림 1B)를 사용 하 여 PE 및 PerCP 긍정적인 인구에 대 한 게이트를 설정 하 고 CD34의 비율 결정+/CD45+ 세포.</li>
</ol>
3. megakaryocyte 차별화
<ol>
	<li>씨앗 5 × 105 셀/mL CD34+ 12-잘 접시에 잘 당 50 ng/mL 재조합 인간 thrombopoietin (rhTPO)와 보충 SFM의 2 mL에 세포. 37 ° C, 5% CO2 습도 분위기에서 세포를 품 어. 셀 confluent 경우 분석을 위해 필요한 전에 세포를 수확 하 고 신선한 미디어와 rhTPO 여러 우물으로 분할. 참고: 두 개 또는 3 개의 우물 특별히 다른 시간 지점 (예를 들어, 7, 9, 10 일)에서 차별화를 모니터링 하는 준비 되어야 한다.</li>
	<li>다른 우물에 셀을 방해 하지 않고 차별화를 모니터링을 마련해 우물에서 세포를 수확.</li>
	<li>20 µ L 안티 GPIIb/CD41 FITC 항 체와 얼룩 세포와 10 µ L 안티-GPIX/CD42a-알 렉 사 Fluor 647 항 체 100 µ L. 마지막 볼륨에서 컨트롤 설정 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 튜브. 4 ° c.에 15 30 분 동안 품 어</li>
	<li>씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다.</li></ol>10 분 삭제는 상쾌한 400 × g에서 centrifuge 고 cytometry로 하고있다 분석의 200-300 µ L에 펠 릿을 resuspend.
	<li>각 fluorophore isotype 컨트롤 FITC와 알 렉 사 가루 647 긍정적인 인구 위한 게이팅 설정을 분석 합니다. CD41의 %를 확인 하려면 스테인드 세포 샘플을 분석+/CD42a+ 성숙 MK (그림 1C)을 대표 하는 긍정적인 셀을 두 번.</li>
	<li>세포의 현미경 시각화에 대 한 표면 마커 얼룩 세포 3.3에 설명 된 대로.<ol>
		<li>씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 400 × g에서 원심 분리기 Resuspend 100에서 펠 릿 SB 1000 x g 30 s. 공기 건조, 메탄올에 담그고 여 슬라이드에서 5 분 수정 셀에 유리 슬라이드에 스핀의 µ L 추가 20 µ L DAPI 포함 된 미디어를 탑재 ( 재료의 표참조) 는 coverslip로 커버 하 고 형광 현미경 (그림 2A)를 사용 하 여 시각화.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>세포내 항 원의 시각화, PBS에 셀 resuspend 및 paraformaldehyde (1% 최종 농도) 실 온에서 15 분으로 수정. 세포를 permeabilize, 트리톤-X 100 (0.1%)를 추가 하 고 PBS/0.1% 트리톤 X 100 2 mL와 함께 15 분 세척 셀에 품 어. PBS/0.1% 트리톤 X 100의 100 µ L에서 resuspend, vWf 및 안티 CD62p 항 체 (1: 200 희석) 안티 추가 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.<ol>
		<li>2 mL PBS/0.1% 트리톤-x 100 세척 하 고 10 분 동안 400 × g에서 원심, 동일한 버퍼의 100 µ L에서 resuspend 하 고 반대로 마우스 IgG-알 렉 사 594-토끼 IgG-알 렉 사 488 (1: 100)을 추가. 실 온에서 30 분 동안 incubate, 2 mL PBS/0.1% 트리톤-x 100 워시, 동일한 버퍼의 100 µ L에서 resuspend와 CD42b APC 안티의 20 µ L을 추가. 3.6.1 단계에서 설명한 대로 유리 슬라이드에 세포를 스핀 그리고 3.6.1 단계에서 설명한 대로 현미경 시각화에 대 한 샘플을 준비 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ploidy 결정에 대 한 12 또는 차별화의 13 일에 세포를 수확. 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분 및 100 µ L. 마지막 볼륨에서 20 µ L 안티 GPIIb/CD41 FITC 항 체와 얼룩 400 × g에서 원심 분리기 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.<ol>
		<li>SB의 1 mL와 함께 한 번 세척 하 고 당뇨 시트르산 버퍼 (1.25 m m 나트륨 구 연산 염, 염화 나트륨 2.5 m m, 3.5 m m 포도 당) 포함 20 µ g/ml propidium 요오드 화물 및 0.05%의 300 µ L에서 펠 릿 resuspend 트리톤 X 100. 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>RNase 20 µ g/mL의 최종 농도에 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 30 분 동안 품 어. 30000 50000 CD41 FITC+ 인구 (그림 2C)의 이벤트를 수집 하 여 cytometry 여 propidium 요오드 화물의 강도 결정 합니다.</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet 계산, 혈소판 열거, 및 혈소판 활성화
<ol>
	<li>8 또는 감 별 법 및 종자의 9 일에 1 × 104 셀/잘 50 ng/mL rhTPO와 보충 하는 신선한 SFM의 200 µ L에 48-잘 접시에서 (3.1 단계)에서 세포를 수확. 37 ° C, 5%에서 5 일 동안 문화 공동2. 참고: 정량 목적 3 중 웰 스 씨. 이 낮은 밀도 시각화를 위한 필요 하며 문화의 2 일 후 나타나는 시작 proplatelet-베어링의 mk. Proplatelets 일반적으로 계산 합니다. 피크 일 4와 5 사이입니다.</li>
	<li>10 배 또는 20 X 목표를 사용 하 여 거꾸로 가벼운 현미경에 전체 잘에서 proplatelet 베어링 MK의 수를 계산 합니다. 참고: 온수 (37 ° C) 현미경 단계가 바람직합니다, 이후 proplatelet 확장의 수축 하면 오랜된 시간 동안 실내 온도에 세포를 유지. Proplatelets MK 시체에서 긴 확장으로 관찰 된다. 각 MK 여러 proplatelet 돌출 할 수 있습니다. Proplatelets 개발는 MK의 몸 크기가 감소 합니다.</li>
	<li>세포를 수확 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g에서 원심. 3.3 및 3.4 단계에 설명 된 대로 20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체, 세포를 얼룩. Proplatelet 베어링 MK (pbMK)의 비율을 계산: pbMK (%) = [(Proplatelet 베어링 MKs/잘) / (총 CD41+ 세포 / 잘)] x 100</li>
	<li>문화 매체에 발표 하는 혈소판을 계산, 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다.<ol>
		<li>20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체 4 ° c.에 20-30 분으로 얼룩 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 컨트롤 튜브를 설정 합니다.</li>
		<li>SB의 150 µ L 구슬 세 50 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>흐름 cytometric 분석을 위해 로그 스케일 FSC 그리고 SSC를 설정 합니다. 4.4.1 게이팅 혈소판 (그림 3A)에 대 한 설정 섹션에 설명 된 대로 사용 하 여 정상적인 인간의 혈액 혈소판 혈소판이 풍부한 혈장에서 CD41 FITC와 스테인드.</li>
		<li>구슬 cytometry에 의해 계산 스테인드 혈소판 분석. 구슬 SSC 점도 (그림 3A) 대 FSC를 사용 하 여 계산의 1000 이벤트를 수집 합니다. CD41 FITC 긍정적인 이벤트 (그림 3B) 수식을 사용 하 여에 따라 혈소판의 수를 계산. µ L 당 혈소판 = [(CD41 FITC 긍정적인 이벤트의 번호)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/볼륨 샘플)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>혈소판 활성화를 분석 하려면 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다. 작은 셀을 5 분 동안 200 x g에서 Tyrode의 버퍼 (137 mM NaCl, 2.7 m KCl m, 1 mM MgCl2, 1.8 m CaCl2, 0.2 m m 나2HPO4m, 12 mM NaHCO3, 5.5 m m D-포도 당, pH 6.5) 및 원심 분리기의 1 mL를 추가 합니다.<ol>
		<li>상쾌한 그리고 혈소판 크기의 입자를 작은 10 분 800 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다.</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 Tyrode의 버퍼의 100 µ L에서 resuspend. 20 µ M. 최종 농도 20 µ L PAC1 FITC 항 체와 아데노신 diphosphate (ADP)의 추가 FITC 긍정적인 이벤트의 비율을 확인 하려면 cytometry로 20 분 분석에 대 한 실 온에서 품 어. 사용 신선한 인간 혈소판 긍정적인 컨트롤 (그림 3C)와 같은 방식으로 처리.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds.">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li><li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34+-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand.">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li><li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation,+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1/S+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation.">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li><li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+Immune+Thrombocytopenia.">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li><li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+thrombocytopenic+purpura:+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management.">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 프로토콜은 MK와 문화 탯 줄 혈액에서 혈소판의 일관 생산에 적합 합니다. 이러한 세포 MK 확산, 감 별 법, proplatelet 형성 및 혈소판 생산에 마약 또는 생물 학적 활동의 효과 같은 다양 한 프로세스를 연구에 사용할 수 있습니다.
다양 한 문화 미디어와 cytokine 조합 문학에서 제시 되었다. + 줄기 세포 요소, Flt 3 ligand, 일리노이-3, 일리노이-6 지원 CD34 등 cytokines의 추가 확산 세포. 그러나,이 확장 문화14감소 MK 순수성에서 발생합니다. 혈 청 무료 미디어와 혼자, rhTPO를 사용 하 여, 여기에 제시 된 방법은 조상 세포의 중요 한 확장을 허용 하지 않습니다 하지만 unilineage megakaryocytic 확산 및 감 별 법 및 MK의 일관 된 생산 (90-99 %CD41+ CD42a+ 두 배 긍정적인 세포) 다른 계보에서 오염 없이. MK 형성에 대 한 문화 기간은 10 ~ 12 일 stromal 지원 또는 급지대 셀에 대 한 필요 없이입니다. 이 호의 더 큰 문화 기간 (20 일 이상)17,18필요로 하는 다른 방법으로 비교 합니다. 현재 프로토콜에서 혈소판 수확량은 19-42 혈소판 입력된 CD34 당 420 혈소판 또는 MK 당+ 셀. 낮은 혈소판에서 대부분 프로토콜 결과18,19를 생성합니다.
수확량은 다른 방법에 상대적으로 높은, CD34 셀의 큰 소스 치료 사용에 대 한 혈소판의 충분 한 숫자를 생산 하기 위해 필요 합니다. 코드 혈액 MK 낮은 속도로 성숙, 일반적으로 작은 (낮은 ploidy 클래스의) 그리고 혈소판 생산 능력20감소. 그럼에도 불구 하 고, 신선한 UCB 일반적으로 더 접근 가능한 리소스 이며이 연구원에 대 한 상당한 우위를 나타냅니다. 또한 MK 및 치료 목표와 혈소판의 높은 수율을 생산할 수 있는 다른 방법이 설명된13,17있었다.
가변성을 고려의 몇몇 근원이 있다: A)의 코드 혈액 단위 품질. 24 시간 이내 수집만 코드 혈액 CD34의 원본으로 사용 해야 합니다+ 세포. 혈전을 포함 하는 코드 혈액 단위 또한 삭제 한다. CD34의 비율 B)+ 단 셀 분수 (1.8 단계) 세포:+ 미만 0.3 %CD34 단 셀 분수를 사용 하 여 셀 발생할 수 있습니다 상대적으로 낮은 순도 CD34의 낮은 수율+ 세포. 이 세포는 MK 차별화에 대 한 권장 하지 않습니다. 그것만 중력 힘에 의해 액체 드레인 수 있도록 필수적 이다 (예를 들어, 1.13, 1.14, 1.16 단계). 열 차단, 경우 자석에서 열을 제거, 새로운 튜브로 부드럽게 주사기 플런저와 함께 세포를 밀어 새로운 equilibrated 열에 다시 로드 하는 것이 좋습니다.
다양 한 조건에는 혈소판 수 그리고 기능에 영향을. 혈소판 외부 및 내부 출혈로 이어질 수 있는 혈소판 숫자에 표시 된 감소를 의미 합니다. 자동-면역 조건 면역 혈소판 (ITP) 등 약물 유발 혈소판 (DITP) 혈소판21,22의 잘 알려진 원인이 있습니다. 반성 루 푸 스, 류 마티스 관절염 등 다른 면역 질환은 혈소판에 해로운 효과 가질 수도 있습니다. 비 면역 혈소판의 원인에는 암 치료, 심한 외상, 감염, 골 수 실패, 그리고 수술 포함 됩니다. 화학 요법을 받고 또는 줄기 세포가 식을 받은 환자에서 혈소판의 높은 활용도 인해 혈소판 수혈 지난 수 십년 동안 꾸준히 증가 했다. MK와 혈소판 연구 의심할 여 지 없이 임상 응용 프로그램에 대 한 대규모 혈소판 생산의 개발에 도움이 됩니다. 체 외에서 생산 기능 혈소판의 혈소판 부족을 방지 하 고 내 화 환자에 혈소판 수혈을 허용 것 이라고. MK 차별화 및 혈소판 생산에서 체 외에 는 모두 병 적인 조건 및 혈소판 형성을 이끌어 내는 생리 적인 메커니즘의 이해와 연구에 대 한 중요 한 도구.

일반 실험실 사용에 대 한 기본 인간의 없으며 (MK)의 충분 한 숫자의 절연은 ~0.01% nucleated 세포1의 담당 그들은 골 수에서 낮은 주파수로 인해 가능 합니다. 편리한 대안 ex vivo 확장 및 조 혈 줄기와 조상 세포 특정 성장 요인의 존재의 차별화 이다. Megakaryocytic 문화에 대 한 가장 효과적인 성장과 차별화 요소는 MKs. Thrombopoietin (TPO) 생산 문화 시스템에서 고용 cytokines 줄기 세포 요소 (SCF; c-kit ligand), IL-11 및 인터 루 킨 (IL)-3 등의 숫자 되었습니다. 혼자 또는 다른 cytokines, SCF 및 IL-32등 효과적 이다. TPO 확산 MKs2의 성숙에 결과 줄기 세포 인구에 작동할 수 있다.
Proplatelets 라는 세포질 돌출부에서 MK 생산 혈소판, vivo에서, 약 1 x 1011 혈소판은 최대 1000는 150-400 x 109/L. 혈소판 생산에서 생체 외에서 혈소판 수를 유지 하기 위해 매일 형성 -배는 vivo에서 견적3, 그리고이 에겐 CD34를 사용 하 여 여러 문화 조건 보다 낮은+ MK와 혈소판 생산에서 체 외에서개선 하기 위해 조 혈 조상 세포. CD34의 초기 소스+ 세포 MK 차별화 사용 했다 인간 주변 혈액4. 다른 셀 소스 등이 골5,6, 배아 줄기 세포/유도 만능 줄기 세포 (ESC/iPSC)7, 탯 줄 혈액 (UCB)8,9,10 . 인간의 골 CD34+ 11 와 마우스 리니지 부정적인 골 수 세포5 생산 MK와 혈소판 시험관; 인간의 골의 가용성의 부족 CD34의 근원으로 그것의 사용을 제한 하는 그럼에도 불구 하 고,+ 세포. 대조적으로, ESC, iPSC 생체 외에서 혈소판 생산을 위한 세포의 무제한 소스를 나타냅니다. 이 세포에서 혈소판 생산 murine OP9 셀 등 오랜 문화 피더 세포를 필요합니다. 급지대 무료 조건에서 파생 된 혈소판 기능 덜12나타납니다. iPSC 파생 혈소판 때문에 그들은 큰 규모로 확장 될 수 있다 임상 설정에 사용 될 가능성이 있다. 이 프로세스에서는 녹음 방송 요인과 장기 세포 문화13lentiviral 중재 변환 합니다.
UCB는 CD34의 액세스할 수 있는 소스+ 세포에 쉽게 사용할 수 있는 설정 연구. TPO 혼자 코드의 차별화를 홍보할 수 있는 혈액 유래 CD34+ 세포와이 생겨나게 혈 청 보충 또는 급지대 셀과 공동 문화에 대 한 필요 없이 매우 순수 하 고, 성숙한 MKs. 다른 cytokines SCF UCB CD34에서 차별화를 저하 될 수 있습니다와 같은+ 세포, Flt 3 ligand 그리고 IL-11 미 숙 없으며14의 생산을 촉진 하는 동안. 이 프로토콜에 설명 합니다 매우 순수한 MK 문화 코드 혈액 CD34에서에서+ 의 생산 세럼 무료 조건에서 세포.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM II</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td>Serum-free media for CD34+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Isolation Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead kit ultrapure</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td>This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies</td>
			<td>1114545</td>
			<td>Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile separation buffer (SB)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry and Cell Staining Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340669</td>
			<td>Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP mouse anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347464</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349044</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-Human CD41a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340929</td>
			<td>Final antibody concentration 1:5 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse anti-Human CD42b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551061</td>
			<td>This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1227A647T</td>
			<td>Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA928A647</td>
			<td>Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6994</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 mouse anti-humna CD41a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>58425</td>
			<td>1: 20 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>580373</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAC1-FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340507</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti CD62p mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6632</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11020</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ig Isotype Control cocktail-C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558659</td>
			<td>Isotype control antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td>Counting beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Smaller and larger columns are also commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>In Vitro technologies</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRB inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Vert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyser</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Cytospin 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyser software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Diva Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell analysis software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 2 blue edition</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells

혈소판 생산 thrombopoiesis로 알려진 프로세스에서 골 수에서 주로 발생 합니다. Thrombopoiesis, 동안 조 혈 조상 세포 형태 혈소판 선구자 라는 없으며, 말기 출시 되 나 proplatelets 긴 세포질 프로세스에서 혈소판 분화를 구분 합니다. 없으며 희귀 세포 골 수에 국한 되며 따라서 실험실 사용을 위해 충분 한 숫자에 수확 하기가. 인간의 없으며의 효율적인 생산 수 달성 생체 외에서 CD34 경작+ 적당 한 조건 하에서 세포. 여기서 설명 하는 프로토콜 CD34의 격리에 설명 합니다+ 탯 줄 혈액 샘플에서 정렬 하는 자기 셀에 의해 세포. 매우 순수 하 고, 성숙한 없으며 혈 청 무료 조건 하에서 생산 하는 필요한 단계를 설명 합니다. Megakaryocyte 차별화의 phenotypic 분석 및 proplatelet 형성 및 혈소판 생산의 결정도 제공 됩니다. 이펙터 megakaryocyte 차별화 및 항 혈소판 항 체 등 thrombopoietin mimetics proplatelet 형성에 영향을 주는 생물 학적 기능 검사 경작된 한 세포에 추가할 수 있습니다.

이 프로토콜 수 있습니다 매우 순수 MK 문화 코드에서의 준비 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34의 비율+ 세포 탯 줄 혈액은 약 1.315 (그림 1A)와 단 세포 (단계 1.8) 범위 90-300 x 10의 총 수 UCB 단위 당6 . CD34의 순도 + CD45 + 세포 격리 범위 90에서 99% (그림 1B) 후. MK (CD41 정의+ 세포) 혈 청 무료 CD34 초기에 관찰 된다+ 세포 rhTPO의 문화. 7 일에의 비율 MK 성숙 (CD41+ 및 CD42a+ 세포)은 일반적으로 30-40% (그림 1C). CD41 최고 수준의+ 및 CD42a+ 두 배 긍정적인 세포 (90 ~ 99%) 10와 차별화 (그림 1C)의 12 일 사이 관찰 됩니다. 관찰 하는 변화에 따라 달라 집니다 주로 코드 혈액 소스는 CD34의 순도+/CD45+ 세포 단계 1.17에서에서 격리. 입력된 CD34 당 5-10에서 10 일 범위에 성숙한 MK의 수확량은+ 셀. 성숙한 MK (CD41+/CD42b+) 형광에서 관찰 현미경 그림 2A에 표시 됩니다. 교양된 MK 큰, 보통 multinucleated 셀 (그림 2A, 화살촉)로 나타납니다. MK의 세분화 된 콘텐츠는 vWf (녹색) 및 CD62p (p selectin, 빨간색) 얼룩 (그림 2B)에 의해 결정 되었다. 교양된 MKs에서 관찰 ploidy 분포는 그림 2C에 표시 됩니다.
Proplatelets는 길고, 파란색 섬유 또는 필 라 멘 트 MK 시체에서 확장 하는. Proplatelets 몇 백 마이크로미터 긴16 고 지점과 팽창된 지역 포함. Proplatelet 베어링 MK 특성은 2D 그림에에서 나와 있습니다. Proplatelet 베어링 MK (pbMK)의 비율 1.3 ± 0.17% 이었다.
혈소판 분석 하 고 프로토콜에 설명 된 대로 계산 될 수 있습니다. 그림 3B에서 같이, 대부분 혈소판 표면에 뜨는 세포 배양에서의 주변 혈액 혈소판 혈소판 마커 CD41에 대 한 긍정적인 (그림 3B) 분석 게이트 내에서을. 19에서 문화에서 생산 mk. 혈소판 당 42 혈소판이 메서드 범위에서 혈소판 항복 ADP 활성화 관련 PAC1 단일 클론 항 체 (그림 3C)의 증가 된 바인딩에 의해 결정 등 혈소판 촉진제에 의해 활성화 될 수 있다 .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56420/56420fig1.jpg"> 
그림 1: Flow cytometry 플롯 CD34의+ 세포 격리 및 문화에서 MK 차별화. (A) 단 세포 (왼쪽된 패널에 표시 된 문이) 인간 탯 줄 혈액 (단계 1.8)에서 정화는 CD34의 비율을 결정 하기 위해 안티-CD34-PE 항 체로 얼룩진 했다+ 세포 샘플 (1.3%, 오른쪽 패널). (B) 분리 후 긍정적인 분수 (1.17 단계) 안티-CD34-PE 및 안티 CD45 PerCP 항 체와 스테인드 했다. 풍부한 CD34+ 인구 (98.1%, 오른쪽 패널, 상단 오른쪽 사분면) 그림에 표시 됩니다. MK의 (C) Phenotypic 분석에서 차별화 생체 외에서 CD34 + 세포에서 7 일 또는 11 일 안티-CD41 및 안티-CD42a 항 체와 얼룩 했다. 성숙한 MK는 두 CD41에 대 한 긍정적인+ 및 CD42a+ (상단 오른쪽 사분면). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56420/56420fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56420/56420fig2.jpg"> 
그림 2: MK 얼룩, ploidy 및 생체 외에서proplatelet 형성. (A) 안티-CD41-PE와 CD42b APC 항 체로 얼룩진 하루 11 MK의 형광 이미지. 핵은 DAPI와 얼룩이 있었다. 노란색 화살표는 안티 CD62p (빨간색)와 안티-CD42b-APC (마젠타) 항 체 다 핵 MKs. 눈금 막대, 30 µ m. (B) 형광 이미지 vWf (녹색), 안티로 얼룩진 하루 14 MK의를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 얼룩이 있었다. 눈금 막대, 15 µ m (C) 대표 제어 전략 CD41 ploidy 분포를 보여 주는+ 이벤트. 그래프 (하단 패널) ploidy 클래스의 관찰 된 분포를 보여 (n = 4), 오차 막대, sd. (D) proplatelet 베어링 MK의 특성 형태 표시 됩니다. MK 몸 화살표로 표시 됩니다. MK (proplatelets)에서 연장 긴 세포질 프로세스는 화살촉으로 표시 됩니다. 하나 또는 두 개의 MK는 이러한 proplatelet 확장을 생산 하 고 있는지 여부를 보기의 일부 지역/분야에 명확 하지 수 있습니다. 이 거꾸로 한 현미경, 10 X 목표와 함께 찍은 한 proplatelet 베어링 mk. 이미지 계산 한다. 스케일 바, 50 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56420/56420fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56420/56420fig3.jpg"> 
그림 3: 혈소판의 생산 생체 외에서 혈소판 활성화. 혈소판이 풍부한 혈장에서 (A) 인간의 혈소판 분석 게이트 앞으로 옆 분산형 (왼쪽된 패널)에 대 한 로그 스케일을 사용 하 여 설정 하는 데 사용 했다. 오른쪽 패널 MK 문화에서 셀을 표시합니다. 혈소판 생산 생체 외에서 인간 혈소판에 대 한 정의 분석 게이트에서 관찰 된다. 셀과 세 구슬 그림에 표시 됩니다. Plt, 혈소판 (B) 혈소판 생산 체 외에 안티-CD41 항 체 물 했다 혈소판이 풍부한 혈장에서 인간 혈소판 분석 게이트 측 분산형 및 앞으로 대 한 로그 스케일을 사용 하 여 설정 하 고 CD41 FITC 게이트 내 프로필을 비교 사용 되었다. C-FITC FITC isotype 제어 (C) 혈소판 활성화 혈소판이 풍부한 혈장에서 20 µ M. 인간 혈소판의 최종 농도에 ADP에 의해 치료를 다음과 같은 제어 (위 패널)로 사용 되었다. 문화에서 생산 하는 혈소판은 낮은 패널에 표시 됩니다. 항 체는 혈소판 활성화를 나타냅니다 PAC1의 바인딩. C FITC, FITC isotype 컨트롤 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56420/56420fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34 방법+ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

19.5K 조회수.  University of New South Wales. 매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34 방법+ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.

비디오: Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

연구

면역학 및 감염병학

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34⁺ 세포

요약

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