우리는 그녀의 기술 지원 및이 원고 준비에 대 한 페넬로페 가르시아를 감사합니다. 이 작품은 Loma Linda 대학 (681205-2967)에서 약 학과에서 연구 혁신 그랜트 (RIG)와 XT에 국가 다 발성 경화 증 사회 (PP1685)에서 파일럿 그랜트에 의해 지원 되었다.

모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 프로토콜 동물 관리 및 사용 텍사스 대학교 엘 파소 그리고 Loma Linda 대학에 위원회에 의해 승인에 따라 수행 되었다.
1. 단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 생성
<ol>
	<li>설계는 OLP 라이브러리는 모든 펩 티 드, 길이 15-메 르 이며 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복. 참고: MOG OLP 연구에 MOG 전조 [생쥐]의 시퀀스 검색 NCBI 단백질 데이터베이스에서이 링크를 수행 하 여: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. 집 고 양이 전조 (247 아미노산), 신호 및 성숙한 펩 티 드를 포함, 보고 된 Qa-1 (HLA-E) epitopes의 대부분은 신호 펩 티 드 (예: Qdm1)에 위치 해 있기 때문에 사용 되었다. 그것의 N-말단에서 시작, 15-메 르 펩 티 드의 시퀀스를 두 개의 인접 한 펩 티 드 11 아미노산 (그림 1)에 의해 중첩 확인 되었다. 따라서, 정확 하 게 59 OLPs 247 아미노산 MOG 전조에서 확인 되었다. 그러나, 마지막 OLP 단백질의 길이 따라 15-메 르 12에서 배열할 수 있다. 우리와 다른 것으로 나타났습니다 15-메 르 펩 티 드, 또는 대 식 세포, 모 수석 세포 (DCs)에 추가 될 때 효율적으로 될 수 있기 때문에 15-메 르 라이브러리 선택 하는 또한,+ T14,15 세포 CD8 epitopes 인식으로 처리 .</li>
	<li>상업적으로 각 개별 펩 티 드를 구입. 펩 티 드 당 5 mg 심사에 대 한 충분 해야 합니다. 잘린된 펩 티 드 (단계 6.1) OLPs desalted 펩 티 드 (순도 약 50-70%)를 하실 수 있습니다. 최적의 펩 티 드 (단계 6.2) tetramer의 세대와 미래 생물학 분석 사용 될의 순도 이어야 한다 &#62; 90%. 무 균 조건 하에서 펩 티 드 reconstitute</li>
	<li>100 %DMSO 50 mg/mL 개별 펩 티 드 주식을 확인 합니다. 각 펩 티 드의 5 mg 추가 각 튜브에 DMSO의 100 μ 혼합, 그리고-20 ° c.에 펩 티 드 저장 이러한 주식 CD8의 세대에 대 한 OLP_pool 재고를 확인 하는 데 사용 됩니다+ T 셀 라인 반응 하는 OLP_pool. 또한, 이러한 주식은 또한 만들기 위하여 이용 될 10 mg/mL OLP_pool 반응 CD8에서 Qa 1 제한 반응을 자극 하는 각 개별 펩 티 드의 능력을 결정 하기 위한 개별 펩 티 드 주식+ T 세포 라인.</li>
	<li>신선한 관으로 각 펩 티 드의 동일한 볼륨을 추가 하 여 확인 OLP_pool 주식. 이 OLP_pool 주식 100 %DMSO 포함합니다. 집 고 양이 OLP 연구에서 59 OLPs12했다. 따라서, 농도 OLP_pool에서 각 펩 티 드의 847.46 μ g/mL (50 mg/mL ÷ 59) 이었다.</li>
	<li>희석 (5 x) 10 mg/mL 개별 펩 티 드 주식 하 게 살 균 H2O (이 주식 포함 20 %DMSO) V 하단 96 잘 접시에서 50 mg/mL 주식. 각 개별 펩 티 드의 Qa 1 제한 응답의 결정 96 잘 접시 8 또는 12 채널 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다 때문에이 주식 96 잘 접시에 확인 합니다. 참고: 모든 펩 티 드, OLPs 및 잘린된 펩 티 드를 포함 하 여 V-하단 96 잘 접시에 희석 해야 합니다 또는 96-잘 샘플 랙 가득 1 mL 튜브 때문에 펩 티 드 라이브러리 심사 96 잘 접시 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다. 경우에 희석 한 펩 티 드, 펩 티 드를 분해 수 있도록 현명한 1 N NaOH 방울을 추가 하는 것이 어렵습니다.</li>
</ol>
2. 못쓰게 K의b-/- Db-/- CD8+ OLP_pool 펄스 k T 세포b-/- Db-/- 모 수석 세포 (DCs).
참고: 두 개의 주요 Qa 1 대립 유전자에 있다: 하나는 Qa-1는, 그리고 다른 Qa-1b. 학술 연구에 대 한 일반적으로 사용 되는 동물, 이후 예 C57BL/6, Balb/c 마우스, Qa-1b,이 프로토콜 매핑 Qa-1b epitopes는 단백질에 대 한 절차를 설명 합니다. CD8+ T이이 프로토콜에 사용 되는 세포에서에서 순화 된다b-/-Db-/- 는 CD8에 마우스 (C57BL/6 배경)+ T 세포 Qa-1 등 아닌 클래식 Ib MHC 분자에 의해 주로 제한 됩니다.
<ol>
	<li>앞에서 설명한12골 파생 된 Dc를 생성 합니다.
	<ol>
		<li>간단히, RPMI-10 매체 (RPMI 1640 10% 태아 둔감 한 혈 청, 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 골 수 단일 셀 정지 (1 x 106 셀/mL)를 문화 10 U/mL IL-4를 포함 하는 6-잘 접시 (4 mL/잘) 37 ° C, 5% CO2에서 100 U/mL GM-CSF.</li>
		<li>2 일 후, 신중 하 게 비 부착 한 세포를 제거 하 고 신선한 미디어와 cytokines를 추가 합니다.</li>
		<li>또 다른 2 일 동안 세포를 배양 한 후 신선한 미디어와 cytokines 새로운 6 잘 플레이트에 포함 된 비 부착 한 세포를 전송 합니다.</li>
		<li>또 다른 2 일 셀 문화 및 신선한 미디어와 LPS를 포함 하는 cytokines 보충 (0.1 µ g/mL)는 Dc를 활성화.</li>
		<li>24 시간 후, 실험에 대 한 Dc를 수집 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3000 래 드와 Dc 비추는
	<ol>
		<li>또는, 미토마이신 C와 Dc (5 x 107 셀/mL)을 치료 (50 μ g/mL) 20 분에 대 한 37 ° C에서 PBS에 추가할 RPMI-0 (혈 청 없이 RPMI 1640) (~ 12 mL) 튜브를 g. 삭제 supernatants repea x 300에 탁상 원심 분리기에서 10 분에 대 한 셀을 회전 t 세척 절차 두 번 더입니다. 이러한 세 가지 세척은 중요 한 어떤 추적 미토마이신 C 양의 CD8의 응답을 억제 수 있습니다 때문에+ T DC-T 세포 공동 배양 중 세포.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5 x 106 셀/ml 혈 청 무료 매체 (목표-V 세럼 무료 매체 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 DC 농도 조정 합니다.</li>
	<li>최종 DMSO 농도 0.5% (200 x) 일 것 이다 그런 Dc에 100 %DMSO 포함 하는 OLP_pool 재고 솔루션을 추가 합니다. 집 고 양이 OLP 연구에는 OLP_pool에서 각 OLP의 농도 847.46 μ g/mL; 따라서 DC 문화에 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL (847.46 μ g/mL ÷ 200) 이었다.</li></ol>그러나,이 농도 세포 배양에서 DMSO 농도 남아 1% 미만으로 100 μ g/mL까지 확장할 수 있습니다.
	<li>3 시간 실 온에서 Dc를 품 어 고 흔들어 셀 부드럽게 매 15 분.</li>
	<li>이 잠복기 동안 CD8 정화+ T 세포 수확된 비장 또는 K의 림프절에서b-/-Db-/- 상업 CD8를 사용 하 여 마우스+ T 세포 정화 키트, 10 x 106 셀/ml에 셀 농도 조정 50 U/mL 인터 루 킨 2 (일리노이-2)와 일리노이-7의 100 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체.</li>
	<li>자, 추가 CD8 0.5 mL/잘으로 48-잘 접시로+ T 세포 (0.5 mL/OLP_pool 펄스 Dc 단계 2.8는 CD8의 최종 농도에서 추가 후에+ T 세포는 5 x 106 셀/mL을 될 것입니다). 참고: CD8+ T 마우스 비장 및 림프절에서 셀 제조업체에서 제공한 지시를 따라 CD8 긍정적인 격리 키트를 사용 하 여 순화 될 수 있다. CD8+ T 세포 얻은 구슬의 자유롭다.</li>
	<li>2 x 106 셀/ml 혈 청 무료 매체에서 OLP_pool 펄스 Dc OLP_pool 펄스 Dc (300 x g, 10 분) 실시간 Reconstitute에 아래로 회전 하 고는 CD8 포함 48-잘 접시에 0.5 mL/잘 추가+ T 세포 (최종 농도 OLP의 _pool 펄스 Dc 1 x 106 셀/mL, CD8의 최종 농도+ T 세포는 5 x 106 셀/mL, 일리노이-2의 최종 농도 25 U/mL 이며 일리노이-7의 최종 농도 50 U/mL). 37 ° C, 5% CO2셀 문화.</li>
	<li>4 일에 제거 하 고 문화 매체의 약 400 μ를 삭제 한 추가 100 U/mL 일리노이-2와 각 잘 일리노이-7의 100U/mL를 포함 하는 신선한 혈 청 자유로운 매체의 500 μ. 37 ° C, 5% CO2에서 셀을 품 어.</li>
	<li>당일 7 또는 8, 다시 OLP_pool 액 CD8 자극은 OLP_pool와+ T 세포.</li>

3. 끝났다 CD8 restimulation+ T 세포와 대 식 세포는 OLP_pool와 펄스
<ol>
	<li>OLP_pool 액 CD8의 다시 자극 하기 전에 4 일+ T 세포, 2% (v/v) polyacrylamide 비드 솔루션 준비: 20 mL에 두 번 polyacrylamide 구슬의 2 세대를 세척 하 여도 무료 H2O 또는 PBS. 5 분 동안 원심 분리 (400 x g)에 의해 작은 공의 polyacrylamide 구슬 고 100 mL PBS의에서 resuspend. 압력솥에서 15 파운드/m 실 온에서 20 분이 게에 대 한.</li>
	<li>Intraperitoneally 살 균 2 %polyacrylamide 비드 솔루션의 복 막 구멍16에 monocytes/대 식 세포의 마이그레이션 유치 1 mL/마우스와 함께 쥐를 주사.</li>
	<li>4 일 후, CO2 과다 하 여 동물을 희생.
	<ol>
		<li>무 균 조건 하에서 잘라는 작은 여 복 부의 중심에는 오프닝은 충분히 5 mL 전송 피 펫을 전달. 전송 피 펫 RPMI-0와 개방을 통해 복 부 캐비티에 피펫으로 삽입.</li>
		<li>Pipetting으로 복 부 구멍을 씻어. (이들은 복 막 대 식 세포) 무 균 튜브에 복 부 구멍에서 가능한 많은 액체 밖으로 플라스틱. 린스 단계 4-5 회 반복 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3000 래 드와 복 막 대 식 세포 비추는
	<ol>
		<li>또는, 미토마이신 C와 복 막 세포 (2.2 단계에에서 설명 된 절차를 따르십시오.) 취급 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5 x 106 셀/ml 혈 청 자유로운 매체에 복 막 대 식 세포의 농도 조정 합니다. OLP_pool 재고 (최종 DMSO 농도 1% 미만)와 M-CSF를 추가 (최종 농도 = 100 U/mL). 참고:이 집 고 양이 OLP 연구에서 0.5 %DMSO 사용 우리. 따라서, 집 고 양이 OLP_pool 주식 MOG OLP_Pool 재고 복 막 대 식 세포의 199 μ에 추가 되었습니다 (예: 1 μ) x 희석된 200 했다. 따라서, 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL) 했다.</li>
	<li>48-잘 조직 문화 접시에서 200 μ/잘 (1 x 106 셀/잘)을 추가 하 고 37 ° C 4 h에서 접시를 품 어.</li>
	<li>비 부착 한 세포는과 polyacrylamide 구슬 200 μ/잘 미리 따뜻하게 RPMI-0의 부드러운 세척 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>수집 및 수영장은 OLP_pool 액 CD8 단계 2.10에서+ T 세포. 조정 하는 OLP_pool 액 CD8+ 1 x 106 셀/ml 25 U/mL 일리노이-2와 일리노이-7의 50 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체에 T 세포 농도. OLP_pool 펄스 복 막 대 식 세포를 포함 하는 48-잘 접시를 1 mL/음을 추가 합니다.</li>
	<li>4 일 후, 48-잘 접시에 매체를 보충. 제거 하 고 약 400 μ 48-잘 배양 배지에서 배양의 삭제. 각 우물에 신선한 혈 청 무료 중간 포함 100 U/mL의 일리노이-2 500 μ와 일리노이-7의 100 U/mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2셀 문화.</li>
	<li>3 ~ 4 일 후, 검사 OLP_pool restimulated CD8 효소 연결 된 immunospot 분석 결과 (ELISPOT)에 의해 OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답+ T 세포. 이 시점 후 다시 자극 하는 CD8+ T 세포 모든 7-10 일. 참고: 대 식 세포는 OLP_pool 액 CD8의 다시 자극에 대 한 선호+ T 세포. 우리가 나타났습니다 CD8+ T 세포 대 식 세포에 의해 다시 자극된 Dc 시험관보다 더 성장 했다.</li>
</ol>
4. OLP_pool-특정의 결정, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8 T 세포 라인+
참고: OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8에서+ T 셀 라인 IFNγ 분 비 자극 C1R 또는 C1R 있을 때 OLP_pool에 의해 다음에 의해 결정 됩니다. Qa-1b 세포 IFNγ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. C1R 셀 상업적으로 얻어질 수 있다. C1R입니다. Qa-1 lentiviral 벡터와 C1R 셀 시험으로 Qa-1b 세포를 생성할 수 있습니다.
<ol>
	<li>추가 캡처 안티-IFN-γ 항 체의 100 μ/잘 ELISPOT 격판덮개의 우물에 코팅 버퍼 (PBS)에 희석 합니다.</li></ol>봉인 하 고 하룻밤 4 ° C에서 접시를 품 어.
	<li>두 번째 날, 캡처 안티-IFN-γ 항 체를 포함 하는 코팅 버퍼를 삭제 하 고 솔루션을 추가 200 μ/잘 blocking (혈 청 무료 매체) 실 온에서 2 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>C1R와 C1R 비추는. 9600 래 드와 Qa-1b 세포.
	<ol>
		<li>또는, C1R와 C1R 취급 합니다. 미토마이신 C 제외 하 고 치료 시간이 30 분 일 것 이다 단계 2.2에 설명 된 대로와 Qa-1b 세포.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C1R와 C1R 조정 합니다. 4 x 106 셀/mL 혈 청 자유로운 매체에서 Qa-1b 세포.</li>
	<li>접시에 차단 솔루션을 삭제 하 고 C1R와 C1R 추가. Qa-1b 세포 50 μ/잘 (200, 000 셀/잘)와 혼합.</li>
	<li>100 x 50 μ/잘 희석 OLP_pool 주식 (혈 청 무료 매체)에 추가 하 고 제대로 혼합. 2-3 시간 실 온에서 접시를 품 어.</li>
	<li>OLP_pool restimulated CD8 조정+ T 1-일리노이-7의 150 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체에 106 셀/mL x 2 세포와 50 μ/잘 (50000-100000 셀/잘) 접시에 추가. 5 분 동안 접시 (58 x g) 원심</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 접시를 밤새 품 어.</li>
	<li>세포 현 탁 액 발음 2 번 이온된 (DI) 수 (250 μ/잘)와 웰 스 워시. 웰 스 각 세척 단계에 5 분 동안 담가 수 있습니다.</li>
	<li>세척 우물 3 번 씻어 버퍼 나 (PBS 0.05 %Tween20 포함). 웰 스 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 있습니다. 워시 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>탐지 항 체 희석 버퍼 (PBS 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함)에 희석의 100 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>2 시간에 대 한 실 온에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>삭제 탐지 항 체 솔루션. 워시 3 번으로 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 250 µ L/잘 씻어 버퍼 I. 허용 우물 우물.</li>
	<li>1: 100 희석 시 희석 버퍼에 희석 효소 공액 (Streptavidin-HRP)의 100 μ/잘 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>효소 어원이 솔루션을 삭제 합니다. 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 250 µ L/잘 씻어 버퍼 나 수 스와 4 번 웰 스 워시.</li>
	<li>2 번 250 µ L/잘 씻어 버퍼 II (PBS)와 웰 스 워시.</li>
	<li>각 우물에 기판 솔루션 (혼합 1 방울 = 20 µ L의 AEC Chromogen AEC 기판의 1 mL와 함께) 100 µ L를 추가 합니다. 5 ~ 60 분 별색 개발을 모니터링 합니다.</li>
	<li>원하는 결과 표시 시작, 웰 스 증류수로 세척 하 여 기판 반응을 중지 합니다.</li>
	<li>2 h에 대 한 실 온에서 접시를 건조 나 완전히 건조 될 때까지 밤새. 접시 아래 플라스틱 트레이 제거 건조 촉진 한다. 분석 되 고 때까지 어둠 속에 봉인된 된 비닐 봉투에 접시를 저장 합니다.</li>
	<li>수동으로 해 현미경으로 검사 하거나 ELISPOT 플레이트 리더를 사용 하 여 명소를 열거 합니다. 그림 2에 대표적인 결과 참조 하십시오.</li>

5. 결정 개별 펩 티 드의는 OLP_pool에는 OLP_pool 전용 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는+ T 셀 라인
<ol>
	<li>결정 개별 펩 티 드 OLP_pool 전용, OLP_pool 전용 CD8에서 Qa-1-restrictred IFN-γ 분 비를 자극 하는+ 위의 사용 하 여 T 세포 선 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 (최종 농도 사용 각 개별 펩 티 드의 설명 ELISOPT에 대 한 분석 결과가 이다 10 μ g/mL). 그림 3에 대표적인 결과 참조 하십시오. 참고: OLP-특정, Qa-1-restircted 응답 C1R 존재 응답의 적어도 세 번은 응답으로 정의 됩니다. Qa-1b 세포는 OLP 없이. 집 고 양이 OLP 연구, OLP68, OLP96, 및 OLP105에서 모두이 기준을 만났다. 따라서, 모든 3 개의 OLPs는 잠재적으로 Qa 1 epitopes12 (그림 3)를 포함합니다. 그러나, OLP105는 일관 되 게 강한 응답; 준 따라서 우리는 OLP105의 상세한 분석을 수행 (그림 4 및 그림 5)12.</li>
</ol>
6. 신분증 OLP_pool 전용 CD8에 피토 프 전용, Qa 1 제한 응답을 자극 하는 15-메 르 OLP에 최적의 Qa 1 Epitope의+ T 셀 라인
<ol>
	<li>C-와 N-말기 잘린 그림 4와 같이 15-메 르 OLP의 펩 티 드를 음성 합성.</li>
	<li>OLP 특정 CD8에서 IFN-γ 분 비 검사+ 자극 하는 CD8 T 세포 라인+ T C1R 또는 C1R 있을 때 부모의 15-메 르 OLP 잘린된 펩 티 드의 각 세포. 위의 사용 하 여 Qa-1b 셀 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 설명 합니다. 각 개별 펩 티 드 ELISPOT 분석 결과 대 한 사용의 최종 농도 10 μ g/mL 이다. 펩 티 드 경우 최적의 Qa 1 epitope로 정의 된다 펩 티 드: 1) 일관 되 게 원래 15 메 펩타이드, C1R 존재에 비해 비슷하거나 더 강한 IFN-γ 응답을 제공. Qa-1b 세포; 2)는 8-10 메 르 (9-메 르 펩타이드 선호) 사이 MHC에 바인딩된 펩 티 드 길이-나 분자15,17. 대표 결과 그림5에서를 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol>
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A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+CD8++Treg+activity+enhances+the+immune+response+to+viral+infection.">Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Non-classical+Myelin+Epitopes+to+Treat+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Sci Rep. 6, 36064 (2016).</li><li>Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+host+factors+involved+in+the+major+histocompatibility+complex+class+Ib-restricted+presentation+of+Salmonella+Hsp+60:+novel+pathway.">Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway.</a> Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleocapsid+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+is+a+potent+human+CD8++T+cell+antigen+and+elicits+memory+responses.">The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses.</a> PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).</li><li>Schumacher, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+selection+by+MHC+class+I+molecules.">Peptide selection by MHC class I molecules.</a> Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Guo, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+length+peptides+bind+to+HLA-Aw68+similarly+at+their+ends+but+bulge+out+in+the+middle.">Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle.</a> Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).</li><li>Soloski, M. J., Metcalf, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+class+Ib+molecules+in+the+host+response+to+infection+with+Salmonella+and+its+relevance+to+autoimmunity.">The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity.</a> Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).</li><li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+endocytic+pathway+for+cross-priming+class+Ib+MHC-restricted+CD8alphaalpha+TCRalphabeta++T+cells+with+regulatory+properties.">Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties.</a> J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).</li><li>Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fine+specificity+of+the+immune+response+to+a+Plasmodium+falciparum+rhoptry+neck+protein,+PfAARP.">Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP.</a> Malar J. 15, 457 (2016).</li><li>Kambayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonclassical+MHC+class+I+molecule+Qa-1+forms+unstable+peptide+complexes.">The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes.</a> J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).</li></ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

여기, 우리는 Qa-1 단백질에 epitopes를 분석 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 이 프로토콜에 관하여 여러 가지 다른 전략 또한 이전 보고 했다. 첫째, 수용자 CD8+ T 세포와 클론 Qdm1의 식별을 위해 사용 되었다. 둘째, Qdm의 분석에서 상 상속 Qa 1 바인딩 모티브 HSP60p216-224와 TCRBV8.1 epitope9,18의 식별을 위해 사용 되었다. 단백질에서 셋째, 개별 겹치는 펩 티 드 면역 동물을 사용 했다. 그 후, CD8+ T 세포 면역된 동물에서 분리 된 TCRBV8.2 펩 티 드 p42-50 Qa-16,,1019바인딩 확인 이후에 식별 하기 위해 사용 되었다. 넷째, 기능 CD8+ T 세포 cDNA 디스플레이 라이브러리와 함께에서 라인 FL9 Qa-1 epitope4의 식별을 위해 사용 되었다.
이전 기술, 수용자 CD8의 사용에 관하여+ T 세포 선 및 5 월 클론 생리 적 면역 반응 동안 제시 Qa 1 epitopes를 분석 하는 데 적합 하지 않을. 또한, 축적 데이터는 앞에서 설명한 바인딩 모티브 Qa-1 분자의 펩 티 드-바인딩 용량을 표시 부분적 으로만 수 있습니다 것이 좋습니다. 따라서, 정확한 Qa 1 바인딩 모티브는 여전히 알 수 없습니다4. 또한, 예방 접종 Qa 1 epitopes의 식별에 대 한 개별 펩타이드와 힘 드는입니다. 마지막으로, cDNA 디스플레이 라이브러리 전략 수행 세포 transfection에 대 한 다른 펩 티 드 길이 많은 벡터의 건축을 포함 한다. 여기에 설명 된 OLP 라이브러리 전략 간단 하 고 매핑된 펩 티 드 Qa 1 제한 CD8 자극으로 알려져 있습니다 반대로,+ T 세포. 따라서, 우리의 전략 독특한 장점이 있습니다.
설명 하는 전략은 여기 OLP_pool 전용 CD8 사용 하 여+ T 세포는 체 외에서 못쓰게 하 고 restimulation에 의해 생성 됩니다. CD8의 대안 소스+ T 세포 림프 노드 k의 배수에서 수b-/-Db-/- 소스 단백질20접종은 마우스. 이러한 면역 CD8+ T 세포 다음 IFN-γ 응답 OLPs 및 Qa 1 epitopes의 식별을 위해 잘린된 펩 티 드에 대 한 시험 될 수 있다. 이론적으로는 비보에 면역 CD8+ T 세포는 가까이 생리 조건 보다는 생체 외에서 생성 된 CD8+ T 세포. 그러나, 우리는 면역 CD8 응답 발견+ T 세포 면역된 생쥐에서 직접 정화는 약하고 자주 필요한 생체 외에서 restimulations 심사 결과 만족 스러운 펩 티 드에 대 한. 또한,이 프로토콜은 HLA-E epitopes 점에서 vivo에서 예방 접종은 실용적의 인간 연구에 미래 번역을 위해 설계 되었습니다.
기술적으로,이 프로토콜의 중요 한 부분 이다 CD8 세대 라인+ T 세포는 OLP_pool 또는 개별 OLP에 대 한 특정. 때문에 Qa 1/펩 티 드 복합물은 후 항 원 제시 세포는 OLPs 또는 펩 티 드 펄스는 고아 한 MHC-나/펩 티 드 복합물21에 비해 불안정, 펄스 셀 광범위 하 게 세척 하지 해야 합니다. 우리는 펩 티 드 펄스 셀, 광범위 하 게, 세척 하는 경우 손실 또는 CD8 자극 하는 능력을 크게 줄일 발견+ T 세포. 따라서, 즉시 전에 그들은 CD8와 공동 경작 한 번 세포 항 원 펩 티 드 펄스 제시 세척이 좋습니다+ T 세포.
또한, Qa 1/펩 티 드 복합물의 불안정성이 좋습니다 펩 티 드 펄스에 대 한 혈 청 자유로운 매체의 사용과 CD8 자극+ T 세포. 또한, 정기적으로 CD8 동안 50 U/mL 일리노이-7의 추가+ T 세포 배양으로 동안 IFN-γ ELISPOT 분석 결과. 일리노이-7의 목적은 생존 CD8의 기능을 유지 하기 위해+ T 세포. 일리노이-7 자체적으로 CD8를 자극 하지 않습니다+ T 세포가 IFN-γ를 생산.
마찬가지로 모든 전략, Qa 1 epitopes이이 전략에 또한 필요 추가 조사 생물학 의미 합니다. 예를 들어 하나의 중요 한 질문은 매핑된 epitope를 생리학적으로 제공 될 수 있는 여부. 이 문제를 해결 하려면 DCs lentiviral 벡터를 표현 하는 epitope 소스 단백질 (예: MOG OLP에 MOG 연구)으로 불리고 있습니다. Epitope 특정 CD8의 응답 후,+ T 세포 transduced Dc로 검사 됩니다. 긍정적인 응답 제안 하는 epitope 수 순수 처리 하 고 Dc에 의해 제시 합니다. 또한, CD8에 의해 epitope 인식 결과로 기능 결과+ T 세포를 더 조사 해야 합니다. 이와 관련, Qdm과 FL9 Qa-1 epitopes의 분석은 Qa 1 분자는 면역 감시1,4에 대 한 중요 한 결론에 이르렀다. 또한, HSP60p216, TCRBV8.1 펩 티 드의 연구와 p42-50 그 Qa 1 제한 CD8 결론에 지도+ T 세포 병원 성 CD4 타겟팅을 통해 면역 반응 조절+ T 세포 6,7 ,,919. 또한, MOG196 의 연구는 처음으로 공개 하는 Qa 1 제한 CD8+ T 세포 직접 잠재적으로 병원 성 면역 세포12에 의해 손상에서 그것을 방지 하기 위해 조직을 대상으로 면역 반응 조절 수 . 마지막으로, 피토 프 전용, Qa 1 제한 CD8의 기능 분석+ T 셀 tetramer에 의해 지원 될 수 있습니다. 이러한 tetramer NIH tetramer 핵심 시설 (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) 또는 회사에서 생산 수 있습니다. tetramer의 생성을 요청 하나 Qa 1 tetramer의 세대에 대 한 그들의 승인을 위해 새로 매핑된 최적의 Qa 1 epitope Qa-1 단백질의 바인딩을 지원 기능 데이터를 보낼 수 있습니다.
끝으로, 이전 학문은 설명 했다 그 Qa 1 제한 CD8+ T 세포12현지 면역 반응 규칙에서 중요 한 역할. 이와 관련, 조직 손상 면역 반응을 직접 대상 조직에 의해 발생할 수 있습니다. 또한, 부수적인 손해는 침입 병원 체는 면역 반응에 의해 발생할 수 있습니다. 따라서,+ T이 두에서 세포 CD8 Qa 1 제한의 역할을 이해 다른 조직 손상의 임상 응용 프로그램에 대 한 중요 하다.이 위해 Qa-1 자기 조직 또는 침입 병원 체에서 epitopes의 철저 한 분석 필요 하다. 이 프로토콜은 이러한 분석에 대 한 적절 한 될 것입니다.

Qa-1 쥐에서 (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 그것의 인간 상 동 기관이 이다 HLA. 이전 증거 Qa 1 분자는 중요 한 생물 학적 기능을 시연 하고있다. 첫째, Qa-1 분자 셀 구조 및 기능적 무결성에 대 한 조사에서 중요 한 역할을 한다. 이와 관련, Qa-1 분자는 세포의 정상적인 기능을 모니터링 하는 몇 가지 전략을 진화 했다. 이러한 전략 중 하나는 Qa-1 분자를와 처리 지도자 펩 티 드 (epitope), 즉 Qa-1 결정 한정자 (Qdm) 바인딩과 그물1에 고아 한 MHC i a 분자에서 처리 되는 양식 단지를 수 있습니다. Qa-1/Qdm 단지 나중 세포의 표면에 표시 하 고 바인딩합니다 NK 세포에 금지 NKG2A 수용 체를 억제 하는 활동2를 죽이 NK. Ia MHC 분자의 표현을 손실 됩니다, 셀 (예: 악성 셀)2를 죽이 NK에 민감한 됩니다. 다른 전략 Qa 1 분자를 탭 (항 원 처리와 관련 된 전송)의 결핍은 세포의 표면에 새로운 Qa-1/epitope 복합물을 형성 수 있습니다3 또는 ERAAP (바인딩과 그물 aminopeptidase와 관련 된 항 원 처리)4 (둘 다 결핍이 자주 악성 세포에 발생). 표현 하는 이러한 새로운 Qa-1/epitope 단지 셀 수 다음 인식 하 고 피토 프 전용 CD8 Qa 1 제한에 의해 제거+ T 세포. 둘째, Qa-1 분자 면역 규칙5유도. 이와 관련, Qa-1/epitope 단지 표시 되었습니다 CD8 자극+ 자체 조직6,,78 의 면역 중재 손상의 예방에 대 한 중요 한 규제 T (Treg) 셀 ,910. 셋째, Qa 1 제한 CD8+ Treg 세포 바이러스 감염11에 대 한 면역 반응 제한 표시 되었습니다.
따라서, 특정 확대 epitope 관련 Qa-1-restrictred CD8의+ T 세포는 비정상적인 세포의 제거, 면역 조절의 향상 및의 크기의 제어 잠재적으로 유망한 전략 바이러스-유도 된 면역 응답입니다. 동안 여부 결정 되지 않은 확대 epitope 관련 Qa 1 제한 CD8의+ T 셀 수 면역 감시를 강화 하 고 면역 반응을 유도 하는 바이러스를 제한, 우리의 실험실과 다른 사람 명확 하 게 증명 하는 Qa 1 epitopes와 예방접종 CD8 Qa 1 제한의 기능을 강화할 수 있습니다+ Treg 세포 병원 성 면역 CD4에 대 한 특정+ T 세포, CD4의 효율적인 제어를 선도+ T 세포 중재 면역 질환에는 실험적인 알레르기 성 뇌 (인간 다 발성 경화 증 동물 모델)6,10, 콜라겐 유도 관절염 (인간 류 마티스 관절염 동물 모델)7, 등 다양 한 동물 모델 및 비만 아닌 당뇨병 (인간 타입-1 당뇨병의 동물성 모형)8. 또한, 우리는 면역 조직 관련 Qa 1 epitope와 CD8의 확대를 통해 그 조직에 염증 면역 중재의 특정 컨트롤에 리드 발견+ Treg 세포12. 전 임상 연구의 위의 성공을 나타내는 Qa 1 epitope 접종 및 잠재적으로 수돗물에 결핍과 관련 된 다른 질병의 치료에 대 한 조직의 특정 면역 중재 질병의 치료에 대 한 완전 한 평가 대 한 필요와 ERAAP입니다.
따라서, 안정적이 고 신속 하 게 Qa-1 단백질에 epitopes 분석할 수 있는 기술에 대 한 수요가 있다. 이와 관련, 제한 된 수의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes 설명 하고있다. 대부분 이러한 Qa 1 epitopes의 CD8의 연구 기간 동안 serendipitously 발견 했다+ T 세포 박테리아13, 셀 탭3결핍, 셀 ERAAP4, 결핍 및 EAE6, 발생 하는 셀에 대 한 응답 9. 따라서, 높은 처리량 기술 정의 된 단백질의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes의 식별을 위해 바람직합니다. 다음, 우리를 사용 하 여 Qa-1-resrticted CD8 단백질에서 기능 Qa 1 epitopes는 겹치는 펩 티 드 (OLP) 라이브러리 전략 설명+ T 세포 단백질의 OLP 풀 (OLP_pool)에 대 한 특정 라인.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>The protein to be analyzed</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence of the protein can be obtained from NCBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: D2650 SIGMA</td>
			<td>DMSO should be sterile and cell culture tested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kb-/-Db-/- mice</td>
			<td>The Lackson Laboratory</td>
			<td>Stock#: 019995</td>
			<td>We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM V Serum Free Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11333D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Gel P-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat#: 150-4171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trasfer pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>Mfg#: 137238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat#: 315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well tissue culture plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>Cat#: CC7682-7548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: Z372129 Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml deep 06-well PP plate, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>Item#: 1896-1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat#: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-7</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat#L: 217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capture anti-IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: 551881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: S2EM004M99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1R</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Cat#: ATCC CRL-1993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1R.Qa-1b</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qa-1 lentiviral vector</td>
			<td>GeneCopoeia</td>
			<td>Product#: Mm02955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection anti-IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: 551881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: BD557630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC substrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: 551951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot</td>
			<td></td>
			<td>Any immunoSpot analyer should work for this purpose.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overlapping peptide library to map qa-1 epitopes in a protein

Qa-1 (HLA-E 인간) (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 최근 데이터 품질-1 분자 구조 및 기능적 무결성에 대 한 셀과 유도 하는 면역 조절, 제한 하는 바이러스 감염에 면역 반응에 중요 한 역할 놀이 것이 좋습니다. 또한, Qa 1 제한 CD8의 기능 확대 epitope를 통해+ T 세포 면역 여러 자가 면역 질환 동물 모델, 예를 들면 실험적인 알레르기 성 뇌에에서 치료 효과 보이고 있다 콜라겐 유도 관절염, 그리고 비 뚱뚱한 당뇨병. 따라서, 효율적이 고 신속 하 게 단백질의 기능적인 Qa 1 epitopes 식별할 수 있는 방법에 대 한 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리가 Qa 1 제한 CD8 사용 프로토콜 설명+ T 셀 라인 Qa-1 단백질에 epitopes를 결정 하기 위한 중복 펩 티 드 (OLP) 라이브러리에 대 한 특정. 이 OLP 라이브러리 포함 15-메 르 겹치는 펩 티 드, 단백질의 전체 길이 커버 하 고 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복. 이 프로토콜을 사용 하 여, 최근 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)에서 9-메 르 Qa 1 epitope 파악. 이 새로 매핑된 MOG Qa-1 epitope epitope 관련, Qa 1 제한 CD8 유도 표시 했다+ T 세포는 향상 된 myelin 특정 면역 규칙. 따라서,이 프로토콜은 소설 대상의 미래 조사 및 Qa 1 제한 CD8의 기능을 위한 유용한+ T 세포.

단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 디자인
단백질의 N-말단에서 시작, 각 펩 티 드 15 아미노산 (15-메 르)입니다. 따라서, 첫 번째 펩 티 드 15 위치로 1 위치에 걸쳐. 두 번째 펩 티 드의 N-말단 겹치면 11 아미노산에 의해 첫 번째 펩 티 드의 C-터미널. 따라서, 두 번째 펩 티 드에 걸쳐 위치 19에 위치 5. (그림 1) 단백질의 C-말단의 끝에는 펩 티 드의 나머지 부분을 디자인 합니다. 우리는 우리와 다른 것으로 나타났습니다 15-메 르 펩 티 드, 또는 대 식 세포, 모 수석 세포 (DCs)에 추가 될 때 효율적으로 될 수 있기 때문에 15-메 르 라이브러리 선택+ T14,15세포 CD8 epitopes 인식으로 처리. 라이브러리에 있는 OLPs의 수는 단백질의 길이에 따라 달라 집니다. 또한, 마지막 OLP 단백질의 길이 따라 15-메 르 12에서 배열할 수 있다. 예를 들어 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) 247 아미노산의 길이 있다. 집 고 양이 OLP 라이브러리 포함 59 OLPs12. 이 원고에 제시 하는 대표적인 결과 MOG OLP 라이브러리의 분석에서.
OLP_pool 자극 CD8에서 OLP_pool 관련, Qa 1 제한 응답의+ T 셀 라인
우리는 CD8 생성+ k 액은 T 세포 라인b-/-Db-/- Dc MOG OLP_pool (MOG_pool)와 펄스와 펄스 MOG_pool k restimulatedb-/-Db-/- 에 설명 된 대로 복 막 대 식 세포는 위에서 언급 한 프로토콜 (프로토콜 1, 2, 및 3). 이 CD8에 잠재적인 MOG_pool 전용, Qa 1 제한 응답을 확인 하려면+ T 셀 라인, 우리 시험이 CD8의 응답+ C1R 또는 C1R 존재 MOG_pool에 T 세포 라인. Qa-1b 세포 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 (그림 2) (4 단계 프로토콜)를 사용 하 여. 우리의 데이터 MOG_pool 자극 CD8 보여주었다+ T 세포 선 분 비 C1R 존재 IFN-γ의 낮은 수준. Qa-1b 세포 (세포 또는 SFCs를 형성 하는 32 자리) 하지만 하지 C1R 셀 (SFCs 2),+ T 세포는 Qa 1 바인딩 epitopes C1R 셀 (C1R 셀은 인간의 B lymphoblastoid 세포)에서 파생 된 응답 CD8의 존재를 제안. SFCs는 MOG_pool C1R 셀 (78 SFCs), 포함 된 우물에 추가 될 때 증가 했다+ T 세포는 비-Qa-1 epitopes 응답 CD8의 존재를 제안. SFCs는 MOG_pool C1R 포함 된 우물에 추가 될 때에 극적으로 증가 했다. Qa-1b 세포 (320 SFCs), CD8의 존재를 제안+ T 세포는 Qa 1 바인딩 펩 티 드에 응답. 데이터는 또한 Qa 1 바인딩 epitope(s)는 MOG_pool에 포함 되어 있음을 보여 줍니다.
결정 개별 펩 티 드의는 OLP_pool에서 OLP_pool-반응성 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비에 공헌 하는+ T 셀 라인
MOG_pool-반응성 CD8에 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는 OLP_pool에서 펩 티 드를 확인 하려면+ T 셀 라인, 우리 MOG_pool 반응 CD8 자극 중 C1R 존재 개별 59 OLPs와+ T 세포 또는 C1R입니다. Qa-1b 세포 (그림 3) (프로토콜 단계 5). 우리의 데이터는 몇 SFCs C1R 전지와 OLPs를 포함 하는 우물에서 관찰 되었다 보여주었다. 대조적으로, SFCs C1R 포함 모든 우물에서 증가 했다. Qa-1b 세포와는 OLPs. 그림 2에서 우리가 배운 CD8 C1R 존재+ T 세포. Qa-1b 혼자는 또한 SFCs를 형성 했다. 따라서, 대부분 스에서 증가 SFCs는 Qa-1 분자에 의해 C1R 세포에서 세포내 단백질에서 파생 된 Qa 1 epitopes의 프레 젠 테이 션으로 인해 일반적인 자극 때문일 수 있었다. 그러나, 그림 3C (B8, D12, 그리고 E9), 3 일치 3 프레임된 우물에 OLPs 그림 3A (OLP68, OLP96, 및 OLP105)에 OLPs을 강조, OLP 관련, Qa 1 제한 IFN-γ 응답으로 정의 하기 위한 기준 충족 프로토콜 단계 5.112에서 설명합니다. 데이터 품질-1 epitope(s) 3 OLPs 포함 하는 것이 좋습니다. 이후는 OLP105는 일관 되 게 가장 높은 응답을 생산, 우리는 OLP10512의 상세한 분석을 수행.
15-메 르 OLP에 대 한 잘린된 펩타이드 라이브러리의 디자인
OLP_pool-반응성 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하 결정 되었습니다 15-메 르 OLP+ T 셀 라인, 잘린된 펩타이드 라이브러리를 사용 하 여 최적의 epitope에 대 한 분석 필요. 이러한 잘림된 펩타이드 라이브러리는 점차적으로 1 아미노산에는 N-와 C-테르미니 (그림 4)에 의해 15-메 르 OLP를 잘라내기에 의해 설계 되었습니다. 다른 비슷한 MHC 종류 I 분자, Qa-1 분자는 주로 8-10 메 르 펩 티 드를 바인딩할. 따라서, 짧은 잘린된 펩타이드는 길이 6-메 르 하는 것이 좋습니다.
OLP_pool-반응성 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는 15-메 르 OLP에 최적의 Qa 1 epitope의+ T 셀 라인
펩 티 드 위의 N-와 C-말기 잘리지는 CD8에서 IFN-γ 분 비를 자극의 강도 대 한 테스트는+ 는 OLP_pool 또는 위에서 설명한 IFN-γ ELISPOT를 사용 하 여 15-메 르 OLP에 대 한 특정 T 세포 라인. 집 고 양이12Qa 1 epitopes의 연구에서 우리는 CD8 생성+ MOG OLP105에 대 한 특정 T 셀 라인 (그림 5A). 추가 분석 하는 N-말기 잘린된 9 메 르 펩 티 드로 최적의 epitope에 대 한 두 가지 조건 프로토콜 단계 6.2 (그림 5B)에 설명 된 시연 했다. 따라서, 우리는 N-말기 9 메 잘린 결론 펩 티 드 최적의 Qa 1 epitope를 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig1.jpg"> 
그림 1: 단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 디자인. N-말단에서 시작, 펩 티 드 아미노산 (15-메 르) 길이 15의 확인 되었다.11 아미노산 이전 펩 티 드의 C terminus와 겹쳐지는 경우 첫 번째 펩 티 드를 제외한 각 펩 티 드의 N terminus.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig2.jpg"> 
그림 2: MOG_pool 자극 CD8+ T 세포 했다 부분적으로 MOG_pool 특정 및 Qa 1 제한12. 생체 외에서 CD8+ T 세포 MOG OLP_pool (MOG_pool)에 의해 자극된 응답 C1R 또는 C1R 있을 때 MOG_pool 조사 했다. Qa-1b 세포 항 원 제시 하는 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여 셀으로. 대표 ELISPOT 이미지 표시 됩니다. 숫자의 자리를 형성 세포 (SFCs) 각의 왼쪽된 상단 모서리에 표시 됩니다. CD8+ T 세포: 50, 000 셀/잘. C1R 또는 C1R입니다. Qa-1b 세포: 200, 000 셀/잘.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig3.jpg"> 
그림 3: Qa-1에 대 한 책임은 MOG_pool에서 OLPs의 분석 응답 제한. (A) 사이트 10 mg/mL를 포함 하는 V-하단 96 잘 접시의 개별 MOG OLPs. 우물에 숫자 표현 OLP Id. 강조 표시 된 3 웰 스 포함 프로토콜 단계 5.112의 설명 대로 OLP 관련, Qa 1 제한 IFN-γ 대응에 대 한 조건을 충족 하는 OLPs. (B) 대표 SFCs는 OLP에 포함 된 각 잘에서 (최종 농도 = 4.2 μ g/mL, OLP ID 일치 하는 "A"), MOG_pool-반응성 CD8+ T 세포 (50, 000 셀/잘), 그리고 C1R 셀 (200, 000 셀/잘). (C) 대표 SFCs는 OLP에 포함 된 각 잘에서 (최종 농도 = 4.2 μ g/mL, OLP ID 일치 하는 "A"), MOG_pool-반응성 CD8+ T 세포 (50, 000 셀/잘), 그리고 C1R. Qa-1b 세포 (200, 000 셀/잘). 3 프레임된 웰 스는 OLP 관련, Qa 1 제한 IFN-γ 응답12에 대 한 조건을 충족 하는 OLPs 포함 되어 있습니다. 그림 참조12에서 적응 되었습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56401/56401fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig4.jpg"> 
그림 4: 15-메 르 펩 티 드의 잘린된 펩 티 드의 디자인. 15-메 르 펩 티 드 6-메 르를 1 아미노산에 의해에서 그것의 N-와 C-테르미니 잘렸습니다 점차적으로. 15-메 르와 그 잘린된 펩 티 드 합성 후 했다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56401/56401fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56401/56401fig5.jpg"> 
그림 5:는 OLP105에서 최적의 Qa 1 epitope의 분석. (A) OLP105 자극 CD8+ T 셀 라인 OLP68, OLP96, 및 OLP105 C1R 또는 C1R 존재에 대 한 응답에 대 한 조사 되었다. Qa-1b 세포는 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. 대표 IFN-γ SFCs (왼쪽된 상단 모서리에 번호) 표시 됩니다. (B) OLP105 전용 CD8+ T 셀 라인, (A)와 같이 조사 되었다 응답 개별 N-와 C-말기 잘립니다 펩을 그림 4, C1R 존재. Qa-1b 세포 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. OLP105: 15-메 르 OLP입니다. N6-14: N 말기 OLP105 펩 티 드를 잘립니다. C 6-14: C 말기 OLP105 펩 티 드를 잘립니다. CD8+ T 세포: 50, 000 셀/잘. C1R입니다. Qa-1b 세포: 200, 000 셀/잘. 숫자 50000 CD8 당 SFCs+ 은 모서리를 왼쪽 상단에 T 세포. 빨간색 사각형 표시 6.2 프로토콜 단계에 설명 된 대로 OLP에 최적의 Qa 1 epitope를 정의 하기 위한 조건에 잘. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56401/56401fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.8K 조회수.  Loma Linda University. Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.

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Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em&gt; Burkholderia의</em&gt; 종

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

혈액 처리를위한 빠른 방법은 인간의 혈액에서 혈장 펩타이드 수준의 수율을 증가하는

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석<sup&gt; +</sup&gt; 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...