저자 엘리자베스 헬레나 Bruun, 사라 크리스틴 크리스텐슨, 기술 지원, 닐스 M. Kristiansen를 인정 하 고 Lundbeck 재단 번호 R155-2013-14113를 부여.

저자는 충돌의 관심을 보고.

정화와 pBEC의 확산
정화 절차 동안에 중요 한 단계는 meninges의 신속 하 고 효과적인 제거 및 정화 수율 및 순도 대 한 모델의 적절 한 설립에 대 한 중요 하다 흰색과 회색 물질의 분리를 포함 합니다. 모델에 대 한 제시 생체 외에서 BBB pBECs를 사용 하 여, 우리 향상 있고 고립 된 회색 물질, 크기-선택적 microvessels, 콜라와 소화의 격리에 대 한 필터링의 기계적 균질에 따라 정화 절차를 간소화 DNase 및 트립 신, microvessel 조각의 초기 문화. 일반적으로 정화 및 1 차 셀의 주요 과제 중 하나는 오염 세포의 제거 이다. 경험과 기본 뇌 내 피 세포의 정화는 meninges 및 백색 질 결과의 철저 한 제거 순도 모세의 수율 개선으로 내 피 세포 성장 및 BBB의 표현을 증가 표시 하고있다 특성입니다. 이러한 이유로, meninges 제시 프로토콜에서 (sulci 안에 포함)의 제거 및 arteriolar 동맥 부드러운 근육 세포의 뿐만 아니라 환자의 세포 (fibroblast와 같은 속성을가지고)의 제거를 보장 하기 위해 설계 되었다 주의 성장 더 빠르게 내 피 세포 문화에 보다. 마찬가지로, 백색 질 재료의 최소화 순수한 내 피 세포 배양, 더 적은 오염 세포 격리 된 모 세관 조각에서 성장 하는 결과. 그러나,이 단순화 및 격리에 대 한 적용 하는 빠른 방법은 격리 된 모세 혈관의 수익률을 회색 물질 격리의 최적화 각 뇌의 수익률을 크게 향상 시킬 수 있습니다. 밀도 그라데이션 대체 정화 프로토콜69에 포함 되어 있는 무료 내 피 세포를 분리 하 고 내 피 세포의 순도 향상 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 시간이 소요 마찬가지로 수익률을 낮출 수 있습니다. 이 정화 방법의 둘 다 광범위 하 게 사용 되었고, MC와 사이토 공동 문화 (일반적으로 500-1500 Ω c m2)7,16, 높은 TEER pBEC 모델 생성의 특성을 공유 하 고 21,22,,4957,70,71.
높은 paracellular 제한으로 monolayers를 설치 하기 위하여 경험 pericytes 내 피 문화16에서 제거 되어야 합니다 나타났습니다. 일반적으로 돼지의 뇌 pericytes pBEC 레이어 아래 성장 하 고 쥐 뇌 내 피 세포72,73의 문화에 대 한 관찰로 내 피 층에 구멍을 발생 하지 않습니다. 그러나 PBEC 문화 할,에서 Pericytes 그리고 불규칙 한 셀 경계선16나타나는 광범위 한 내 피 세포의 형태에 영향을 미칠 경향이 있다. 뇌 내 피 세포는 microvessels에서 다른 세포 유형 보다 높은 수준의 경과 전송기 (예: P-당단백질)의 표현, 때문에 puromycin 치료74에 의해 오염 셀의 수를 줄일 수 있습니다. 또한 사용 하 여 플라스마 파생 된 혈 청 (PDS)의 태아 또는 신생아 송아지 파생 된 혈 청 호의 내 피 세포의 성장 보다는 PDS는 혈소판 파생 된 성장 인자와 혈관 내 피 성장 성장 요인의 낮은 농도 요소 BBB 침투성을 증가 하 고 자극 하는 신생14,,7576,77에 표시 됩니다. 고립 된 모 세관 파편의 초기 문화를 소개 하 고 puromycin 치료 (4 µ g/mL)와 PDS의 사용이 결합, 우리 이후 우리가 할 수 있도록 정화, 후 남은 오염 셀의 수를 크게 감소에 성공 침투성 막 삽입에 꽉 내 피 monolayers를 설정 합니다. 문화 요리 및 투과성 막 삽입 표면에 내 피 세포의 최고의 부착을 지키기 위하여 관찰 되었다 (에서 인간 태 반) 콜라겐 유형 IV 및 fibronectin 코팅 혼합물 크게 확산 증가 수율, 그리고 결합 된 혼합물은 교원 질 유형 I78만 사용 하는 전통적인 방법에 따라서 선호 됩니다.
셀과 BBB 모델 체 외에서 높은 TEER의 설립의 차별화
MC에 pBECs 일반적으로 이다 공동 문화 기능 꽉 접합을 유도 하 고 높은 TEER 값16,57달성에 대 한 중요 하지 않습니다 있도록 격리, 다음과 같은 많은 BBB 주요 기능을 유지 합니다. BBB 표현 형으로 내 피 세포의 분화 조건을 최적화 하는 노력 등이 포함 하는 혈 청의 사용 매체 8-CPT-캠프, 날린7 (세포내 캠프 레벨13증가)와 보완 및 RO 20-1724 (세포내 캠프 수준 유지), 하 이전 결과74,79 함께 따라 성공적으로 장벽 압박감을 향상 TEER, 증가 하 고 또한 더 복원 하는 데 도움이 될 수 있습니다 vivo에서 유전자 발현 같은80프로 파일. 그러나, 내 피 층의 강화를 위한 날린을 사용 하 여 특정 자극 하 고 염증 하는 동안 응답을 항 암 치료 및 cytokines의 조사에 대 한 모델을 사용 하 여 목적 내 피 세포의 응답을 수정할 수 있습니다는 날린의 사용은 피해 야 할 수 있습니다.
엠씨와 함께 비교 연구, ACM와 사이토 엠씨 공동 모두 참여 실험실에와 다른 문화, astrocytic 기여는 내 피 BBB 기능을 개선 하 고 장벽 압박감을 증가 표시 되었습니다. 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. pBECs 표현 형 BBB의 이러한 높은 표현을 달성 하기 위해 우리는 이다와 NCC를 설립 하 고 발견 둘 다 돼지 쥐 기본 이다 유리, 또한으로 다른 실험실22에서 관찰 했다. 사이토 NCCs의 설립 동안 경험이 나타났습니다 순도 사이토 문화 시대의 영향 결과 내 피 장벽 압박감, with는 이다 2-8 주 되는 시간이 지남에 사이토 형태에서 관찰 된 변화를 상관의 최적의 나이. NCC를 수립 하기 전에 하루에는 이다에 대 한 중간 변화는 유해한 대사 산물을 제거 하 고 자극 및 배리어 개발에 영향을 미치는 신호 요소를 이다에 대 한 충분 한 시간을 허용 하는 위한 것입니다. 공동 투과성 막 삽입 시스템에는 내 피 세포와 이다 경작 때 그것은 장벽 모델의 처리에 특별 한 관심을 지불 하는 것이 중요. 중간 변경 동안 모두 포부와 매체의 추가 및 삽입의 움직임 수행 되어야 합니다 신중 하 게 내 피 방 벽의 중단을 최소화.
재현성 및 신뢰성
생체 외에서 모델을 수립에 대 한 1 차 셀을 사용 하는 경우 큰 도전 문화 사이 높은 재현성을 달성 하기 위해입니다. 이러한 표준화 방법, 높은 품질 도구 및 시 약, 기정에서 경험의 사용의 선택에 의해 충족 수 있습니다. 제시 방법에 대 한 낮은 일괄 배치 변이로 높은 재현성은 따라서 매우 엄격한 준수 설명된 절차에 의존 합니다.
감소 유연한 젓가락 전극 사용 될 수 있습니다 TEER 측정, 조직 저항 측정 챔버 또는 엄밀한 미니어처 전극 가진 상피 전압계 동안 일괄 처리 및 튜브 사이 좋은 재현성을 달성 하는 관찰 TEER 값의 다양성 높은 TEER 값 (그림 4)을 달성, 뿐만 아니라 해당 낮은 작은 용 질 침투성 (그림 4)와 pBECs (그림 5의 immunocytochemical 특성에 의해 제시 모델의 신뢰성은 확인 ).
적용된 방법 및 모델의 한계
유전자 변형 및 소형 돼지의 사용은 마지막 십 년간 동안 증가 하지만 시내 vivo 데이터의 양을 제한 설치류 모델에 사용할 수 있는 데이터에 비해 이며 따라서 체 외에 돼지 데이터 비교에 대 한 도전 포즈 수 있습니다. 와 결과 vivo에서 . 그러나, 돼지의 생물학 인간 생물학 많은 설립된 실험실 동물 보다 더 밀접 하 게 반영 하 고 유전자 변형 돼지 모델84의 가용성을 설립 알 츠 하이 머 병 되었습니다 지금 같은 신경 질환을 공부 vivo에서 데이터는 적은 시간 문제가 될 전망 이다.
BBB의 현재 투과성 막 삽입 시스템 모델의 한계는 microvessels에 혈액의 흐름을 모방 하는 무 능력 이다. Vivo에서, 전단 응력은 보였다 부문, 차별화, 마이그레이션 등 apoptosis85,86, 내 피 세포 생리학의 많은 측면에 영향을 하 고와 같은 중요 한 BBB 특성에 영향을 접합 단백질 및 유도 및 전송기61,,8587의 분극의 식입니다. 같은 조건 소개, 새로 개발된 된 미세 시스템88,,8990여겨질 수 있다.
예측된 '본질적인 침투성'는 비보에, 소프트웨어 기반의 접근21을 사용 하 여 파생 체 외에 침투성 데이터에서 unstirred 물 층 (수성 경계 층)의 효과 대 한 하는 유용한 방법이입니다. 이 소프트웨어는 또한 자세한 침투성 데이터 분석21에 대 한 사용할 수 있습니다.
미래의 응용 프로그램 및 방법에 대 한 방향
혈관 단위의 구성 요소 유도 및 BBB 기능 유지에 중요 한 역할을 보여왔다 고 아니 현재 생체 외에서 모델 아직 완전히 vivo에서 조건, 중요 한 성분 모방 할 수 있다 고 상호 작용은 아직 없을 수 있습니다. 제시 모델 개발에 노력을 현재 이다 pericytes, 및 다른 종의 세포 결합 실험 트리플 문화 모델을 설정 포함 됩니다. Pericytes의 지금까지 하지 않은 장벽의 TEER 수준을 크게 증가 관찰 되었습니다. 그러나, syngeneic 돼지 모델 관찰 되었습니다 트리플 문화 돼지 뇌 내 피 세포, 쥐 이다 쥐 pericytes 장벽 압박감 및 두뇌의 각 인 단백질 특성의 표현을 사용 하 여 비교 해야 피22. 모델을 개발 하기 위하여 기반 인간 세포, 생체 외에서 의 미래 개발에 BBB 모델 약물 발견 및 배달 인간 pluripotent 줄기 세포 및 성체 줄기의 유도에 의존 수 있습니다 또는 조상 세포21에 대 한.

세포의 구조와 기능 혈액-뇌 장벽에의
순환 및 중앙 신경 시스템 (CNS)의 인터페이스에서 BBB 역할 CNS microenvironment의 homoeostatic 컨트롤에 대 한 주요 규제 사이트는 적절 한 기능과 신경 시스템의 보호를 위해 필수적 이다. BBB 사이트는 혈관 루멘을 일렬로 세우는 내 피 세포. 뇌 모세 혈관, 내 피 세포는 복잡 한 세포 꽉 접합 형성 하 고 특정 유입 및 경과 전송기의 강하게 편광된 식 패턴은 혈액과 뇌 1사이 높은 특정 분자 전송 보장. 단단한 접속점 복합물의 구조 구성 요소는 occludin 및 claudin, zonula occludens (ZO) 단백질, cingulin에서 단백질을 포함 하 고 접합 접착 분자 (잼) 관련. Claudin 5 paracellular 접합 제한에서 특히 중요 하다. Pericytes, 이다, 신경 및 뇌 내 피 함께 세포 형태는 지하실 막를 포함 하 여 주변 셀와 동적 상호 작용을 포함 하는 유도 및이 특성 BBB 내 피 형의 유지 보수는 혈관 단위 (NVU)2,3. 이러한 상호 작용에 관여 하는 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 짧은 기간에 BBB 침투성의 변조를 허용 하 고 장기 BBB 기능4유도 세포 사이의 화학 신호 교환 포함. 이다 특히 뇌 내 피 세포 표현 형을 위해 알려져 있으며 glial 파생 된 neurotrophic 요인 (영향을 미치는 세포내 캠프)5,6기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 등 규제 요인의 원천 날린7, 그리고 변형 성장 인자 (TGF-β) β8. 그러나 TGF-β의 효과, 토론된9되었습니다.
생체 내에서 생체 외에서 BBB에서
Vivo에서 학문 계속 BBB 생물학에 유용한 정보를 제공 합니다. 그러나, 셀 문화 모델 추가적인 통찰력을 제공 하 고 건강 및 질병에 BBB의 상세한 분자와 기능적인 측면을 이해 하는 데 유용한 도구를 구성할 수 있습니다. 세포 유형 및 BBB의 성분 사이 복잡 한 상호 작용 생체 외에서 모델에 완벽 하 게 달성 하기 어려운 있지만, 거기는 이후, 뇌 내 피 세포의 첫 번째 정화 및 모노 문화에서 이러한 응용 프로그램 10 , 11 , 12, BBB의 성장 조건과 정화 절차의 광범위 한 개발 문화 모델, vivo에서 방 벽을 더 닮 았의 결과 세포. 일반적으로 사용 되 체 외에 BBB 모델은 기초를, 돼지, 설치류 및 소 출신의 1 차 셀에 불멸 하 게 세포에. 각 모델은 서로 다른 장점과 단점이 있다. 비교 및 모델 선택에 대 한 유효성 검사 마커 BBB 효소, 운송업 자, 수용 체, 그리고 구조 단백질의 표현 등은 현재 설립된 모델1의 개요를 만드는 데 사용 됩니다.
프로토콜의 목표
BBB의 중요 한 기능 중 하나는 배리어 견고 하 고 높은 TEER 아직 사용 가능한 모델의 많은 수를 반영 하지 않습니다 잘 비보에 수준. 이 프로토콜의 목표 BBB 모델 체 외에서 높은 TEER 기본과 기본 pBECs MC 또는 ACM, 없이 또는 NCC에 기반을 구축 하는 방법을 제시 하는 여러 실험실에서 개발 및 최적화 기여를 통합, 쥐 또는 돼지 근원의 이다입니다. 적용된 절차와 모델의 설립 포함 오염 세포를 제거 하 고 BBB 표현 형으로 pBECs의 차별화를 개선 하기 위해 노력 합니다. 이 작품은 낮은 paracellular 침투성 및 주요 꽉 접합, 전송기, 단백질과 수용 체의 기능 표현의 좋은 안정적이 고 높은 TEER 모델의 설립에 결과 있다. 그러나,는 이다 뇌 내 피 세포 표현 형을 기여 하는 요소는, 문화의 세 가지 다른 조건 뇌 내 피 세포의 3 개의 다른 고기를 나타냅니다. NCC 모델은 최대한 표현의 BBB 특징은 약물 발견, 전송 및 세포내 매매에 관련 된 특정 전문된 메커니즘의 연구 뿐만 아니라 세포 세포 상호 작용의 조사를 위해 특히 유용 유리.
기원과 프로토콜의 역사
여기에 설명 된 pBEC 모델은 기반 사이 실험실 (런던)에서 개발 된 돼지 모델 닥터 루이스 모건과 동료, whichis는 성공적인 이전 소 뇌 내 피 세포 모델13을 기반으로 합니다. 셀 준비의 원래 방법이 이었다 나일론을 사용 하 여 2 단계 여과 순도 개선 하기 위해 subculturing 단계 뒤 microvessels를 잡으려고 메시. 메서드의 이전 개발에 최적의 BBB 표현 형 및 압박감 ACM을 포함 하 여 보충된 매체에 성장에 의해 달성 했다. 메서드에 추가 수정 R. 스키 너에 의해 맨체스터 영국14,15명. 로스웰 교수 실험실에서 만들어졌다. 메서드는 Abbott 실험실, KCL 런던, Patabendige 크게 이다 또는 ACM의 사용을 피 함으로써 그리고 puromycin와 pericytes와 같은 오염 셀을 제거 하 여 준비를 간단 하 게 했다 그것은 의해 채택 되었다. 첫 번째 서류 MC 모델은 vivo에서 BBB, 효과적인 단단한 접속점, 수용 체-중재 transcytosis16,17 , 막 교통 시스템 등의 여러 가지 중요 한 기능을 유지 확인 , 18 , 19 , 20. 미 Yusof 나중 다시 사이토 공동 문화를 시험 하 고 그것은 크게 향상 된 TEER, 그래서 이것이 기본 variant 애 보트 연구소21에서 현재 사용 발견. 모델 지금은 성공적으로 되었습니다 M. 닐슨 전송 오르후스, 추가 수정 되었습니다 연구소 소개 (이 프로토콜), 단순화 그레이 포함 하 여 중요 한 메쉬 여과 단계와 단일 필터 코팅 단계를 사용 하 여 추출 콜라겐과 fibronectin 결합. 돼지 이다 (이 프로토콜)의 절연을 위한 적용된 절차는 센 외22에 의해 설명 된 알 보 그에서 토니 무스 연구소에 의해 개발 된 프로토콜에 근거 했다. 아후 스에서 생성 된 모델의 다른 속성과 TEER 비슷합니다는 자신감 개념 모델과 실험실 사이 전송 쉽게 잘 주의 관찰 및 합리화 방법 단계에 응답을 하 신 다. 실제로, S. Yusof 이제는 열 대 국가 (말레이시아)23, 현지 조건 및 조직 소스에 대 한 추가 조정 관련 MC 모델을 설립 했다.
이점을 다른 방법 및 현재 설립 모델
소와 설치류의 뇌 내 피 세포에 비해, pBECs는 vivo에서 BBB 형 절연24다음의 손실의 낮은 속도의 이점을 제공 합니다. 또한, pBECs bEND.5 및 bEND.3 (50 Ω c m2) 같은 셀 라인의 monolayers에 대 한 일반적으로 보고 된 수준에 비해 MC (800 Ω cm2)16 에서 재배 하는 경우에 상대적으로 꽉 내 피 방 벽을 형성 할 수 있다 25 , 26 , 27, ㄷ (300-800 Ω c m2)28,,2930및 cerebEND (500 Ω c m2)29,,3132, 그리고 기본 뇌 마우스 (100-300 Ω c m2)의 내 피 세포ss = "외부 참조" > 33,,3435,36 및 쥐 (100-300 Ω c m2)37,38. 그러나,는 TEER 정화 및 문화 절차에 의존성을 보이고 있다. 대부분의 경우, ACM의 추가 또는 이다 공동 문화 내 피 레이어1의 견고에 증가 내 피 세포에 차별화 효과 보여줍니다. 그럼에도 불구 하 고, 자란 조건 최적화에 노력, 소 기반 모델 나타났습니다 TEER 값 돼지 기반 모델 (평균 800 Ω cm2 MC, 사이토 공동 문화에 2500 Ω c m2 )에 비해13 ,39,40,41,,4243,44,45. 모델 기본 소 뇌를 기반으로 내 피 세포 사이 및 실험실14,45,,4647,48, 내 큰 변화가 나타났습니다. 재현성에 문제가 있을 수 있습니다. 여기 보고 pBEC 모델에서 기여 실험실 낮은 가변성, 실험실 사이 매우 비슷한 TEER 그리고 paracellular 침투성 값 달성 했다. 따라서, 그것은 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여 낮은 변화 강력한 모델 확립에 다른 실험실에 대 한 가능 해야 합니다. 단단한 내 피 층을 형성, 뿐만 아니라 pBECs 모델 이전 검증 된 꽉 접합, 기능적인 BBB 전송기, 수용 체와 효소, 단백질과 연구15 의 범위에 대 한 시연된 적합성의 식에 의해 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. 또한, pBECs의 공동 문화에 게시 되지 않은 transcriptome 데이터 BBB 전송기와 수용 체 (미 발표 결과, 닐슨 그 외 여러분)의 예상된 프로필을 보여줍니다.
BBB 돼지-기반 모델에는 게놈, 해부학, 생리학, 더 이점이 있다 그리고 돼지의 질병 진행 반영 인간의 생물학60을 유리한는 기능에 대 한 다른 기존된 모델 보다 더 높은 학위에는 제약 산업입니다. 돼지 머리 고기 업계의 일반적인 부산물 이기 때문에, 그들은 두뇌의 쉽게 접근할 수 있는 소스는 실험에 필요한 한 돼지의 뇌에서 높은 정화 수확량을 제공 하는 동물의 수를 최소화 하는 내 피 세포 구성. 정화 및 1 차 셀의 다소 시간이 소요 되 고 표준화 모델 설정에 대 한 전문 지식이 필요로, 1 차 셀 가장 신뢰할 수 있는 BBB 모델을 생성 합니다. 불멸 하 게 셀 라인 수 없습니다 대신, 중요 한 속성으로 같은 수 장벽 압박감, 전송 식 프로필, 및 microenvironment 규칙 vivo에서실험 결과61, 를 반영 하지 않습니다. 62. 생체 외에서 모델 라이브 셀 높은 해상도 이미징, 목표를 사용 하 여 샘플링 또는 관찰 된 셀에 대 한 근접 접근 함으로써 세포내 프로세스의 시각화를 가능 하 게의 이점을 제공 높은 확대와 더 나은 광학 품질63. 이건 살아있는 동물에서 2 광자 현미경의 사용에 대 한 경우입니다. 또한, 생체 외에서 모델 transfect 세포, 태그 단백질의 시각화와 그들의 매매의 조사 하는 기능을 제공 합니다.
모델의 응용 프로그램
BBB의 기능 고정 되지 않습니다 하 고 동적으로 생리학과 병 리에 변조 될 수 있습니다. 신경를 포함 하 여 많은 신경 질환, 염증 성 및 전염 성 질병, 장애 및 BBB의 증가 된 침투성은 관찰64,,6566,67 . 감소 하 고 질병의 진행 및 후속 피해 방지, 식별 및 BBB의 변조를 기본 분자 메커니즘의 중요 한 중요성의 있습니다. 이러한 맥락에서 신뢰할 수 있는 생체 외에서 모델 높은 수요 제약 산업에에서 있는 고 BBB 침투성 CNS 약물의 예측에 중요 한 역할 게다가. 어떤 체 외 모델 침투성 화면으로 제한적인 paracellular 통로, 순수 현실 셀 건축과 기능 표현의 전송 메커니즘68표시 되어야 합니다. 이전 연구16,17,의57, 그리고 paracellular 침투성 및 여기 TJ 고에 단백질의 표정에 의해 입증, 제시 모델 이러한 모든 조건을 충족 하며 적합 BBB의 범위 두 정상 생리에서 및 병리학에서 연구입니다. 제시 정화 및 재배 방법의 강점 단순의 조합을 포함 하 고 재현성 및 astrocytic를 포함 하는 기능 결과 강력 하 고 신뢰할 수 있는 높은 TEER 생체 외에서 BBB 모델 영향. 이 대 한 목적, 돼지의 이다 고 쥐 원점 비슷한 방식으로22에 pBECs의 BBB 표현 형을 증가 시키기 위해 표시 되었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Low Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma derived serum (PDS)</td>
			<td>First Link UK Ltd.</td>
			<td>60-00-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10-270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-CPT-cAMP</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO 20-1724</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,824,296</td>
			<td>Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made with Elga System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CLS3401</td>
			<td>12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 &#956;m polycarbonate membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>377224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910/159920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morten</td>
			<td>REF0211</td>
			<td>Type 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 &#956;m filters</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>NY4H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndOhm chamber system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-12</td>
			<td>EndOhm chamber for 12mm Culture Cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 electrode system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523+STX100C</td>
			<td>TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long needle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Attach to a syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip curved forceps</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>12-409-12-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad tip forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder</td>
			<td>MERCK Milipore</td>
			<td>Swinnex-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617509F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SSt20ESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Occludin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31721</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 Catenin antibody</td>
			<td>BD Transduction laboratories</td>
			<td>610133</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Claudin 5 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4502981</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEC100X250UC</td>
			<td>0.15&#181;l/ml final working conc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td>10 &#181;g/ml final working conc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells

이 프로토콜의 목적은 정화와 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델 체 외에 모노 문화 (MC), 사이토 조절 매체 (ACM), MC에에서 pBECs에 기반을 확립 하 고 pBECs의 재배에 대 한 최적화 절차를 제시 하 고 비 접촉 공동 문화 (NCC)의 돼지 이다 또는 쥐 근원. pBECs 절연 되었고 국내 돼지 5-6 개월의 뇌 외피가에서 모세 혈관의 조각에서 경작. 이 파편 meninges, 격리 및 회색 문제, 여과, 소화 효소, 그리고 원심 분리의 균질의 주의 제거에 의해 순화 되었다. 더 오염 세포 제거, 모 세관 조각 puromycin 포함와 경작 했다 매체. 60-95% 합칠, 모 세관 조각에서 성장 하는 pBECs를 passaged 했다 때 투과 할 멤브레인 필터 삽입 하 고 모델에 설립. 장벽 압박감 및 BBB 특성 표현 형 pBECs의 증가, 셀 다음 차별화 요인으로 취급 했다: 막 permeant 8-CPT-캠프 (여기 약식된 캠프), 하이드로 코 티 손, 그리고 포스 억제제, RO-20-1724 (RO)입니다. 절차 9 월 11 일의 기간 동안 실시 됐다 그리고 NCC 모델을 설정할 때는 이다 2-8 주 사전에 교양 있었다. 프로토콜에서 설명 된 절차를 준수 제한이 paracellular 침투성와 내 피 층의 설립을 허용 했다, NCC 1249 ± 80 Ω cm 는 평균 transendothelial 전기 저항 (TEER)를 보여주는 모델 2, 그리고 paracellular 침투성 (Papp) 루시퍼 노란색 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm 초-1 의 대 한 (± sem의 의미 n = 55). PBEC 표현 형이 더 평가 했다 5, 긴밀 접합 단백질 claudin의 좋은 표현 조-1, occludin 및 외화 접합 단백질 p120 catenin. 건강 및 질병에 BBB의 연구의 범위에 대 한 제시 하는 모델을 사용할 수 있습니다 그리고, 매우 제한적인 paracellular 침투성이이 모델은 전송 및 세포내 매매의 연구에 적합.

모델 체 외에 BBB의 설립
제시, 최적화 된 방법에서 pBECs의 재배와 설립 투과성 막 삽입 시스템의 MC 또는 ACM 또는 NCC 없이 이다 (그림 1)와 수행 되었다 9 월 11 일 (그림 2)의 동안. 내 피 세포의 선택을 위해, 순화 된 모 세관 파편의 초기 문화 puromycin 최대 5 일 대부분 오염 세포를 제거 하 고 승진에서 스핀 들 모양의 내 피 세포의 성장에 대 한 치료와 함께 결합 된 모 세관 파편 (그림 3A-C). 하루 4-6, pBECs는 접촉 저해, 경도 정렬 셀으로 겹치지 않는, 성장 60-95%의 confluency에 확산 했다. PBECs IV collagen과 fibronectin에 도금 했다 셀 원하는 confluency를 도달 했다 때에 침투성 막 삽입 필터 막 (1.12 c m2 면적, 0.4 µ m 모) 105 셀/삽입, x 1.1의 조밀도에 코팅는 그들은 일반적으로 4 일 (하루 8-10 게시물 격리) 후 confluent monolayers를 형성. 공동 경작 pBECs 때 쥐 또는 돼지 근원의 이다 최소 NCC (그림 3D)를 시작 하기 전에 2 주에 대 한 폴 리-L-리 신 코팅된 하단 우물에 도금 했다. 2-8 주에 대 한 교양 이다 pBECs;에 BBB 표현 형을 홍보 하기 위한 최상의 지원을 제공 경험으로 나타났습니다 NCC를 설정할 때 이 시간 내에 이다 세포는 벌집 같은 구조 (그림 3E-F)에 배열 confluent 문화 형성. 하루에 4 투과성 막 삽입 시스템 모델 (하루 8-10 게시물 격리), 셀 캠프, 날린와 장벽 압박감 및 BBB 특성 식 패턴 꽉 접합 단백질, 전송기의 증가 자극 했다 고 수용 체입니다.
PBEC 표현 형의 특성화 및 Paracellular 침투성
시각 세포 검사 TEER 측정 함께 정기적으로 confluency 및 투과성 막 삽입 실험 이전에 내 피 세포 층의 압박감을 평가 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법 있습니다. 그림 4 는 2 개의 시리즈에서 명백한 침투성21 (P애플 리 케이 션, 결합 (이온 침투성 반영) TEER의 제어 매개 변수는 BBB 통해 작은 분자 약물 침투성을 평가 하기 위해 실험의 결과 cm s-1) 방사선된 자당 또는 반영 하는 전형적인 작은 약물 분자의 paracellular 침투성 염료 추적 프로그램 루시퍼 노란색 (만 민)의 (~ 200-600 다). P애플 리 케이 션 (약물의 분자량)에 따라 자당 또는 LY P애플 리 케이 션 보다 더 큰 관심의 화합물은 셀에 걸쳐 transcellular 침투성 또는 수송 제안 수 있습니다. 그림 4 쇼를 투과 막 쥐 이다, pBEC의 좋은 배치 위에 경작 하는 pBECs와 삽입 (예: 여기는 LY 설정) 범위 500-2000 Ω cm2, 높은 또는 낮은 몇 TEERs 생성 됩니다. 일부 일괄 처리 프로토콜을 학습의 초기 단계 동안 특히 있을 수 있습니다 주위 낮은 TEERs 100-900 Ω cm2 (예: 여기는 자당 설정). TEER 측정 필터, 예를 들어 시작 TEER 선택할 수 &#62; 500 Ω c m2는 범위의 TEER 표시, 이상 P애플 리 케이 션 은 상대적으로 독립적인 TEER, 이러한 실험에 대 한 충분히 꽉 배리어 층의 지표의. 투과율을 측정 하기 위한 프로토콜 용액/구조물의 종류에 따라 달라 집니다. NCC에 작은 분자의 침투성을 측정 하기 위한 절차의 설명에 대 한 프로토콜 Yusof, SR, 외에에서 설명 되어 있습니다. 알21. 표현의 쥐 이다와 NCC에 pBECs에 꽉 접합 단백질의 평가 면역 형광 검사 (그림 5A-C)에서 같이 셀 접합 함께 claudin 5 occludin, 1, 및 ZO의 지역화를 보여주었다. 또한, 외화 접합 단백질 p120 catenin-셀 연결 (그림 5D)에 따라 잘 정의 된 분포를 보여주었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig1.jpg"> 
그림 1: 적용 된 생체 외에서 BBB 모델의 도식 표현. 침투성 막의 도식 대표 MC (A), ACM (B)와 MC와 NCC 이다 (C)와 pBECs의 시스템 모델을 삽입 합니다. MC, pBEC 성장 매체 또는 ACM 했다 적용 아래 우물에는 NCC에 pBECs와 삽입 2 8 주 된 이다와 웰 스에 배치 하는 반면. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig2.jpg"> 
그림 2: 흐름 차트 pBEC 재배 및 제시 모델의 설립 시 주요 단계. 개요 및 방법에 대 한 타임 라인에 대 한이 도식 프레 젠 테이 션 pBECs의 자란 절차 및 제시 모델 즉 MC 또는 ACM, 그리고 NCC 없이 이다와 설립의 주요 단계를 요약합니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig3.jpg"> 
그림 3: pBECs와 쥐 이다의 초기 문화의 대표적인 시간 과정. 단계 대조 현미경 검사 법 심상 (A-C) , 이다 pBECs의 문화 (D-F) 전망 5 일 이상. 모세 혈관과 오염 세포의 존재를 보여준 초기 문화의 첫 날에 모 세관 조각 정화 (A, 2 일과 성장, 보여주었다 pBECs에 대 한 선택의 추가 하루에 1)후 중간 변경 일 모 세관 조각에서 그들의 성장을 시작 (B, 주 3). PBECs의 confluent monolayers 일반적으로 하루 4-6, 어떤 시간에 pBECs 스핀 들 모양의 형태학 그리고 경도 정렬 했다 달성 했다 (C). 하단에 시드 쥐 이다 일반적으로 5 일 (D-F), 이내 confluent 레이어에 확산 우물 그리고 성장의 2 주 후 NCC 모델에 사용 되었다. 모든 사진에 대 한 눈금 막대: 200 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig4.jpg"> 
그림 4: pBECs의 꽉 접합 무결성. Paracellular 표식 자당에 pBECs의 명백한 침투성 (Papp) (MW 342.5 14C 표시 14.8 25.9 GBq/mmol) TEER에 대 한 루시퍼 노란색 (MW 521.57, 10 µ g mL-1), 플롯. pBECs 잘 마커 꼭대기 챔버에 추가의 베이스에 쥐 이다 위에 1.12 cm2 투과 막 삽입 필터에 성장 했다. 37 & # 730에서 1 시간 후; C, 기저 챔버에서 표시기의 모양을 측정 하 고 꼭대기-기저 P애플 리 케이 션 (x 10-6 cm 초-1) 계산 했다. TEER 측정 되었다 &#62; 3 h P애플 리 케이 션을 사용 하 여 STX100C EVOM 전극, 저항 150 Ω. 빈 투과성 막 삽입 필터에 대 한 루시퍼 노란색 데이터 집합에 대 한 평균 TEER 수정 전에 1249 ± 80 Ω cm2 (± sem의 의미 n = 55). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig5.jpg"> 
그림 5: pBECs의 Immunocytochemical 특성. 1.12 cm2 투과 막 삽입에 성장 하는 pBECs에 대 한 필터 삽입 쥐 이다 위에 기본 음, 꽉 연결 구성 요소 (A) Claudin의 면역 형광 현미경 분석에에서 조-1, 5 (B) Occludin (C) 그리고 외화 접합 단백질 (D) p120 catenin 셀 접속점에 잘 정의 된 지역화를 보여주었다 스핀 들-모양, 겹치지 셀 confluent 뇌 내 피 세포 층을 공개 합니다. 모든 사진에 대 한 눈금 막대: 10 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

14.7K 조회수.  Aarhus University. 프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

쥐 모델에서 Transcranial 집중 초음파를 사용하여 혈액 - 뇌 장벽의 MRI를 유도 장애

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

연구

의학

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

혈액 - 뇌 장벽 장애의 쥐 모델 Neurovascular 치료학 타겟이 분명한 허용하려면

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개<em&gt; 체외</em혈액 뇌 장벽의&gt; 외상성 뇌 손상 모델

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em&gt; 체외</em&gt; 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

마우스의기도 신속 삽관 용 개선 된 방법

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

수술 용 나사를 이용한 마취, 수술 및 수확 방법<em&gt; In Vivo</em&gt; 돼지의 허리 척추 모델

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Establishment and Evaluation of a Porcine Vein Graft Disease Model

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the investigation of disease mechanisms and the development of therapeutic strategies. 
To perform the surgery, we enter the cardiac chamber through the third intercostal space and carefully dissect the internal mammary vein and immerse it in normal saline. The right main coronary artery is then treated for ischemia. The target vessel is incised, a shunt plug is placed, and the distal end of the graft vein is anastomosed. The ascending aorta is partially blocked, and the proximal end of the graft vein is anastomosed after perforation. The graft vein is checked for patency, and the proximal right coronary artery is ligated. 
CABG surgery is performed in minipigs to harvest the left internal mammary vein for its use as a vascular graft. Serum biochemical tests are used to evaluate the physiological status of the animals after surgery. Ultrasound examination shows that the proximal, middle, and distal end of the graft vessel are unobstructed. In the surgical model, turbulent blood flow in the graft is observed upon histological examination after the CABG surgery, and venous graft stenosis associated with intimal hyperplasia is observed in the graft. The study here provides detailed surgical procedures for the establishment of a repeatable CABG-induced VGD model.

In this protocol, novel pig vein bypass grafting was performed through a small incision in the left chest wall without cardiopulmonary bypass. A postoperative pathology study was done, which showed intimal thickening.