우리는 재정 지원을 위해 스콧과 백인 병원 연구 보조금 프로그램을 인정하고 텍사스 A &amp; 공 초점 레이저 현미경의 사용에 대한 의학 통합 이미징 연구소의 M 건강 과학 센터 대학. 우리는 원고 편집에 대한 도움말 씨 글렌 Cryer을 인정합니다.

내피 세포의 1. 시드 <ol><li> 성인 스프 라그 돌리 쥐에서 RBMEC의의 차 문화를 얻습니다 (또는 상업적를 얻을). </li><li> 100cm의 피브로넥틴 (50 μg의 / ㎖) 래트 뇌 내피 세포 성장 배지를 사용하여 코팅 된 배양 접시에서 배양을 RBMECs. 포화 상태에 도달 할 때까지, 매 2 일 매체를 변경합니다. </li><li> 80-90%의 포화 상태에 도달에서 부드럽게 소용돌이 5 ml의 인산염 완충 식염수 (PBS)에있는 세포를 씻으십시오. 세포를 37 ° C로 평형화 따뜻한 0.25 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 1 ㎖, 그들을 노출시킴으로써 분리된다. </li><li> 세포를 분리 및 분산 될 때까지 2-5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. 참고 : 세포를 분리 배양 접시를 누릅니다. 현미경보기 세포 접시의 표면으로부터 세포의 완전한 분리를 확인하기 위해. </li><li> 트립신을 중화하기 위해 페트리 접시에 5 ml의 완전한 미디어를 추가합니다.분리 된 세포를 함유하는 배지를 피펫 및 15 mL의 원심 분리 튜브로 수집. . </li><li> 5 분 동안 220 XG에서 내피 세포를 포함하는 미디어를 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 대기음 후 자동 세포 계수기 또는 혈구를 사용하여 계산됩니다 피펫 세포와 부드럽게를 혼합하고 아래로 3-5 ml의 신선한 쥐의 뇌 내피 세포 성장 매체에 cells.Suspend에게 펠렛을 함유 펠렛을 유지합니다. </li><li> 물론 당 10,000-15,000 세포 사이의 범위 파종 밀도 / 웰, 8 아니라 멸균 챔버 슬라이드 시스템 프리 코트 피브로넥틴 (50 μg의 / ㎖)에 0.7 cm (2) 세포 현탁액을 전송합니다. 합류가 될 때까지 37 ℃에서 세포를 성장 주 : 실험에 의해 필요에 따라 웨스턴 블롯 또는 다른 실험을 수행하기 위해, 셀은 10cm의 세포 배양 접시 나 특별한 요리에서 성장 될 수있다. </li></ol> 2. 산소와 체외에서 포도당 박탈 - 재산 소화모델 참고 : 다음 프로토콜 Zulueta 등의 알에서 적응하고있다. 1997; 주홍 H 등. 2012 8,9. <ol><li> 에 RBMECs에 OGD-R의 효과를 (그림 1 참조) 공부 저산소 세포 배양 시스템을 사용합니다. 설치 및 제조자의 지시에 따라서, 실험을 시작하기 전에 저산소증 세포 배양 시스템을 교정. </li><li> 37 ° C 배양기에서 합류 챔버 슬라이드 (단계 1.8)를 제거합니다. 탈산 소화와 챔버 슬라이드에서 완전 배지를 교체에는 글루코스, 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM), 37 ° C에서 2 시간 동안 95 %, N (2) 및 5 % CO 2로 저산소증 챔버 내에 배치는 OGD 상태를 나타내는 없음. </li><li> 37 ° C에서 95 % O 2, 5 % CO 2 인큐베이터로 세포를 이동하고 신선한 쥐의 뇌 내피 세포 완전한 매체와 함께 제공하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 :이 단계는 재산 소화 상황을 나타냅니다. </li><li> 면역 현지화 및 로다 민 팔로이 딘 라벨링 챔버 슬라이드를 사용하여 (제 3 장 참조). </li></ol> 로다 민 Phalloidin의 사용 ZO-1과 F 액틴 라벨링 3. 면역 형광 현지화 <ol><li> 잘 1 시간 동안 OPTI-MEM / 감소 된 혈청 미디어 / 100 ㎕에 RBMEC의 단일 층을 포함하는 챔버 슬라이드를 노출. 인산염 완충 식염수 (PBS, pH를 7.0-7.2) 100 ㎕에 챔버 슬라이드 3 회 반복한다. </li><li> (PH 7.0-7.2)를 15 분 동안 PBS에 (PH 7.0-7.2)을 4 % 파라 포름 알데히드 100 μl를 사용하여 세포를 수정하고 PBS로 3 번 이상 챔버 슬라이드를 씻는다. </li><li> 또 다른 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100 100 ㎕ (pH가 7.0-7.2)를 사용하여 세포를 Permeabilize 하시려면. 시간 동안 PBS에 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) 100 ㎕로 차단. ZO-1 또는 F-액틴에 대해이 단계 중 하나를 얼룩 / 라벨 세포 중 하나 후. <ol><li> 면역 역을 위해150, 4 ℃에서 N / O 2 % BSA-PBS에서 제조 : ining 1에 ZO-1에 대하여 항 - 토끼 항체와 함께 일차 세포를 배양한다. , PBS로 세포에게 (PH 7.0-7.2)을 3 회 반복한다. 플루 오레 신 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 100 ㎕와 함께 인큐베이션은 실온에서 1 시간 동안 항 - 토끼 이차 항체를 -tagged. </li><li> 로다 민 Phalloidin의 라벨링, 블로킹 다음, 20 분 동안 2 % BSA-PBS에서 제조 1:50 희석 로다 민 팔로이 딘 100 ㎕에 세포를 노출. </li><li> 면역 형광 염색과 PBS에서 로다 민 팔로이 딘 라벨, (PH 7.0-7.2)에서 세포를 씻으십시오. DAPI와 안티 - 페이드 시약을 포함하는 설치 미디어를 사용하여 챔버를 탑재합니다. </li></ol></li><li> 60 X 물 침지 렌즈를 사용하여 세포를 시각화하고 세포를 공 초점 현미경으로 단일 광학 평면에 스캔됩니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

허혈 - 재관류 손상에 대한 생체 외 모델로 OGD-R은 잘 신경 세포 (10, 11)을 공부 설립되었습니다. 투과도 및 TJ 무결성 9 뇌 내피 세포 및 변경에 OGD의 효과를 나타내는 연구가있다. 그러나, 우리의 연구는 다음과 같은 허혈성 뇌졸중 발생 생체 조건에서 허혈성 재관류 손상에 가까운 표현이다 OGD의 효과뿐만 아니라 재산 소화를 보여줍니다. 저산소 허혈 조건 세포층 투과성 vasogenic 부종 4를 증가시킴으로써 중단 BBB 선도, 중추 신경계의 염증을 유도하는 것으로 알려져있다. 재관류 손상은 세포 외 칼륨, 흥분성 신경 전달 물질, 및 내피 신경 부종, 면역 세포 활성화의 방출 상승, 과도한 활성 산소 종 생산, ATP가 고갈되는 매우 복잡하고 역동적 인 과정이다. 이,에서 턴 C, 생산, 클레아 제와 단백질 분해 효소의 유도 사이토 카인로 이어지는 다양한 카스파를 활성화하기 위해 도시 모두 부종, 선도, BBB 무결성 5,12-의 붕괴로 이어지는 다양한 염증 경로의 활성화를 auses. 내피 세포의 미토콘드리아에 의한 다수의 존재로, 허혈 손상에 특히 쉽다. 이웃 내피 세포 꽉 접합 단백질에 의해 유지 꽉 접합에 의해 서로 연결되어 있습니다. ZO-1 밀착 연접 다른 단백질과의 상호 작용에 의해 TJ 무결성을 유지하는데 중요한 역할을하는 것으로 도시되고 &#160; 액틴 세포 골격 조립. 또한, 액틴 세포 골격의 정확한 조절은 세포 - 세포 유착을 포함한 많은 발생 및 생리 과정에 필수적이다. 내피 세포에서 액틴 스트레스 섬유 형성을 차단 및 투과성 항진 13,14 부전과 연관된 것으로 발견된다. 로다 민 phalloiF 액틴 스트레스 섬유 형성을 관찰하는 본 연구에 사용 된 라벨링 기술 딘 것은 종료점 연구이다. Doggett 및 브레슬린 (15)에 의해 도시 된 바와 같이, 그러나, 스트레스 섬유 형성의 동적 및 라이브 영상도 행할 수있다. 현재의 연구는 majorly BBB 꽉 접합 무결성을 향해 ZO-1의 기여를 강조한다. 그러나, 클라우딘 -5,6- occludin, 접합부 부착 분자 (JAM)과 같은 다른 단단한 접합부 분자 등과 같은 OGD-R은 다음 BBB 밀착 연접 무결성 공부 마커로서 사용될 수있다. 이 연구에서 우리는 꽉 접합 무결성을 결정하는 질적 기법으로 면역 현지화 및 F - 굴지 라벨을 사용. 그러나, 우리는 또한 형광 마커와 transendothelial 전기 저항 (봉사자)를 사용하여 투과성의 정량적 측정과 같은 BBB의 다른 중요한 특성을 연구 할 수 있습니다. OGD-R 기법을 이용하여 본 연구에서 제시Biospherix 시스템은 산소의 고정 된 농도에서 저산소증 / 무산소 증 연구에 사용될 수있다; 그러나 내피 세포에 산소 농도를 변화시키는 효과를 연구에 대해이 시스템을 이용할 수 없다. 내피 세포에 산소의 다양한 농도의 효과를 공부를 위해 우리는 목적에 적합한 사용 가능한 다른 모델을 채택 할 필요가있다. 이 기술은 BBB의 투과성 항진 및 TJ 무결성을 규제 다양한 세포 및 분자 이벤트 간의 역학적 관계를 연구에 사용될 수있다. 그들을 이해 BBB 중단 및 미세 혈관 투과성을 감쇠하기 위해 다양한 분자 전략 개발을위한 통찰력을 제공 할 것입니다.

허혈 재관류 (IR)은 부상 뇌졸중, 심근 경색, 외상, 말초 혈관 질환, 외상성 뇌 손상과 관련된 다양한 1,2- 쇠약 합병증 및 사망의 원인으로 자주 발견된다. 뇌 혈관 IR 부상 염증과 부종 3에 이르는 초기 보조 부상입니다. 산화 및 염증 다음 대사성 스트레스의 결과로서 발생하는 합병증의 하나는 항상성 자유 라디칼 형성에 주요한 균형, 혈액 - 뇌 장벽의 변화 (BBB) ​​단단한 접합부 (TJS) 및 미세 혈관 투과성 4,5의 손실이다. 현재, BBB에 IR 손상의 효과를 연구하기 위해 사용되는 생체 내 모델에서 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) microembolism 및 트랜스 제닉 또는 녹아웃 동물을 포함한다. Hossmann 6 논의 그러나, 각각의 단점과 한계가있다. MCAO 모델은 effec을 연구하는 데 사용됩니다산화 환원 스트레스의 TS, BBB의 접합부 통신의 변화와 뇌와 면역 세포 사이의 상호 작용. 그러나, 이들은 그러한 내부에 정밀한 미세 수술 절차 및 어려움에 대한 요구와 같은 다양한 기술적 과제를 제시한다. 뇌허혈을 연구하는 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 사용이 경색 형성에 유전자에 의존하는 분자의 영향, 혈관 해부학의 변화와 다양한 체중 (6)과 같은 문제가있을 수 있습니다 동안 Microembolism는 순간적으로 BBB를 분해. 따라서, 허혈의 체외 모델은 의약품에 대한 역학적 연구를 수행하는 그들의 적용에 주로 최근에 관심을 증가 발견했다. 그러나, 시험관 연구의 결과는 완전히 생체 연구를 나타내지 있으므로 취급시주의를 6으로 해석해야합니다. 내피 세포의 단층 및 미세 혈관 투과성이 낮은 산소 농도의 반작용 효과가 있었다오가와 (7)에 의해 연구. 쥐의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (RBMECs)는 체외 BBB을 개발하는데 사용되었다. 이 프로토콜에 제시된 산소 포도당 박탈과 재산 소화 (OGD-R) 기술은 Zulueta 등의 알과 주홍 등 8,9에 의해 연구에서 적용되고있다. 우리는 0 % O 2, 5 % CO 2 및 95 % N 2를 포함하는 저산소증 / 무산소 증 챔버에 넣어서 OGD-R에 뇌 내피 세포를 노출시켰다. 세포는 나중에 각각 면역 현지화 및 로다 민 팔로이 딘 라벨을 사용하여 TJ 무결성 및 스트레스 섬유 형성의 변화에​​ 대해 평가 하였다. zonula occludens-1의 (ZO-1)의 면역 형광 염색 ZO-1과 같이, TJ의 무결성을 판단하기 위해 수행된다 TJ 단백질 결합에 중요한 발판 막이다. 로다 민 Phalloidin의 라벨링은 세포 골격의 사상 액틴 수 (F- 액틴)를 결정하고, 내피 세포에서 액틴 스트레스 섬유 형성의 명확한 표시이다. &lt;P 클래스 = &quot;jove_content는&quot;&gt;이 방법의 목적은 BBB 내피 세포 TJ 무결성 및 F 액틴 스트레스 섬유 형성을 연구하기위한 생체 외 IR 모델로서 OGD-R의 개발에 대한 통찰력을 제공하는 것이다. 결과는 TJ 단백질의 운명에 대한 정보를 제공, ZO-1, R-OGD 다음 스트레스 섬유 형성한다. 이러한 관계를 이해하는 것은 OGD-R을 다음 트리거되는 기본 분자 메커니즘을 결정하고 OGD-R 처리 다음 BBB 중단을 향상시키기 위해 잠재적 인 치료 전략을 개발 할 수있는 기회를 제공 할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Proox model 110</td><td>Biospherix</td><td>Model 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, no glucose</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&amp;nbsp;well sterile, glass&amp;nbsp;slides&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Any other PBS available can be used</td></tr></tbody></table>

oxygen-glucose deprivation and reoxygenation as an in vitro ischemia-reperfusion injury model for studying blood-brain barrier dysfunction

허혈 재관류 (IR)는 부상 허혈성 뇌졸중과 관련된 이환율과 사망율에 크게 기여하는 것으로 알려져있다. 허혈성 뇌 혈관 사고는 모든 뇌졸중의 80 %를 차지한다. IR 부상의 일반적인 원인은 활성 산소의 형성을 유발 조직에 혈액, 영양소, 산소의 급성 / 만성 폐색 다음과 같은 유체의 급속한 유입이다. 허혈성 뇌졸중은 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​ 부전 vasogenic 뇌부종 따른다. 구조적으로, 혈관 내피 세포 간의 긴밀한 접합 (TJS)은 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 무결성을 유지하는데 중요한 역할을한다. IR 부상이 아닌 특정 염증 반응으로 이어지는 초기 보조 부상입니다. 염증 다음 산화 및 신진 대사에 영향을 미치는 스트레스는 BBB 투과성 꽉 접합 (TJ) 무결성의 중단을 포함하여 보조 뇌 손상을 트리거합니다. 우리의 프로토콜은 체외 제공 &lt;/ EM&gt; 쥐 뇌 내피 세포 TJ 무결성 및 스트레스 섬유 형성에 산소 - 글루코스 손실과 재산 소화 (OGD-R)의 예. 현재 생체 내 모델에서 여러 실험은 IR 손상의 효과를 연구하기 위해 사용된다; 그러나 그들은 이러한 기계적인 관계를 공부 수술, 유전자 따라 분자의 영향과 어려움을 수행함에있어 기술적 문제 등 여러 가지 한계를 가지고. 그러나, 체외 모델은 그 많은 한계를 극복하는 데 도움이 있습니다. 제시된 프로토콜은 잠재적 인 치료 전략을 제공하는 다양한 분자 메커니즘 및 기계적인 관계를 연구하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 체외 연구 결과는 생체 내 연구에서 표준과 다를 수 있습니다주의를 해석되어야한다.

피브로넥틴 프리 코트 눈크 II 챔버 슬라이드에 배양 한 세포를 Biospherix ProOx 모델 (110)에 실 어서 OGD-R을 행 하였다. 로다 민 팔로이 딘 얼룩 라벨을 사용하여 F-액틴 스트레스 섬유 형성을 나타내는도 2와 골격 조립체에 도시 된 바와 같이도 3에 도시 된 바와 같이 OGD-R에 셀을 실시 후, 그들은 면역 형광 기술을 사용하여 ZO-1 접합부 염색을 위해 처리 하였다. 있었다 대조군 세포를 OGD-R 실시 내피 세포 TJ 무결성도 2의 손실을 나타내는, 불연속 접합을 보였다 OGD-R을받지 않는 지속적인 접합부 무결성 없었다. OGD-R 처리를 실시하지 않은 대조군 세포는 전혀 또는 최소한 F 액틴 스트레스 섬유 나타났다 형성 OGD-R을 실시 내피 세포는 액틴 세포 골격 조립도 3의 변화를 나타내는 증가 된 F 액틴 스트레스 섬유 형성을 증명하면서; 대표<html> 참조 번호 (13)의 허가 RINT <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52699/52699fig1.jpg" /> 저산소증 시스템 ProOx 모델 (110)의 1. 일반적인 구성을 그림. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52536/52536fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52699/52699fig2.jpg" /> 흰색 화살표로 표시 꽉 접합 단백질의 그림 2. 면역 형광 지역화 (TJP) ZO-1, RBMECs에 OGD-R 다음 긴밀한 접합의 중단을 입증. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52536/52536fig2large.jpg" target="_blank">이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.</a> &quot;&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52699/52699fig3.jpg" /> 흰색 화살표로 나타낸 바와 같이 RBMECs에 OGD-R에 이어 세포 골격 조립의 변화를 입증 F 액틴 스트레스 섬유 형성, 그림 3. 로다 민 Phalloidin의 레이블. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52536/52536fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em&gt; 체외</em&gt; 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

17.9K 조회수.  Texas A&M University Health Science Center College of Medicine. Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells. 

비디오: Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2 혈관 폐색 / 저혈압 : 세계적인 두뇌 국소 빈혈의 쥐 모델

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

연구

의학

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

신경과학

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is characterized by an interruption in blood supply to the brain leading to cell death and cognitive dysfunction. During and after ischemic stroke, blood-brain barrier (BBB) dysfunction facilitates injury progression and contributes to poor patient recovery. Current BBB models primarily include endothelial monocultures and double co-cultures with either astrocytes or pericytes.
Such models lack the ability to fully imitate a dynamic brain microenvironment, which is essential for cell-to-cell communication. Additionally, commonly used BBB models often contain immortalized human endothelial cells or animal-derived (rodent, porcine, or bovine) cell cultures that pose translational limitations. This paper describes a novel well-insert-based BBB model containing only primary human cells (brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and brain vascular pericytes) enabling the investigation of ischemic brain injury in vitro. 
The effects of oxygen-glucose deprivation (OGD) on barrier integrity were assessed by passive permeability, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements,and direct visualization of hypoxic cells. The presented protocol offers a distinct advantage inmimicking the intercellular environment of the BBB in vivo, serving as a more realistic in vitro BBB model for developing new therapeutic strategies in the setting of ischemic brain injury.

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Here, we describe the method for establishing a triple cell culture model of the blood-brain barrier based on primary human brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. This multicellular model is suitable for studies of neurovascular unit dysfunction during ischemic stroke in vitro or for the screening of drug candidates.

시험관 내 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

생화학

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of oxygen and glucose, which causes energy failure and neuronal death. After an ischemic stroke insult, astrocytes become reactive and proliferate around the injury site as it develops. Under this scenario, it is difficult to study the specific contribution of astrocytes to the brain region exposed to ischemia. Therefore, this article introduces a methodology to study primary astrocyte reactivity and proliferation under an in vitro model of an ischemia-like environment, called oxygen glucose deprivation (OGD). Astrocytes were isolated from 1-4 day-old neonatal rats and the number of non-specific astrocytic cells was assessed using astrocyte selective marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and nuclear staining. The period in which astrocytes are subjected to the OGD condition can be customized, as well as the percentage of oxygen they are exposed to. This flexibility allows scientists to characterize the duration of the ischemic-like condition in different groups of cells in vitro. This article discusses the timeframes of OGD that induce astrocyte reactivity, hypertrophic morphology, and proliferation as measured by immunofluorescence using Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Besides proliferation, astrocytes undergo energy and oxidative stress, and respond to OGD by releasing soluble factors into the cell medium. This medium can be collected and used to analyze the effects of molecules released by astrocytes in primary neuronal cultures without cell-to-cell interaction. In summary, this primary cell culture model can be efficiently used to understand the role of isolated astrocytes upon injury.

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex event in which the specific contribution of astrocytes to the affected brain region exposed to oxygen glucose deprivation (OGD) is difficult to study. This article introduces a methodology to obtain isolated astrocytes and study their reactivity and proliferation under OGD conditions.

사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Impact of Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation on Cell-Cell Interactions

<a href='https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52699/oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia'>Source: Alluri, H., et.al. Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction. J. Vis. Exp. (2015).</a>The video demonstrates the impact of oxygen-glucose deprivation and subsequent reoxygenation on rat brain microvascular endothelial cells (RBMECs) by simulating hypoxic and nutrient-deprived conditions. These conditions result in ATP depletion, increased intracellular calcium, and the generation of reactive oxygen species (ROS), which degrade cell junction proteins and induce stress fiber formation, thereby weakening cell-cell interactions.

Source: Alluri, H., et.al. Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier ...

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화

요약

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