이 작품에 의해 지원 되었다 공중 보건 서비스는 건강의 국가 학회 (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617)에서 부여.

1. 주 1: 신선한 조직 단면 및 기본 보육 <ol><li>메스를 사용 하 여 신선한 조직 (약 0.5 c m 폭 0.5 c m 키 큰) 작은 조각으로 잘라. 별도로 플런저를 각 조직 접착제 그리고 PBS에 4% 낮은 용융 agarose의 3-5 mL를 포함. 스티커를 사용 하 여 조직 정보와 플런저를 레이블을 지정 합니다. 공고히 하는 얼음 양동이에 냉장된 홀더에 넣어요.</li>
	<li>톰 및 설정 섹션을 200 µ m. 설치 톰 삽입 플런저에 면도날의 두께 톰 목욕에 조직으로 탑재.</li>
	<li>100 µ g/mL 또는 18.7 U/mL 헤 파 린 PBS RNA를 보존 하 고 하류 잠재적인 틱 응용 프로그램 허용에 추가 하 여 헤 파 린 (PBS-H)에 식 염 수 인산 염 버퍼를 준비 합니다. 덮고 냉장, 무 균 PBS.의 100-120 mL와 함께 포함 된 조직, 톰 목욕을 채우기 0-에 온도 유지 하기 위해 목욕을 PBS-H 아이스 큐브를 추가 2 ° C. 시작은 톰와 200 µ m 섹션으로 조직. 
	참고: 그것은 조직에서 조직 내의 세포 활동을 최소화 하기 위해 얼음에 냉장을 유지 하는 것이 중요 때 냉장은 신선한 조직 섹션에 쉽게 때문에 고. 다운스트림 흉내만 대 한 계획이 없습니다 경우 혼자 PBS를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>또는 조직 (예: 창 및 폐), 톰으로 잘 잘라 하지 않는 조직으로 얇은 스트립으로 잘라 메스 또는 면도칼을 사용 200 µ m에 최대한 가까이.</li>
	<li>실험 샘플 정보 24-잘 조직 배양 접시의 뚜껑을 분류 하 고 해당 우물에서 조직 실 장소. 조직 약 실에는 섹션을 전송 하는 붓의 1 mL를 포함 하는 24-잘 조직 배양 접시의 우물에 설정 사용 냉장 PBS. 
	참고: 재사용 가능한 조직 챔버는 얼룩 시작 전에 여야 한다. 조직 실 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 와이어 메쉬. 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브의 바닥을 잘라. 튜브의 아래쪽에 있는 구멍에 맞게 원형에서 철 망을 잘라. 열 새 빨갛게 될 때까지 분 젠 버너를 사용 하 여 와이어 메쉬 원. 매우 신속 하 게 와이어 메쉬 원 뜨 고 메쉬에 튜브를 밀어. 와이어 메쉬는 튜브의 하단에 단단히 부착 하 고 다음에 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 3 mL 마크 튜브의 상단을 신중 하 게 차단 확인 하십시오. 각 조직 챔버, 또는 잘 당 조직의 1 c m 2까지 3 조직 단면도 넣어. 교차 오염을 피하기 위해 서로 다른 항 체 조합 우물 사이의 하나 이상의 빈 잘 유지.</li>
	<li>진행 기본 tetramer와 항 체 조직 챔버로 모든 컷된 섹션의 전송 완료 후 즉시 얼룩. 섹션 빠져들, PBS-H의 1 mL에 항상 냉장 보관.</li>
	<li>0.5 µ g/mL FITC 활용, 펩 티 드 로드 MHC와 하룻밤 조직 단면도 품 어-난 tetramers 2% 정상 염소 혈 청 (NGS) PBS-H에 희석. 마우스 또는 다른 비 토끼 항 체가이 외피의 extracellular epitopes에 포함 (예: 쥐 안티 CD8 항 체 희석 2%와 PBS-h에서 1: 500 NGS). 각 잘에서 희석된 항 체의 1 mL를 배치. 
	참고: 한다 주의 일부 향상 및 일부 MHC tetramers T 세포 수용 체 4 , 21을 억제할 수 있는으로 CD8 항 체를 선택할 때. 쥐 안티 인간 CD8 항 체 여기에 설명 된 불안정 하 고 때로는 다소 약한 얼룩에 결과. 여기에 트리플 라벨 때문에 유일한 비 토끼와 비 마우스 CD8 항 체 테스트 그 얼룩진된 붉은 털 원숭이 CD8 T 세포에 대 한 사용 됩니다.</li>
	<li>잘 당 솔루션의 1 mL를 사용 하 여 1 차적인 항 체 및 모든 후속 외피와 수행이 락 플랫폼에 접시와 4 ° C에서 모든 후속 외피. 
	참고: 조직 해야 플 로트 자유롭게 챔버에.</li>
</ol> 2. 주 2: 고정 및 보조 보육 <ol><li>기본 부 화 후 씻어 냉장된 PBS-H 20 분의 1 mL로 두 번 섹션 각 세척. 조직 실 냉장된 PBS-H 해당 우물의 1 mL를 포함 하는 다른 24-잘 조직 문화 접시에 전송 하 여이 작업을 수행. 
	참고: 수 조직 챔버 사이 이동할 때 다른 한 실험 샘플에서 내용을 똑 하지 않도록 주의 하십시오. 모든 후속 외피와 세척, 마찬가지로 적절 한 솔루션을 포함 하는 깨끗 한 접시에 조직 챔버를 전송 합니다. 조직 실에 섹션에서 섹션 조직 챔버의 측면에 붙어 얻을 할 다는 것을 확인 하는 절차 동안 모니터링 해야 합니다. 그들은 솔루션에 다시 그들을 밀어, 경우.</li>
	<li>신선한 PBS 버퍼링 4 %paraformaldehyde 실 온에서 2 h의 1 mL와 섹션 수정 (않는 이상 해결 되지). 차가운 PBS-h 5 분에 두 번 세척 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용. 
	참고: 항 원 복구 및 permeabilization 세포내 epitopes를 감지 해야, 항 검색할 수 있습니다 paraformaldehyde 고정 후 0.01 mol 요소에 섹션을 끓는.</li>
	<li>0.01 mol 요소를 포함 하는 24-잘 배양 배지로 섹션을 전송 하 고 렌지에이 접시를 놓습니다. 3 번 약 10 대 한 섹션을 삶아 s 30의 총 각, s. 
	참고: 매우 조심, 비등으로 솔루션 우물에서 섹션을 강제로 수 있습니다. 이 경우를 사용 하 여 그림 붓 섹션 조직 챔버의 측면에서 또는 접시의 뚜껑에서 다시 적절 한 조직 챔버의 바닥에.</li>
	<li>이전 이차 항 체 외피를 permeabilize 및 PBS-H, 0.3% 세제 (PBS-H-T), 그리고 2% 차단 솔루션에 그들을 배양 하 여 조직 단면도 차단 1 h와 4 ° C. 수행 후속 항 체 외피에 대 한 로커에 NGS PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>보조 부 화에 대 한 전송 조직 실에서 섹션 PBS-H-T/2% NGS에 토끼 안티 FITC 항 체 희석 1:10,000를 포함 하는 우물. 밤새 품 어.</li>
	<li>수행 counterstaining 사용 하 여 마우스 안티-CD20 항 체 희석 PBS-H-T/2% NGS에서 1: 200. 이 옵션에 대 한 검색에서 epitopes 필요한 경우, 셀, 침투 및 위에서 설명한 대로이 부 화 하기 전에 차단.</li>
</ol> 3. 제 3 일: 3 차 인큐베이션 <ol><li>두 번째 부 화 후 20 분 이상 4 ° C에서 PBS-H에 세 번 섹션을 씻어</li>
	<li>붙일 표시 (예, 염소 안티 토끼 활용 된 염소 반대로 쥐 활용된까지 붉은 염료, 녹색 노란색과 염소 반대로 마우스 활용된 녹색 염료 항 체 희석된 1:5, 000, 항 체와 적절 한 최종 부 화 수행 1:5, 000, 그리고 1:2, 000, PBS-H-T/2% NGS에 각각,). 밤새 품 어. 
	참고:이 시점에서,는 인큐베이션 확장할 수 있습니다 최대 3 일 동안 필요한 경우. 섹션을이 incu 동안 판 틴 호 일에 감싸서 빛 으로부터 보호 유지bation 단계 이후, 빛 냉각 fluorophores.</li>
</ol> 4. 제 4 일: 장착 섹션 <ol><li>세척 섹션 3 회 PBS-H에 20 분 이상 
	참고: 다운스트림 분 19에 대 한 계획, tetramers 및 장소에서 항 체를 확보 하 고 다음 두 번으로 PBS-5 분에 대 한 섹션을 씻어 1 시간에 대 한 4 %paraformaldehyde 섹션 수정. 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용.</li>
	<li>는 현미경 슬라이드를 섹션을 전송 하는 붓을 사용 합니다. 조직을 너무 많이 찌 르 지 않기로 조심. 글리세롤/젤라틴 포함 4 mg/mL n 틸 gallate 또는 fluorophore 방부 제를 포함 하는 다른 설치 매체와 함께 각 섹션을 코트. 커버는 coverslip로.</li>
	<li>-20에서 슬라이드 빛 보호 컨테이너에 슬라이드를 저장 ° C. 조직 문화 접시를 헹 구 고 알코올을 사용 하 여 뚜껑에 레이블을 제거. 
	참고: 접시를 다시 사용할 수 있습니다.</li>
</ol> 5. Confocal 현미경 이미지의 수집 <ol><li>confocal 현미경, 각 fluorophore ( 그림 1A와 B)에 대 한 적절 한 레이저와 필터를 사용 하 여 고해상도 이미지를 캡처. 
	참고:이 예제에서는 confocal 현미경 사용 되었다 (재료의 표 참조). 이미지는 녹색 노란색 표시 된 항 원 특정 T 세포, 녹색 표시 CD20 표현 B 셀, 10% 전력에서 488 nm 레이저와 CD8 T 세포까지 붉은 표시에 대 한 15% 전력에서 640 nm 레이저에 대 한 20% 전력에서 561 nm 레이저를 사용 하 여 수집 되었다. 목표와 0.8의 숫자 조리개 X 20을 사용 했다.</li>
	<li>는 순차적으로 여러 800 x 800 픽셀 분야에서 3 개의 채널 간격으로 z-시리즈 3 µ m (또는 다른)를 수집합니다. 수집 된 필드의 몽타주 구성 ( 그림 1C -E). 해당 슬라이드의 정보에 따라 각 몽타주 이미지 이름을 지정 하 고 분석을 위해 저장.</li>
	<li>양적 이미지 분석 각각 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 또는 ImageJ를 사용 하 여 수행.</li>
</ol> 6. 양적 이미지 분석 참고: 양적 이미지 분석 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여. 여기, ImageJ 예제로 사용 되었습니다.
ImageJ 창 ( 그림 2A)에 그것을 드래그 하 여 <ol>는 confocal <li>오픈 몽타주. 
	참고: ImageJ 직접 많은 다른 confocal 현미경에 의해 수집 된 몽타주를 열 수 있습니다. 몽타주 ImageJ에서 직접 열 수 없습니다, 선택한 z-스캔 그것을 열려면 TIFF 파일로 내보냅니다</li>
	<li>선택한 z-검색 분석에 대 한 복제 (&#34; 이미지 &#34;-&#62; &#34; 복제 &#34;) ( 그림 2B).</li>
	<li>다른 채널 분할 (&#34; 이미지 &#34;-&#62; &#34; 색상 &#34;-&#62; &#34; 분할 채널 &#34;) ( 그림 2C).</li>
	<li>객관적 눌러 ROI 관리자에 그것을 추가 하는 해당 채널에서 정량 분석에 대 한 투자 수익을 그릴 &#34; T &#34; 키보드에. 면적 측정. 
	참고: ImageJ의 ROI 관리자에서는 지역 µ m 2 ( 그림 2D).</li>
	<li>형광 밝기 및 대비의 분석 채널을 조정 (&#34; 이미지 &#34;-&#62; &#34; 조정 &#34;-&#62; &#34; 밝기/대비 &#34;) ( 그림 2E).</li>
	<li>평평 이미지에 ROI (&#34; ROI 관리자 &#34;-&#62; &#34; 결합 &#34;) ( 그림 2F).</li>
	<li>계량 사용 하 여 이미지에 긍정적인 세포는 &#34; 다 지점 &#34; 도구 ( 그림 2G).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4(+)+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Steinert, E. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining.">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

인도 표준시 IHC와 결합 감지, 특성화, 및 항 원 특정 CD8 T 세포 다른 셀 및 조직 구조는 컨텍스트 네이티브 환경에서 측정을 위한 필수적인 도구를 제공 합니다. 여기, 우리는 인도 표준시 IHC, 이어서 양적 이미지 분석, 위치, 풍요, 붉은 털 원숭이에서 림프절에 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을 결정을 함께 결합에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다. 적용된 인간, 마우스, 또는 어떤 MHC에 대 한 다른 종 조직 수 비슷한 얼룩-내가 tetramers 사용할 수 있습니다. 또한, 펩 티 드 MHC 종류 II tetramer 또는 dextramer 얼룩 수행할 수 있습니다 상대적으로 비슷한 방법론을 사용 하 여 조직4,,56,7, 항 원 특정 CD4 T 세포를 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 29 일 결정 하는 분 또한 결합 될 수 있다, 예를 들어 이펙터를 목표 셀 vivo에서 18,19레벨. 미래에, 그것은 인도 표준시/IHC 더 고급 제자리에 RNA와 DNA 탐지 방법론 인도 표준시/IHC 결합 하 여 수행 흥미로울 것입니다. 교 잡 분석 실험 현장에 있는 최근 전진 RNAscope와 DNAscope24의 개발이 포함 됩니다. 이러한 기술은 조직에 대상 RNA와 DNA의 검출에 대 한 수 있습니다. 그것은 인도 표준시와 IHC 동시에 감지 바이러스 특정 CD8 T 세포, 바이러스 성 RNA, 바이러스 성 DNA, 그리고 관심의 항 원 항 체 라는 이러한 방법론을 결합 하는 흥미로운 것입니다.
우리가 원래 신선한 조직, 최근 몇 년 동안에서 짧은 기간, 및 냉동된 조직4에 대 한 수정 된 조직 인도 표준시 방법을 설명 하는 동안 우리는 독점적으로 사용 신선한 조직 단면도, 그들은 지속적으로 생산 하는 최고 품질 얼룩 그리고 두꺼운 직물 단면도 세포의 검사에 대 한 허용. 절차에 대 안으로 제시 여기, 한 수 적용할 tetramers 조직, 밤새 품 어, 수정, 포함, 및 매체에 cryopreserve (예: 10 월), 냉동된 얇은 섹션, 생산과 IHC 수행 나중22. 마찬가지로, 우리는 정기적으로 조직 섹션 tetramers의 하위 집합을 혼자 얼룩 하 고 섹션 추가 counterstaining 조합에 대 한 앞으로 있도록 OCT에서 동결. 또한, Qdot 655 활용 된 펩 티 드 MHC multimers cryopreserved 조직 섹션13항 원 특정 T 세포를 직접 시각화를 사용할 수 있습니다.
우리는 여기에 설명 된 간접 tetramer 얼룩. 얼룩이 직접 송출 또는 PE 활용 된 tetramers를 사용 하 여 또한 표시 되었습니다4,22일. 이 경우에, MHC tetramer 필요한 농도 간접 tetramer 얼룩에 사용 되는 보다 높다. 우리 손에 APC 라는 tetramer의 20 µ g/mL의 농도에서 항 원 특정 세포를 감지 효과적 이었습니다. 그러나, 착 색 강도가 했다 간접 라벨로 얻은 것 보다 훨씬 낮은 안티 FITC 항 체와 증폭을 포함.
우리는 압축 기반 톰의 사용 ( 재료의 표참조)으로 신선한 조직의 단면도 절단 하는 과정을 완화 하는 신선한 조직 절단에 대 한에 비해 진동 톰23을 사용 하 여 발견. 그러나, 압축 기반 톰이 사용할 수 없는 경우에는 진동 톰 또는 메스 사용할 수 있습니다 신선한 조직의 단면에 대 한.
이 방법의 주요 한계는 신선한 조직의 사용 이다. 즉각적인 관심과 처리를 필요로 하기 때문에 조직에 신선한를 사용 하 여 고정 또는 냉동 조직 보다 훨씬 더 어려운입니다. 우리가 성공적으로 신선한 조직 조직 문화 매체 또는 PBS. 얼음에 하룻밤을 발송 했습니다. 그러나, 배송; 가끔 문제가 되었습니다. 예를 들어 눈 폭풍 48 h 이상 조직의 선적을 지연 있다. 이러한 경우에, 우리는 신선한 조직 구분 및 48 h 후 추출 일반적으로 얼룩진 그 특정 얼룩 일부 조직 저하;의 표시와 표시 발견 조직 72 h 후 추출 물 얼룩에 대 한 너무 저하는. 우리 또한 얼음 블록 너무 추 워 또는 너무 가까이 조직 운송; 중 조직 고정 수와 신선한 조직의 선적 발견 이 어 일반적으로 얼룩이 지기 위한 조직을 파괴합니다. 따라서, 그것은 매우 중요 한 냉장, 동결 되지, 하지만 신선한 조직 배 인도 표준시를 시작 하 고 학생의 큰 거래를 필요로 24 h. 신선한 조직 처리 또한 내 얼룩 및 직원 시간, 여러 동물에서 조직 또는 연구 참여자 수 없습니다. 수집 하 고 나중에 함께 묻은. 이러한 어려움에도 불구 하 고 우리는 신선한 조직 단면도 아름 다운, 특정 인도 표준시/IHC 얼룩에 대 한 최선의 선택 찾으십시오.
여기에 설명 된 인도 표준시/IHC 방법의 또 다른 한계는 간접 착 방법입니다. 이차 항 체 조합을 생성 수 동물의 다른 종의 수에 제한이 있으므로, 우리는 방법만 3 개 또는 4 개의 형광 항 체 조합 한 번에 얼룩 얼룩 간접 항 체에 의해 제한 됩니다. 이 한 조직 슬 래 브에 수집 될 수 있는 정보의 양을 제한 합니다. 직접 IHC 염색이 한계를 극복 하 고 간접적인 방법에 비해 훨씬 약한 형광 신호를 생산 하는 각 항 체와 동시에, 8 개 이상의 항 체 태그 항 원 검출 기능을 확장할 수 있습니다. 따라서, 간접 IHC 사용할 수 있습니다 간접 IHC 대신 counterstaining IST 얼룩진 조직에 대 한 항 원 특정 CD8 T 세포의 IST 탐지와 결합 하면 세포 항 원에의 증가 숫자의 검출에 대 한 허용.
어떤 경우에, 상당한 autofluorescence 또는 일반적인 tetramer 또는 항 체 바인딩 인도 표준시/분 발생할 수 있습니다. 이 때문에 좋은 긍정 및 부정적인 컨트롤은 배경에서 특정 얼룩 및 autofluorescent 얼룩이 지기를 분별 하는 데 필요한. 좋은 부정에 대 한 제어 MHC I tetramers 부정적인 제어 조직 포함 (예를 들어, 비 감염 조직; 조직 MHC 내가 물 tetramers 로드 핀치, 조직 없이 물에, 또는 무관 한 펩 티 드 또는 무관 한 MHC tetramers; tetramers 하지만 항 체를 증폭).
요약 하자면, MHC I IST IHC와 결합 위치, 풍부, 항 원 특정 조직에서 CD8 T 세포의 표현 형을 결정 하는 유용한 도구입니다. 이 방법론은 다른 세포 유형 및 조직 구조 유지 상대 지역화와 네이티브 환경에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 검출에 대 한 수 있습니다. 이 방법은 지역화, 표현 형, 본질적으로 어떤 항 원 특정 CD8 T 세포는 MHC에 대 한 tetramers는 어떤 조직에서 사용할 수 있는 계량 하는 데 사용 될 수 있기 때문에 광범위 하 게 적용 됩니다.

T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. 펩 티 드/MHC의 개발 종류 I 항 원 특정의 얼룩 CD8 T 세포1 와 MHC 클래스 II tetramer 얼룩이 지기의 CD4 T 세포2 의 cytometry로 최근 개발에 우리의 능력을 연구 하 고 이해 혁명 tetramer는 T 세포의 immunobiology입니다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지 방화의 검출에 대 한 허용 하지 않습니다. T 세포를 추출 하는 피의 기술 필요한 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직3에 효과.
우리와 다른 펩 티 드 로드 MHC 클래스 I 및 클래스 II tetramer 또는 multimer 시 약 조직4,,56,7, 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포 얼룩 사용 방법이 개발 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13.이 IST 메서드 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형의 결정에 대 한 허용 및 다른 세포와 조직에 구조 세포를 감지 하는 수단을 제공. 우리의 그룹은 광범위 하 게 사용 하는 MHC-나 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 연구-유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)-얼룩 tetramer HIV와 SIV immunopathogenesis의 이해를 얻기 위해 림프, 생식 기, 그리고 직장 조직에서 특정 CD8 T 세포 그리고 성공적인 예방 접종 전략14,15,,1617의 상관 관계를 식별 합니다. 또한, 우리 또한 개발 현장에서 교 잡 (ISH) 지역화 및 바이러스 관련 CD8 T 세포와 바이러스에 감염 된 세포를 계량 IST를 결합 하는 기술 조직에서 그리고 vivo에서 이펙터 대상 수준을 결정 하 18 , 19.
여기, 우리는 MHC 펩 티 드 로드를 사용 하 여 프로토콜을 설명-난 tetramers 얼룩 신선한 조직 섹션에 항 원 특정 CD8 T 세포에 counterstain 조직 IHC를 사용 하 여 특정 조직 구획에서 특정 고기에 포함 된 셀을 계량 하 고. 이 절차는 리 외., 어떤 우리가 결정 위치, 풍부, 및 림프 조직에 SIV 전용 T 세포의 표현 형 원숭이20에서 만성 SIV 감염 시에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 된 것과 동일 합니다.
이 절차에 대 한 신선한 조직 구분 되며 MHC 펩 티 드 로드와 하룻밤 incubated-난 tetramers fluorescein 안산 분자 (FITC)에 활용. 그들은 다음 paraformaldehyde에 고정 됩니다. 조직, 고정 후 MHC tetramers에서 신호는 토끼 안티 FITC 항 체를 사용 하 고 붙일 태그-토끼 IgG 항 체, 바인딩된 tetramers에서 신호 증폭을 함께 알을 품을 증폭. IHC는 인도 표준시와 함께에서 항 원 특정 T 세포와 주변 셀을 특성화 하는 데 사용 됩니다. 셀의 또는 세포 외 공간에서 표면에 epitopes를 인식 하는 항 체는 tetramers와 기본 인큐베이션에 포함 됩니다. 세포내 epitopes를 인식 하는 항 체 얼룩이 지기 전에 세포 벽의 침투가 필요 합니다. 얼룩진된 조직 단면도 confocal 현미경을 사용 하 여 몇 군데는 고 confocal 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 레이블이 지정 된 셀은 공초점 현미경 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용 하 여 정량. 설명된 프로토콜 있는 MHC에 대 한 기본적으로 모든 조직에 항 원 특정 CD8 T 셀 얼룩을 사용할 수 있습니다-난 tetramers 사용할 수 있습니다.

<table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:906px;" width="906">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC-I monomer</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>Materials for MHC-tetramer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExtrAvidin-FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2716</td>
			<td>Materials for MHC-tetramer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBL6391V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4204-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol/gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBH2672V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td>
			<td>Acris</td>
			<td>0714</td>
			<td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-a-h-CD20 (1:500)</td>
			<td>NOVOCASTRA</td>
			<td>6026819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td>
			<td>Vector</td>
			<td>6022201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-m-A488 (1:2000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>124083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-rb-Cy3 (1:5000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>106232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-rat-Cy5 (1:5000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>118088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>86579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome: VF-300 Microtome</td>
			<td>Precisionary Instruments, LLC</td>
			<td>1079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Set Instant Adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>46551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Globe scienfitic Inc.</td>
			<td>#1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor&#160; blade</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>121-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Disposable Scalpel</td>
			<td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td>
			<td>No. 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round paintbrush #2</td>
			<td>PRINCETON ART &#38; BRUSH CO.</td>
			<td>4350R</td>
			<td>Can trim as needed with razor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW_Viewer4.0</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. Cytometry에 의해 분석 하는 항 원 특정 T 세포의 MHC tetramer 얼룩의 개발은 우리의 능력을 공부 하 고 이해 하는 T 세포의 immunobiology 혁명 있다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 피의 기술 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지역화를 확인할 수 없습니다. T 추출 하 셀 필요 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직에 효과. 제자리에서 MHC tetramer 얼룩 (IST) T 세포는 특정 조직에 대 한 관심의 항 원에 대 한 시각화 하는 기술입니다. Immunohistochemistry (IHC)와 함께, 인도 표준시 풍부, 위치, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형을 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 얼룩 특정 조직 구획 내에 있는 특정 고기와 항 원 특정 CD8 T 세포를 열거 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 절차는 동일 우리 리 외., 권리에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 하는 "낭 CD8에 의해 부분적으로 억제에 유인원 면역 결핍 바이러스 생성 세포+ 세포 에 비보." 그들은 지역화, 표현 형, 하는 데 사용 될 수 있기 때문에 본질적으로 어떤 항 원 특정 CD8 T 세포는 MHC tetramers 사용할 수 있습니다, 어떤 조직에서 계량 설명 하는 방법을 광범위 하 게 적용 됩니다.

그림 1 에 confocal 이미지 공초점 현미경을 사용 하 여 수집 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 양적 이미지 분석을 ImageJ를 사용 하 여 보여 줍니다. 그림 3 과 4 대표 이미지는 SIV에서 림프절 조직의 감염 CD20 항 체와 MHC tetramers, CD8 항 체, 얼룩진 붉은 털 원숭이 쇼 그리고 MHC tetramer 얼룩의 특이성을 설명 하기 위해 제공. 그림 3 비교 MHC 종류 I tetramers 펩 티 드 MHC 클래스와 얼룩이 나 같은 조직에서 섹션에 비해 SIV에서 로드 tetramers 로드는 무관 한 펩 티 드. 그림 4 셀 MHC/SIV-펩타이드 tetramer로 얼룩진 공동 CD8 항 체, 하지만 하지 CD20 항 체는 B 세포를 얼룩이 묻은 것을 보여줍니다. 그림 5 여러 confocal z 시리즈 필드 tetramer 스테인드 림프 노드의 다른 해 부 격실에 특정 고기에 포함 된 셀의 정량화에 대 한 사용에서 만든 몽타주의 예를 보여 줍니다. 확대는 CD20 얼룩, 그리고 주변 T 세포 영역 있는 MHC tetramer 스테인드 셀 검출 될 수 있다, 일부는 공동 T 세포 활성화와 확산의 표식 인 Ki67 표현에 의해 구분 된 B 세포 여 포와 함께 림프 노드의 영역을 보여 줍니다. 이 얼룩 조합 SIV 특정 CD8 T 세포 내부와 외부 관계 SIV 특정 CD8 T 세포와 다른 Ki67 표현 세포에서에서 B 세포 모 낭 및 B 세포의 표현 형의 결정을 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56130/56130fig1.jpg"> 
그림 1: 대표 스크린샷 Confocal 이미지 공초점 현미경을 사용 하 여 수집 하는 방법을 보여 주는. (A) 수집 confocal 이미지를 수집 하는 데 사용 되는 모드. (B) 채널 이미지 컬렉션에 대 한 사용. (C) 20 X 목표와 800 x 800 픽셀 필드 이미지 컬렉션에서 사용 되었다. (D) A 순차적 z-스택 3 µ m 간격으로 수집 되었다. (E) 타일 윤곽을 그리 다 및 여러 분야에서 이미지를 수집을 채택 되었다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56130/56130fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56130/56130fig2.jpg"> 
그림 2 : 양적 시연 대표 스크린샷 이미지 ImageJ를 사용 하 여 분석. (A) 오픈 ImageJ 창으로 드래그 하 여 confocal 몽타주. 분석 (B) 중복 선택한 z-검색 (C) 다른 채널 분할. (D) 무승부 객관적 "T."를 눌러 ROI 관리자에 그것을 추가 하는 해당 채널에서 정량 분석에 대 한 투자 수익 (E) 조정 형광 밝기 및 대비 채널의 분석. (F) Flatten 이미지에 ROI (G) 수 긍정적인 세포 이미지입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56130/56130fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56130/56130fig3.jpg"> 
그림 3 : 인도 표준시는 SIV에 감염 된 붉은 털 원숭이에서 겨드랑이 림프절 단원의 IHC 결합. Mamu-A * 02 tetramers 로드 SIV Nef YY9 펩 티 드 항 원 특정 CD8 T 세포, 얼룩 사용 되었다 그리고 유사한 tetramers B 형 간염 바이러스에서 없는 FLP 펩 티 드와 함께 로드 된 부정적인 컨트롤 (빨간색)으로 사용 되었다. 마우스 안티-CD20 항 CD20 얼룩 사용 되었다+ B 세포 (녹색), 및 CD8 얼룩 쥐 안티 CD8 항 체 사용 되었다+ T 세포 (파란색). (A) A 대표 이미지는 겨드랑이 림프 노드 섹션에서 물 YY9 tetramers, CD20, 및 CD8 항 체. (B) 패널에서 동일한 이미지를 보여주는 YY9 tetramer 혼자 얼룩. (C) 대표 이미지 같은 겨드랑이 림프절에서 섹션의 FLP tetramers와 CD20와 CD8 항 체 얼룩이. (D) 패널은 같은 이미지 C FLP tetramer 혼자 얼룩. 바 규모 = 100 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56130/56130fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56130/56130fig4.jpg"> 
그림 4 : 인도 표준시 IHC MHC tetramer 얼룩의 특이성을 보여주는 함께. 대표 겨드랑이 림프 노드 섹션 Mamu-A * 02 tetramers Nef YY9 레이블 SIV 특정 CD8 T 세포 (적색), (녹색), 라벨 B 셀에 마우스 안티-CD20 항 체 및 레이블 CD8 T 세포 (블루) (A에 쥐 안티 CD8 항 체 펩 티 드와 함께 로드 된로 얼룩진 ). SIV-특정 CD8 T 세포는 tetramer + (B) CD20- (C), 및 CD8+ (D). 스케일 바 = 10 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56130/56130fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56130/56130fig5.jpg"> 
그림 5: 인도 표준시 IHC 위치, 풍부, 및 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을 표시와 함께. (A) 대표 겨드랑이 림프 노드 섹션 Mamu-A * 02 tetramers SIV 특정 CD8 T 세포 (적색), Ki67 항 체 (녹색), 확산 셀 라벨 및 라벨 B 셀 (파란색)에 IgM 항 체를 Nef YY9 펩 티 드와 함께 로드 된로 얼룩진. 눈금 막대 = 100 µ m.의 패널 A. IgM 얼룩에 선택된 된 영역 (B) 확대 "F;"로 표시 되어 있는 follicular 영역 정의 extrafollicular 지역 "EF"로 표시 됩니다 Tetramer+ 세포는 화살표와 함께 표시 됩니다. 눈금 막대 100 µ m. 대표 tetramer+ Ki67 =- 셀 (C, D, E) 및 tetramer+ Ki67+ 셀 (F, G, H). 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56130/56130fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K 조회수.  University of Minnesota. 여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석<sup&gt; +</sup&gt; 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

신진 대사 매핑: 양적 효소 Cytochemistry 및 Histochemistry Dehydrogenases 세포와 조직에서의 활동을 결정 하

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...