: J.L. 및 T.V. 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 (NIAID) 건강의 국가 학회 (R01 AI111965)의 의해 지원 됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 알레르기 국립 연구소와 전염병 또는 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. MC는 호주 NHMRC 교장 연구원입니다. J. L.는 호주 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC) 수석 연구 위원, 그리고 T.V.는 호주 NHMRC 산업 경력 개발 수준 2 연구원은. E.K.S는 ASM (미생물학을 위한 미국 사회)에 대 한 임명된 영 대사 2017 이며 오스트레일리아 대학원 포상에 의해 지원 됩니다. 이 작품의 멜버른에 낭 성 섬유 증 (5-8일 의 8 월 2017)에 Australiasian 회의 12일 에 발표 되었다.

에서 모나 쉬 대학 인간 연구 윤리 위원회 (MUHREC) 윤리에 대 한 승인을 얻은.
 1. 분석 결과의 응용 프로그램: 환자 샘플 컬렉션 <ol><li>때 환자 150 mg ivacaftor 또는 ivacaftor 125 mg /lumacaftor의 그들의 표준 복용량을 소요 하는 시간을 기록 200 밀리 그램.</li>
	<li>참고 아래 환자 혈액 샘플 수집 하는 때 정확한 시간. 
	참고: 24 시간 시간 걸쳐 4-5 샘플을 수집 것이 좋습니다. 안정 상태에서 C 최대 농도 후 달성 될 것입니다 표시 시간 포인트는 2.5-4 h 게시물 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 조합 주입 한 샘플 컬렉션은 가능 하면 &#62; 연속 치료 5 일.</li>
	<li>상용 치료 블루 튜브에 혈액의 4-5 mL 수집.</li>
	<li>전체 혈액의 수집, 후 실 온에 그대로 두면 응고 혈액 수. 
	참고:이 일반적으로 15-30 분 걸립니다</li>
	<li>냉장된 원심 분리기에 4 ° C에서 10 분 1000-2000 x g에서 centrifuging 여 혈전을 제거 합니다. 플라즈마로 결과 상쾌한 지정.</li>
	<li>원심 분리, 다음 즉시 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 깨끗 한 폴 리 프로필 렌 튜브에 상쾌한 (플라즈마)를 전송. 레이블 플라즈마 환자 ID (예를 들어, 환자 1), (예를 들어, ivacaftor-lumacaftor 조합), 관리 약물 튜브 시간과 환자 샘플 수집 (예를 들어, 2.5 h 후 복용량) 했다.</li>
	<li>유지 샘플 2-8 ° C에서 처리 하는 동안. 처리 완료 되 면 저장 샘플에서 &#8211; 20 ° c.</li>
	<li>필요한 경우 샘플 분석 연구소 승인된 택배 발송. 
	참고: 샘플을 드라이 아이스에 도착까지 운송 해야 하 고에 지켜져야 한다 &#8211; 분석까지 80 ° C.</li>
</ol> 2. 준비와 발생 샘플의 처리 및 표준 참고: ivacaftor/lumacaftor 치료에 건강 한 기증자 순진한에서 플라즈마 호주 적십자에서 얻은. 무결성을 보장 하기 위해, 모든 샘플/표준 수집 및 처리 하는 동안 2-8 ° C에 보관 한다. 처리 완료 되 면 저장 샘플에서 &#8211; 20 ° C.
<ol><li>IVA, IVA 카복실산, hydroxymethyl IVA 및 루마 내부 기준에 대 한 참조 될 것입니다 밖으로 무게.</li>
	<li>LC MS 학년 메탄올 100 µ g/mL와 10 µ g/mL에서에서 각 분석 (IVA, M1, m 6와 루마)의 두 개의 독립적인 재고 솔루션 준비. 
	참고: 화합물 벤치탑에 10 일 후에 만료 됩니다.</li>
	<li>갓 준비 각 분석 실행 전에 LC MS 교정 표준 교정 표준 희석에 의해 재고 솔루션 농도 따라 달성 하기 위해 인간 플라스마로: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 및 10.0 µ g/mL. 이 샘플을 표준 이라고 합니다.</li>
	<li>단백질 침전, 이기 (ACN, LC-MS 학년)에서 0.1% 개미 산 (FA)를 준비 하 고 필요한 때까지 냉장고에 두고 하.</li>
</ol> 3. 발생 샘플 및 표준의 전처리 <ol><li>실내 온도에 equilibrate를 모두 환자와 빈 플라즈마 샘플 수.</li>
	<li>15 각 플라즈마 샘플 혼합 소용돌이 샘플 당 s.</li>
	<li>폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 표준에 대 한 어느 빈 플라즈마 또는 분석에 대 한 환자 샘플의 100 µ L 약 수 전송.</li>
	<li>표준 튜브의 각각에 내부 표준 IVA 추가 (예를 들어, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 및 잠재적인 농도 범위를 커버 하 10.0 µ g/mL), 뚜껑을 닫고 2-3 미 참고 내부 표준에 대 한 소용돌이입니다만 빈 플라즈마에 추가 없고 내부 표준 환자 샘플에 추가 됩니다.</li>
	<li>반복 단계 3.4. 다른 내부 표준 M1, M6, 및 루마.</li>
	<li>뚜껑에 아무 방울은 되도록 짧게 각 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>0.1%의 혼합의 추가 200 µ L 플라스마 단백질 침전을 각 관으로 ACN에 FA.</li>
	<li>소용돌이 약 15에 대 한 적극적으로 혼합물 s.</li>
	<li>튜브 냉장고에 10 분 동안 서 서 허용.</li>
	<li>가능 하면 4 ° C에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>1.5 mL HPLC 유리병에는 상쾌한의 200 µ L 약 수 13 mm 주사기 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>HPLC MS 분석에 대 한 LC MS 유리병에 상쾌한의 전송 100 µ L.</li>
</ol> 4. HPLC MS 분석 참고: 트리플 4 극 자 질량 분석기 (표 1)와 결합 하는 LC-MS 시스템에는 HPLC-MS 분석 수행.
<ol><li>설정 LC-MS 시스템에 자동 샘플러에 예제와 함께 트레이에 놓습니다.</li>
	<li>가드 열에 열을 연결 하 고 LC-MS 시스템에 연결.</li>
	<li>모바일 단계의 두 병을 연결 (a: 병 100 %ACN; 병 b: 0.1% 개미 산 성 물에서) 및 LC-MS 시스템 equilibrate.</li>
	<li>LC MS 프로토콜에는 다음 매개 변수를 통합.
	<ol><li>2:1 비율에서 질량 분 서 계에 들어가기 전에 모바일 단계 흐름을 분할 (낭비: MS 입구).</li>
		<li>수행 물에 100 %ACN 0.1% 개미 산으로 구성 된 모바일 단계를 사용 하 여 0.5 mL/min의 유량에 그라데이션 차입 (시작 지점에서과, v/v). 분석을 통해 모바일 단계의 볼륨 % 변경 유의.</li>
		<li>긍정적인 분무 이온화 모드에서 질량 분 서 계 운영.</li>
		<li>LC MS 설정이 다음과 같습니다 있는지 확인: 이온 스프레이 전압 4.5 kV, 충돌 에너지 295.9 V, 가스 nebulizing: 3 L/min에서 질소; 충돌 가스: 아르곤, 건조 가스 20 L/min 흐름, 전압 3 분기 렌즈:-22 V, desolvation 온도 250 ° C 열 블록 400의 온도 ° c.</li>
		<li>주사 10 µ L 볼륨 샘플 당.</li>
		<li>여러 반응 감시 (MRM)를 사용 하 여 검색 analytes. 모니터 m/z 392.49의 이온 전환 &#8594; 393, m/z 408.49 &#8594; 409, m/z 422.47 &#8594; 423 및 m/z 452.40 &#8594; IVA, IVA M1, IVA M6 및 루마, 453 각각. 
		참고: 새로 최적화 된 메서드는 아직 FDA 기준에 따라 유효성을 완전히 검사.</li>
	</ol></li></ol> 5. 보정 곡선 <ol><li>내부 표준 4 개의 analytes의 각각의 피크 면적 비율의 교정 표준 명목상 농도 사이의 관계를 사용 하 여 각 분석 실행 전에 구문 LC-MS 보정 곡선 LC MS 설정 프로그램 내에서 ivacaftor (IVA M1, IVA M6 또는 루마). 
	참고: 보정 곡선의 건설에 대 한 정확한 단계는 LC MS 장비 사용 중인 모델에 의존 합니다. 이 정보는 장치 설명서에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>1/C 2 농도의 상호에 따라 가중치에 의해 선형 최소 제곱 회귀 분석을 수행.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor.">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li><li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).</li><li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis.">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li><li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation.">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide+(VX-770,+ivacaftor),+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator.">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li><li>FDA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee. 98 , (2015).</li><li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers?.">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+gating+potentiators,+including+VX-770,+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression.">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).</li><li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis.">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).</li><li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).</li><li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertex prescribing infomation. , (2015).</li><li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+(ivacaftor).">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+HPLC+and+LC-MS/MS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor,+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO.">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li><li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+LC-MS/MS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma:+application+to+a+pharmacokinetic+study.">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이전에 보고 된, 우리의 그룹은 처음으로 개발 및 신속한 검출 및 ivacaftor 및 hydroxymethyl IVA M1 (활성) 및 IVA 카복실산 M6 (비활성); 그것의 주요 대사 산물의 정량화를 위한 HPLC 및 LC MS 메서드를 유효성 검사에 대 한 그리고 lumacaftor 플라즈마와 CF 환자14의 래. 우리의 그룹에 의해 이전 보고 분석 결과 성공적으로 루마, IVA, IVA M1 및 IVA-M6 플라즈마에서의 농도 CF 환자 IVA 150 mg /q12 h와 정상 상태 표준 치료의가 래를 계량 하는 데 사용 됩니다 (라틴어 용어: quaque 12 h; 한 번 모든 12 h) 또는 200 mg /q12 h 루마-125 mg /q12 h IVA 조합14. 대량의 환자 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 우리 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 열 c 8를 사용 하 여 보고 된 방법 최적화 했습니다 (2.6 µ m; 100 Å; 50 x 2.1 m m2) 및 현재 대신 그라데이션 용 매 시스템 isocratic 차입입니다. 이 샘플 당 6 분 상영 시간을 줄일 수 있습니다.
이 안정적이 고 새로운 방법을 생물 학적 체액에서 ivacaftor 및 ivacaftor lumacaftor 조합의 치료 약물 모니터링, 민감한 간단 하 고 빠른 방식을 제공 합니다. 약물 효능을 극대화 하 고 의료 비용을 포함 노출-반응 관계를 개발 하는 필요를 감안할 때, 더 민감한 도구 개발 및 임상 증거 기반 치료를 사용 하 여 높은 처리량을 확인 필요 분석 기법 환자의 고통 cf. 우리 그룹에 대 한 이전 보도 했다 부분적으로 유효한 HPLC MS 동시에 플라즈마에 선 CF 환자14IVA, IVA M1, m 6 IVA 및 루마를 분석 하기 위한. Ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 조합 받은 환자의 분석에 대 한 일반적이 고 사용 하기 쉬운 분석 프로토콜을 구축 것이 용이 하 게 데이터를 비교 및 미래의 pharmacokinetic 연구의 결과의 해석. LC MS 기술을 사용 하 여 생물 학적 체액에 IVA, IVA M1, m 6 IVA 및 루마 측정 치료 결과 관하여 노출-반응 관계를 탐구를 위한 강력한 도구를 구현 될 수 있습니다.
더 일반적으로, 생물 학적 체액에 ivacaftor 또는 ivacaftor-lumacaftor 조합의 HPLC MS 분석 CF에서 고통 받는 환자와 개별된 pharmacotherapeutic 전략의 구현에 대 한 분자 기초를 제공할 수 있습니다. 고 증명할 수 있습니다. 함으로써 비싼 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 조합 치료 비용 효과, 잠재적으로 덜 자주 먹이 지에 대 한 필요성을 나타내는 이유로 유용 합니다. 제안 된 분석 방법 pharmacokinetic pharmacodynamic 임상 연구에 적용 하 여 기회 더 큰 환자에서 ivacaftor 또는 ivacaftor-lumacaftor 조합의 pharmacokinetic 매개 변수를 조사 하기 위해 생겨났다 집단.

낭 성 섬유 증 (CF)는 폐, 간, 췌 장 및 췌 장 불충분1, 및 폐 기능 감소 등 진보적인 다 기관 실패를 일으키는 원인이 되는 내장의 외 분 비 점액 분 비와 관련 된 일반적인 유전자 질환 2,3. Ivacaftor (IVA)는 첫 번째 식품 및 의약품 안전 청 (미국 FDA) 및 유럽 의약품 청 (EMA) 승인 낭 성 섬유 증 횡단 막 전도도 레 귤 레이 터 (CFTR) potentiator 마약, 중요 한 생산 입증된 임상 효능 CF 환자 G551D CFTR 베어링의 작은 하위 집합에 위약을 통해 폐 기능에 있는 개선 [위치 551에에서 글리신 (G)은 aspartic 산 (D)로 대체] missense 돌연변이 (CF 인구의 4 ~ 5%)4,5. 이 구두 약 증가 CFTR 채널을 열고, 따라서 염화 이온 흐름을 증가 하 고 CF4,6의 임상 발현에 지도 기본 결함에 관리. 불행히도, IVA monotherapy [위치 508에서 페닐알라닌 (F)의 손실 귀착되는 CFTR 유전자의 프레임 삭제]에서 더 일반적인 homozygous F508del 돌연변이 함께 환자에서 효과적 이다 misfolded CFTR의 50%에서 볼 수 있는 결과 CF 인구7,8.
최근에, FDA 마약 lumacaftor CFTR 교정기 IVA 결합에 대 한 승인을 부여 했습니다. CFTR 채널 활동, potentiates 변조기 (IVA)와 세포 표면에 F508del-CFTR 구출 CFTR 교정기 (lumacaftor, 루마) 결합의 영리한 전략 효과적으로 CF 인구5 의 대부분 치료 창 확장 . 질문 충돌 보고서의 숫자가 그 캐스트 의심 그들의 임상 효능9,10시 등장으로 이러한 약물 그들의 약속을 이행할 것입니다 여부에 남아 있습니다. 또한, 폐 기능에 향상 했다만 겸손 (2.6-4% ivacaftor lumacaftor 조합) 환자 G551D 돌연변이 (10.6-12.5%)8베어링에 IVA monotherapy 달성 성공에 비해. 잠재적인 대립 약물-약물 상호작용 IVA 및 루마 잠재적으로 ivacaftor lumacaftor 조합의 임상 효능을 제한 하는 이상적 미만 pharmacokinetic 속성7,11에서 왔습니다. IVA은는 활성 대사 산물 hydroxymethyl-IVA (IVA M1, M1)를 비활성 양식 IVA-카복실산 (IVA M6, M6)7,12주로 시 토 크롬 P450 효소 (CYP)에 의해 광범위 하 게 대사 된다. CYP3A4 유도 루마, 다른 한편으로, 광범위 하 게 대사 되지 하 고 크게 배설물11에서 변하지 않게 배설 된다. CYP3A4 inducers 유도 시 토 크롬 물질 대사로 ivacaftor (CYP3A4 기판) 농도 감소 될 수 있었다. 또한, IVA 및 루마는 매우 소수 성 분자 그리고 ~ 99%에 바인딩된 플라스마 단백질을 크게 제한 하는 무료 (활성) 약물 농도1,13.
샨 다, 이러한 요소는 ivacaftor lumacaftor 조합의 임상 효능을 제한 하 함께 올 수 있습니다. Ivacaftor-lumacaftor 조합에 대 한 현재 투여에서 최적의 플라즈마 농도 달성 여부 또는 치료 임계값8유지 됩니다 그것은 알 수 없습니다. 현재, 피크 pharmacokinetic 매개에 관한 정보의 부족 및 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor의 정상 상태 플라스마 농도 있다. Ivacaftor와 lumacaftor의 유명한 대사를 감안할 때, 노출 응답 관계의 모니터링 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 치료에 대 한 최적의 복용량 식이요법을 달성 하기 위해 필수입니다. 우리의 그룹은 최근 IVA 및 루마14노출-반응 관계의 모니터링에 대 한 첫 번째 HPLC/LC-MS 방법 게시. 아니 대체 기술은 ivacaftor, 그것의 대사 산물, 및 lumacaftor의 농도 측정의 날짜에 보고 되었습니다. 우리의 그룹은 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 열 그라데이션 용 매 시스템을 사용 하 여 보고 된 방법 최적화 큰 환자 집단의 높은 처리량 분석을 허용 하 고 극적으로 분석 시간을 단축 하는 비용 및 실행 시간을 감소 시킨다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:480px;">IVA (Cat#S114)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">SelleckChem (USA).&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LUMA (Cat#S1565)&#160;</td>
			<td>SelleckChem (USA).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)&#160;</td>
			<td>Clearsynth (Canada).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)&#160;</td>
			<td>Clearsynth (Canada).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol (MeOH, LC-MS grade),&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile (ACN, LC-MS grade)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formic acid (FA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenomenex Kinetex (2.6 &#181;m C8 100 &#197;; 50 &#215; 2.1mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5430</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">13-mm syringe filter (0.45 &#181;m nylon, GRACE, USA)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 &#181;L, PTFE/Silicone septa].&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized lc-ms/ms method for the high-throughput analysis of clinical samples of ivacaftor, its major metabolites, and lumacaftor in biological fluids of cystic fibrosis patients

결함은 낭 성 섬유 증 횡단 막 전도도 레 귤 레이 터 (CFTR)에 낭 성 섬유 증 (CF), 폐 발현 생명을 위협 하는 질병의 원인입니다. Ivacaftor (IVA)와 ivacaftor-lumacaftor (루마) 조합 활동과 결함이 CFTR 단백질의 밀매를 직접 변조 하는 새로운 획기적인 CF 약 두 있습니다. 그러나, 거기 이다 아직도 pharmacokinetic pharmacodynamic 매개 변수에 대 한 이해의 부족 및 ivacaftor 및 lumacaftor의 약리학 Ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-카복실산, 및 lumacaftor 표준 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 조합 받는 환자에서 생물 학적 체액에서의 농도의 동시 분석을 위한 HPLC MS 기술 치료 이전 되었습니다 우리의 그룹에 의해 개발 및 부분적으로 FDA 표준 유효성 검사. 그러나, 환자 샘플의 많은 수의 높은 처리량 분석을 수 있도록, 우리의 그룹은 최적화 된 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 컬럼을 통해 보고 방법 (2.6 µ m, C8 100 Å; 50 x 2.1 m m)와 그라데이션 용 매 시스템 ( 0-1 분: 40 %B; 1-2 분: 40-70 %B; 2-2.7 분: 70 %B;에서 개최 2.7-2.8 분: 70-90 %B; 2.8-4.0 분: 90 %B 세척; 4.0-4.1 분: 90 40 %B; 4.1-6.0 분: 40 %B 개최) isocratic 차입 대신. 이 연구의 목표는 샘플은 많은 양의 환자 샘플의 분석을 위해 필수적인 당 6 분만에 극적으로 ~ 15 분에서 샘플 당 HPLC MS 분석 시간을 단축 했다. 이러한 획기적인 CF 약물의 노출-반응 관계에 연구에 대 한 상당한 유틸리티 편법 방법이 될 것입니다.

우리는 최근 보고 부분적으로 트리플 4 중 극 LC-MS와 HPLC 검출기 시스템에 FDA 기준에 따라 유효성을 검사 하는 방법 (과 물에 100 %ACN 0.1% 포 름 산으로 구성 된 모바일 단계와 C8 열 (5 µ m, 3.9 m m x 50 m m 아이디)를 사용 하 여 v/v) 1 mL/min의 유량에서. 봉우리의 선형 상관 관계는 모든 대사 산물, ivacaftor, Iva M1, Iva-M6, 및 lumacaftor14에 대 한 인간의 플라즈마에 0.01에서 10 µ g/mL의 농도 범위 관찰 되었다. 이 방법은 여기 최적화 된 극적으로 있도록 LC 보존 시간과, 따라서 많은 양의 임상 샘플의 높은 처리량 분석을 위해 필수적인 분석 결과의 완전 한 실행 시간 감소. 분석 결과 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 열만 6 분 ~ 15 분에서 샘플 당 시간을 단축 하는 isocratic 차입 대신 그라데이션 용 매 시스템을 사용 하 여 최적화 되었다. Analytes는 여러 반응 감시 (MRM)를 사용 하 여 분무 긍정적인 모드에서 결정 된다. 절차 확인 되어야 합니다-집 사용 전에 우리가 이전14세부로.
방법의 정확도 분석14따라 94.2% ± 4.53%에서 97.5% ± 2.94%, 이었다. 0.01에서 10 µ g/mL의 보정 범위는 임상 설정에서 사용 하기 위해 적용 특히 주어진 ivacaftor lumacaftor 치료에서 활성 IVA 및 m 1의 매우 낮은 농도에서 보고 되었다 우리의 그룹에 의해 이전에 플라즈마로 인해 잠재적으로 루마, 광범위 한 IVA 대사14에 결과 의해 CYP3A4의 감 응 작용. 각 분석의 하루 정확도 0.05, 0.5, 및 8 µ g/mL의 농도에서 같은 날에 6 개의 독립적으로 준비 된 품질 관리 (QC) 샘플 평가 했다. 간 날 정확도 3 일에 6 개의 독립적으로 준비 된 QC 샘플 평가 했다. 정확성과 정밀 상대 표준 편차 (RSD)를 통해 계산 했다. 각 QC 샘플에 대 한 RSD 값 15% 미만 이어야 한다15. 모든 4 개의 analytes 보여주었다 RSD 값 15%의14. (LOD)를 검출 및 정량화 (LOQ)의 하한값 설정: x 10-3 µ g/mL와 10-3 µ g/mL; x LOQ 7.57 IVA LOD 2.50에 대 한 M1, LOD 4.57 x 10-4 µ g/mL와 µ g/mL; LOQ 1.38 x 10-3 에 대 한 m 6에 대 한 LOD 5.86 × 10-4 µ g/mL와 µ g/mL; LOQ 1.78 x 10-3 루마 LOD에 대 한 되었고 10-4 µ g/mL x 6.08 LOQ 1.84 x 10-3 µ g/mL14. 전형적인 크로마는 그림 1에 표시 됩니다. 최적화 된 크로마 해상도 100 %ACN 0.1% 개미 산 성 물에서의 모바일 단계를 사용 하 여 얻은 (시작 지점에서과, v/v) C8 열에 그라데이션 차입으로 (2.6 µ m; 100 Å; 50 m m x 2.1 m m). 그라데이션 분리 모바일 1 분; 0에서 단계 B의 40% 사용 되었다 다음 모바일의 40%-70% 단계 B 1 분에서 2 분; 2.7 분; 2 분에서 모바일 단계 B의 70% 2.7 분에서 모바일 단계 B의 2.8 분;에 90%에서 70% 증가 모바일 B 2.8 분에서 4.0 분을 위한 단계 세척 목적;의 90% 마지막으로 90%에서 4.0 분에서 모바일 B의 4.1 분;에 40%를 반환 다음 모바일 단계 B 4.1 분에서 6.0 분 초기 조건 (그림 1)의 40%를 들고. LC 보존 회 되었다 같이 M6 1.0 분;에 대 한 M1 1.3 분; 대 한 IVA: 1.55 분; 루마에 대 한: 2.3 분 (그림 1). 모든 빈 플라즈마 샘플에는 analytes의 보존 시간 방해 없음, 관찰도 간섭 lumacaftor와 ivacaftor의 조합에서 발견 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56084/56084fig1.jpg"> 
그림 1 : 인간 플라스마 IVA M6, IVA M1, lumacaftor, 및 펌프의 그라데이션 차입에 관하여 ivacaftor의 10 µ g/mL와 함께 아군의 대표 LC-MS 크로마. 물과 펌프 B 100% 이기에 0.1% 개미 산 (0-1 분: 40 %B, 1-2 분: 40%-70 %B; 2-2.7 분: B, 2.7-2.8 분: 70%-90 %B, 3.8-4.0 분: 90 %B 세척; 70%에서 개최 4.0-4.1 분: 90%-40 %B; 4.1-6.0 분: 40 %B 개최). MS/MS에 대 한 m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423, m/z 452.40 → 453의 이온 전환 사용 되었다 ivacaftor, IVA-M1, IVA m 6와 lumacaftor, 각각 모니터링. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56084/56084fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">HPLC 조건</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>열</td>
			<td>C8; 2.6 µ m; 100 Å; 50 x 2.1 m m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">가드 열</td>
			<td>HPLC에서 라인 필터 0.5 µ m; 0.004 inID x 깊이 필터</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.004 inID x 필터</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>열 온도:</td>
			<td>30 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>모바일 단계 a:</td>
			<td>0.1% 물에 빠</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>모바일 단계 b:</td>
			<td>100% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>시작 지점에서 모바일 단계 구성</td>
			<td>60 / 40 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>샘플 온도:</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사출 볼륨:</td>
			<td>5 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>바늘 워시</td>
			<td>80% 메탄올, 20% 물 300 µ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>유량:</td>
			<td>0.5 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="7">그라데이션:</td>
			<td>-1 분: 40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1-2 분: 40%-70 %B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2-2.7 분: 70 %B 개최</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2.7-2.8 분: 70%-90 %B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2.8-4.0 분: 90 %B 세척</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4.0-4.1 분: 90%-40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4.1-6.0 분: 40%에서 개최</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>총 실행:</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">보존 회:</td>
			<td>M 6에 대 한 보존 기간: 1.0 분</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M 1에 대 한 보존 시간: 1.3 분</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVA에 대 한 보존 시간: 1.55 분</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>루마에 대 한 보존 시간: 2.3 분</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">MS 조건</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>감지 모드:</td>
			<td>분무 긍정적인 ESI +</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>이온 스프레이 전압:</td>
			<td>4.5 kV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>충돌 에너지:</td>
			<td>295.9 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nebulizing 가스 (질소):</td>
			<td>3 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CID 가스:</td>
			<td>230 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>건조 가스 (질소) 흐름:</td>
			<td>20 L/분</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 분기 사전 로드 바이어스:</td>
			<td>-& #1</td></tr></tbody></table>60.      5 V
		
		<tr>
			<td>CE:</td>
			<td>-25 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q3 사전 로드 바이어스:</td>
			<td>-5 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>현재 인터페이스:</td>
			<td>0.1 UA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desolvation 온도:</td>
			<td>250 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>열 블록 온도:</td>
			<td>400 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVA m/z</td>
			<td>392.49 → 393</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M 1 m/z</td>
			<td>408.49 → 409</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 m/z</td>
			<td>422.47 → 423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>루마 m/z</td>
			<td>452.40 → 453</td>
		</tr>
	

표 1: HPLC MS 조건의 세부 사항.

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Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Ivacaftor와 ivacaftor-lumacaftor는 두 개의 새로운 CF 약물. 그러나, 여전히 그들의 PK/PD 및 약리학에 대 한 이해의 부족이입니다. 우리는 주요 대사 산물, ivacaftor 및 lumacaftor의 동시 분석에 대 한 최적화 된 HPLC MS 기법 제시.

Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.2K 조회수.  Monash University. Ivacaftor와 ivacaftor-lumacaftor는 두 개의 새로운 CF 약물. 그러나, 여전히 그들의 PK/PD 및 약리학에 대 한 이해의 부족이입니다. 우리는 주요 대사 산물, ivacaftor 및 lumacaftor의 동시 분석에 대 한 최적화 된 HPLC MS 기법 제시.

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Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

연구

의학

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control seizures. However, a significant minority of patients continues to exhibit post-operative seizures, even in those cases in which the suspected source of seizures has been correctly localized and resected. The protocol presented here combines a clinical procedure routinely employed during the pre-operative evaluation of temporal lobe epilepsy (TLE) patients with a novel technique for network analysis. The method allows for the evaluation of the temporal evolution of mesial network parameters. The bilateral insertion of foramen ovale electrodes (FOE) into the ambient cistern simultaneously records electrocortical activity at several mesial areas in the temporal lobe. Furthermore, network methodology applied to the recorded time series tracks the temporal evolution of the mesial networks both interictally and during the seizures. In this way, the presented protocol offers a unique way to visualize and quantify measures that considers the relationships between several mesial areas instead of a single area.

This protocol describes a procedure to track the evolution of mesial network measures in temporal lobe epilepsy (TLE) patients. It is based on the combination of intracranial recordings with a novel numerical technique for data analysis. Specifically, we present a protocol for network analyses of foramen ovale recordings.

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

의 최적화 분석<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 간 지방증

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

샘플링 전략 및 돼지 생물 의학 모델에서 Biobank 조직 샘플의 처리

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Collecting Hair Samples for Hair Cortisol Analysis in African Americans

The hormone cortisol is typically assessed in saliva, serum, or urine samples. More recently, cortisol has been successfully extracted from hair, including humans. The advantage of hair cortisol concentration is that it reflects a retrospective representation of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis function over time, much like hemoglobin A1C represents glycemic control. However, obtaining hair samples can be challenging, due to the cultural beliefs and hair care practices of minority participants. For example, African Americans may be reluctant to provide samples. Additionally, few researchers are trained to collect hair samples from African Americans. The purpose of this paper is to present a culturally informed protocol to help researchers obtain hair samples from African Americans. To illustrate the representative results of this protocol implementation, de-identified data from African Americans that participated in a community-based study on chronic stress are provided. Hair practice preferences are assessed. The participants are made comfortable by showing pictures of hair samples prior to cutting their hair. The single strain twist and gently pull method is used to collect approximately 30 - 50 strands of hair from the posterior vertex region of the scalp. This protocol will significantly improve collection of hair samples from African Americans.

Hair cortisol concentration analysis provides an alternative to traditional measures of cortisol; however, to collect hair samples from African Americans, scientists need to be culturally informed and competent. The purpose of this protocol is to demonstrate a culturally informed technique to collect hair samples for cortisol analysis from African Americans.

The hormone cortisol is typically assessed in saliva, serum, or urine samples. More recently, cortisol has been successfully extracted from hair, ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

ElectroMap을 사용한 광학 매핑 데이터의 높은 처리량 분석

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

마우스에서 간세포 핵 Ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 LC-MS/MS 패널 검증

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. Microbes have traditionally been classified based on their ability to use or tolerate oxygen. Supplemental oxygen is a common medical therapy administered to people with cystic fibrosis (pwCF); however, existing studies on oxygen and the airway microbiome have focused on how hypoxia (low oxygen) rather than hyperoxia (high oxygen) affects the predominantly aerobic and facultative anaerobic lung microbial communities. To address this critical knowledge gap, this protocol was developed using an artificial sputum medium that mimics the composition of sputum from pwCF. The use of filter sterilization, which yields a transparent medium, allows optical methods to follow the growth of single-celled microbes in suspension cultures. To create hyperoxic conditions, this model system takes advantage of established anaerobic culturing techniques to study hyperoxic conditions; instead of removing oxygen, oxygen is added to cultures by daily sparging of serum bottles with a mixture of compressed oxygen and air. Sputum from 50 pwCF underwent daily sparging for a 72-h period to verify the ability of this model to maintain differential oxygen conditions. Shotgun metagenomic sequencing was performed on cultured and uncultured sputum samples from 11 pwCF to verify the ability of this medium to support the growth of commensal and pathogenic microbes commonly found in cystic fibrosis sputum. Growth curves were obtained from 112 isolates obtained from pwCF to verify the ability of this artificial sputum medium to support the growth of common cystic fibrosis pathogens. We find that this model can culture a wide variety of pathogens and commensals in CF sputum, recovers a community highly similar to uncultured sputum under normoxic conditions, and creates different culture phenotypes under varying oxygen conditions. This new approach might lead to a better understanding of unanticipated effects induced by the use of oxygen in pwCF on airway microbial communities and common respiratory pathogens.

The goal of this protocol is to develop a model system for the effect of hyperoxia on cystic fibrosis airway microbial communities. Artificial sputum medium emulates the composition of sputum, and hyperoxic culture conditions model the effects of supplemental oxygen on lung microbial communities.

낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과를 연구하는 모델의 설계 및 개발

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...