J.L. T.V. נתמכים על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של מכוני הבריאות הלאומיים (R01 AI111965). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של המכון הלאומי של האלרגיה, מחלות זיהומיות או מכוני הבריאות הלאומיים. MC הוא NHMRC האוסטרלי חוקר בכיר. ג' ל' הוא אוסטרלי הלאומי לבריאות ו המועצה למחקר רפואי (NHMRC) עמית מחקר, בטלויזיה האוסטרלי NHMRC התעשייה הקריירה פיתוח ברמה 2 עמית מחקר. E.K.S 2017 השגריר הצעיר שנקבע עבור ASM (החברה האמריקאית למיקרוביולוגיה) והיא נתמכת על ידי כל הפרס לתארים מתקדמים אוסטרלי. חלקים של עבודה זו הוצג ב 12תאנון Australiasian כנס סיסטיק פיברוזיס ב מלבורן (5-8ה של אוגוסט 2017).

אישור לאתיקה הושג מ מונש אוניברסיטת האנושי מחקר אתיקה הוועדה (MUHREC).
 1. יישום של וזמינותו: החולה מדגם אוסף <ol><li>לרשום את הזמן כאשר המטופל לוקח מינון רגיל שלהם של 150 מ"ג ivacaftor או ivacaftor 125 מ"ג /lumacaftor 200 מ ג.</li>
	<li>הערה למטה בדיוק הזמן כאשר נאסף את דגימת הדם המטופל. 
	הערה: מומלץ איסוף דגימות 4-5 במהלך הזמן מספר 24 שעות ביממה. אם האוסף של מדגם אחד בלבד אפשרי, נקודת הזמן המצוין הוא 2.5-4 h פוסט ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor שילוב מינון כמו C מקס ריכוזים-מצב יציב יהיה בר השגה לאחר &#62; 5 ימים של טיפול רציף.</li>
	<li>לאסוף 4-5 מ של דם זמינים מסחרית צינורות כחול לא מטופל.</li>
	<li>לאחר אוסף של כל הדם, לאפשר את הדם להיקרש על ידי השארת אותו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר. 
	הערה: זה בדרך כלל לוקח 15-30 דק...</li>
	<li>להסיר קריש הדם על ידי צריך שתוציאו ב 1,000-2,000 g x 10 דקות ב 4 ° C ומפרידה בקירור. תייעד את תגובת שיקוע וכתוצאה מכך פלזמה.</li>
	<li>בעקבות צנטריפוגה, להעביר מיד את תגובת שיקוע (פלזמה) לתוך צינור פוליפרופילן נקי באמצעות פיפטה של פסטר. תווית הפלזמה צינור עם החולה מזהה (למשל, החולה 1), התרופה מנוהל (למשל, שילוב ivacaftor-lumacaftor) ולאחר זמן הדגימה החולה היה שנאספו (למשל, המינון שלאחר 2.5 h).</li>
	<li>שמור על דגימות ב 2-8 ° C במהלך הטיפול. עם סיום הטיפול, לאחסן דגימות-&#8211; 20 מעלות צלזיוס</li>
	<li>במידת הצורך, למשלוח דגימות עם שליח שאושרו למכון וניתוח. 
	הערה: כדי להישלח על קרח יבש עד ההגעה ודוגמאות יש לשמור על &#8211; 80° C עד ניתוח.</li>
</ol> 2. הכנה, עיבוד של דגימות שנצברו ותקנים הערה: פלזמה של תמים בריא תורמים לטיפול ivacaftor/lumacaftor היה מתקבל מן הצלב האדום אוסטרלי. כדי להבטיח את התקינות, יש לשמור כל דגימות/תקנים של 2-8 ° C במהלך איסוף ועיבוד. עם סיום הטיפול, לאחסן דגימות-&#8211; 20 מעלות צלזיוס
<ol><li>שוקל לצאת IVA, IVA-carboxylate, hydroxymethyl-IVA, LUMA, אשר ישמש כנקודת התייחסות הסטנדרטים פנימי.</li>
	<li>להכין שני פתרונות מניות עצמאית של כל analyte (IVA, M1, M6, LUMA) ב- LC-MS כיתה מתנול µg 100/mL וכן ב 10 µg/mL. 
	הערה: תרכובות יפוג לאחר 10 ימים ב- benchtop.</li>
	<li>טריים להכין LC-MS סטנדרטים כיול לפני כל הפעלה אנליטי על ידי דילול של הסטנדרטים כיול פתרונות מניות לתוך לפלסמה אנושית כדי להשיג בעקבות ריכוזים: 0.01 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 µg/mL. דגימות אלה נקראות תקנים.</li>
	<li>כדי לזרז חלבונים, הכנת 0.1% חומצה פורמית (FA) acetonitrile (לחצן מצוקה, LC-MS כיתה) ולהשאיר במקרר עד הצורך.</li>
</ol> 3. טיפול קדם של דגימות שנצברו ותקנים <ol><li>לאפשר בשתי דגימות פלסמה החולה, ריק כדי equilibrate לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מערבולת לערבב כל מדגם פלזמה 15 לשנייה בכל דגימה.</li>
	<li>העברה של aliquot 100 µL או פלזמה ריק עבור תקנים או דגימות החולה לניתוח לתוך צינור microcentrifuge פוליפרופילן 1.5-mL-</li>
	<li>להוסיף את IVA תקן פנימי לתוך כל הצינורות רגיל (למשל 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 ו- µg/mL 10.0 כדי לכסות את טווח הריכוז פוטנציאליים), לסגור את המכסה, מערבולת 2-3 ס' תו תקן פנימי זה הוא רק נוספו פלזמה ריק אין תקן פנימי יתווסף הדגימות החולה.</li>
	<li>חזור על שלב 3.4. עבור פנימי תקנים נוספים M1, M6, LUMA.</li>
	<li>ספין למטה כל שפופרת לזמן קצר כדי להבטיח שאין שום טיפות על המכסה.</li>
	<li>µL להוסיף 200 של המיקס של 0.1% פא בלחצן מצוקה לתוך כל שפופרת, כדי לזרז פלזמה חלבונים.</li>
	<li>מערבולת התערובת נמרצות על כ-15 ס</li>
	<li>לאפשר צינורות לעמוד 10 דקות במקרר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 10,000 ג'י 10 דקות ב 4 ° C, במידת האפשר.</li>
	<li>סינון של aliquot 200 µL של תגובת שיקוע דרך מסנן מזרק 13 מ מ לתוך בקבוקון HPLC 1.5 mL-</li>
	<li>µL 100 העברה של תגובת שיקוע לתוך הבקבוקון LC-MS לניתוח HPLC-MS-</li>
</ol> 4. ניתוח HPLC-MS הערה: HPLC-MS ניתוח בוצע במערכת LC-MS בשילוב עם ספקטרומטר מסה פאול טריפל (טבלה 1).
<ol><li>להפוך במערכת LC-MS, מניחים את המגש עם הדגימות האוטומטי-סמפלר.</li>
	<li>לצרף את העמודה לעמודת משמר, להתחבר למערכת LC-MS-</li>
	<li>לצרף שני בקבוקים של שלבים ניידים (בקבוק ת 100% לחצן מצוקה; בקבוק ב': 0.1% חומצה פורמית במים), equilibrate את המערכת LC-MS.</li>
	<li>לשלב את הפרמטרים הבאים פרוטוקול LC-MS-
	<ol><li>לפצל את זרימת שלב נייד לפני הכניסה את ספקטרומטר מסה על יחס של 2:1 (פסולת: כניסת MS).</li>
		<li>לבצע • תנאי הדרגתיות בקצב הזרימה של 0.5 mL/min משתמש שלב ניידים בהיקף של 100% לחצן מצוקה ו- 0.1% חומצה פורמית במים (40:60, נקודת ההתחלה וי/v). שימו לב: האחוזים נפח של השלב ניידים שינויים לאורך כל ניתוח.</li>
		<li>להפעיל את ספקטרומטר מסה במצב יינון חיובי ספקטרומטריית electrospray.</li>
		<li>ודא שההגדרות LC-MS הן כדלקמן: יון ספריי מתח 4.5 kV, אנרגיית התנגשות 295.9 וי, nebulizing גז: חנקן ב 3 L/דקה; גז התנגשות: ארגון; ייבוש גז לזרום 20 L/min, עדשה מתח Q3:-22 V, טמפרטורה desolvation 250 ° C עם גוש חום הטמפרטורה של 400 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>10 להזריק µL אמצעי האחסון עבור דגימה.</li>
		<li>Analytes זיהוי באמצעות התגובה מרובים ניטור (MRM). לפקח על מעברים יון של m/z 392.49 &#8594; 393, מ/z 408.49 &#8594; 409, מ/z 422.47 &#8594; 423 ו- m/z 452.40 &#8594; 453 IVA, IVA-M1, IVA-M6, LUMA, בהתאמה. 
		הערה: שיטת אופטימיזציה החדש טרם לאימות באופן מלא לפי תקני ה-FDA-</li>
	</ol></li></ol> 5. עקומות כיול <ol><li>לבנות LC-MS עקומות כיול לפני כל הפעלה אנליטי באמצעות הקשר בין את היחס באזור השיא של כל אחד analytes ארבע כדי תקן פנימי את כיול סטנדרטי הנומינלי ריכוזי ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 או LUMA) בתוך התוכנית הגדרות LC-MS- 
	הערה: השלבים המדויקים לבנייה של עקומת כיול זה תלוי בדגם LC-MS הציוד בשימוש. מידע זה עשוי להיות זמין במדריך ציוד.</li>
	<li>לבצע ניתוח רגרסיה-שיטת הריבועים הפחותים על-ידי שקלול 1/C 2 לפי הדדיים של ריכוזים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor.">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li><li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).</li><li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis.">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li><li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation.">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide+(VX-770,+ivacaftor),+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator.">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li><li>FDA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee. 98 , (2015).</li><li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers?.">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+gating+potentiators,+including+VX-770,+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression.">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).</li><li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis.">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).</li><li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).</li><li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertex prescribing infomation. , (2015).</li><li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+(ivacaftor).">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+HPLC+and+LC-MS/MS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor,+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO.">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li><li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+LC-MS/MS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma:+application+to+a+pharmacokinetic+study.">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כפי שדווח בעבר, הקבוצה שלנו יש בפעם הראשונה שפותחה ואומת שיטה HPLC ו- LC-MS מהירה זיהוי, כימות של ivacaftor מטבוליטים הגדולות שלו hydroxymethyl-IVA M1 (פעיל) ו- M6 IVA-carboxylate (לא פעיל); lumacaftor פלזמה, ברוק של חולי CF14. וזמינותו שדווחו על-ידי הקבוצה שלנו בעבר שימש בהצלחה כדי לכמת את ריכוז LUMA, IVA, IVA-M1 ו- IVA-M6 ב פלזמה, ברוק של CF חולים שעברו טיפול סטנדרטי מצב יציב עם IVA 150 מ"ג /q12 h (המינוח הלטיני: quaque 12 שעות; פעם כל 12 שעות) או 200 מ ג /q12 h LUMA-125 מ ג /q12 h IVA שילוב14. לניתוח תפוקה גבוהה של כמויות גדולות של דגימות החולה, לנו יש אופטימיזציה בשיטת דיווח על-ידי שימוש קטן נקבובית גודל הפוכה-פאזי כרומטוגרפיה עמודה C8 (מיקרומטר 2.6; 100; 50 x 2.1 מ מ2) ומערכת צבע הממס במקום הנוכחי • תנאי איזוקראטית. זה מפחית את הזמן רץ עד 6 דקות לכל דגימה.
שיטה זו הרומן ואמין מציעה גישה מהירה, פשוטה ונוגעת לפיקוח סמים טיפולית של שילוב ivacaftor ו- ivacaftor-lumacaftor של נוזלים ביולוגיים. בהתחשב בצורך לפתח מערכות יחסים חשיפה-תגובה כדי למקסם את יעילות התרופה, כמו גם מכילים הבריאות עולה, כלי רגיש יותר צריך להיות שפותחה ואומת על מנת לסייע קלינאים באמצעות טיפולים המבוססות על ראיות של תפוקה גבוהה שיטות אנליטיות עבור חולים הסובלים CF. הקבוצה שלנו דיווח בעבר עם HPLC-MS חלקית המאומת לניתוח בו זמנית IVA, IVA-M1, IVA-M6 ו LUMA פלזמה, ברוק של חולי CF14. הקמת פרוטוקול נפוץ, קל לשימוש אנליטי לניתוח של חולים שקיבלו שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor להקל על נתוני ההשוואה ופרשנות של תוצאות של מחקרים פרמוקוקינטיים עתידיים. מדידה IVA, IVA-M1, IVA-M6 ו LUMA ב נוזלים ביולוגיים בטכניקות LC-MS יכול לגלם כלי רב עוצמה עבור חקר את היחסים חשיפה-תגובה ביחס לתוצאות טיפוליות.
באופן כללי יותר, HPLC-MS ניתוח של שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor של נוזלים ביולוגיים עשוי לספק בסיס מולקולרי לביצוע ויישום אסטרטגיות pharmacotherapeutic בפעוט עם חולים הסובלים CF ואני יכול להוכיח שימושי בעילה עושה את טיפול משולב יקר של ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor עלות יותר אפקטיבי, על ידי פוטנציאל המציין את הצורך מינון בתדירות נמוכה יותר. על-ידי החלת השיטה האנליטית המוצעת מחקרים קליניים פרמוקוקינטיים/pharmacodynamic, ההזדמנות צצה לה להמשיך לחקור את הפרמטרים פרמוקוקינטיים של שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor על מטופל גדול יותר קולקטיבית.

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה גנטית נפוצה מעורבים בלוטות הריר אקסוקרינית של הריאות, הכבד, הלבלב, המעי גורם לכשל איברים רב פרוגרסיבי, כגון ירידה תפקוד הריאות, הלבלב אי ספיקה1, 2,3. Ivacaftor (IVA) הראשון המזון והתרופות (FDA-ארה ב), סוכנות התרופות האירופית (EMA) אישרה סיסטיק פיברוזיס הטרנס-הממברנה מוליכות הרגולטור (CFTR) potentiator סמים, עם יעילות קלינית evidenced ייצור משמעותי שיפור בתפקודי הריאה מעל פלצבו תת קבוצה קטנה של חולי סיסטיק פיברוזיס הנושאת את G551D-CFTR [גליצין (G) בעמדה 551 מוחלף על ידי חומצה אספרטית (D)] missense מוטציה (~ 4-5% מהאוכלוסייה CF)4,5. זה בעל-פה מנוהל סמים מגביר את הערוץ CFTR פתיחה, ובכך מגדילים את זרם יון כלוריד של משחק את הפגם העיקרי שמוביל המאפיינים הקליניים של CF4,6. למרבה הצער, IVA יחידני אינו יעיל בחולים עם המוטציה נפוץ יותר F508del homozygous [במחיקת מסגרת הגן CFTR אשר גורמת לאובדן של פנילאלנין (נ) במיקום 508] שתוצאתה misfolded CFTR, אשר נראה ב ~ 50% CF האוכלוסייה7,8.
לאחרונה, ה-FDA העניק אישור עבור שילוב IVA עם מתקן CFTR סמים lumacaftor. האסטרטגיה המתוחכם של שילוב של מתקן CFTR (lumacaftor, LUMA) אשר מצילה F508del-CFTR השטח תא עם אפנן (IVA) אשר potentiates CFTR ערוץ פעילות, ביעילות מרחיבה את החלון הטיפול רוב האוכלוסייה CF5 . שאלות נותרו על תרופות אלו ימלא את ההבטחה שלהם כפי הופיעו מספר דיווחים סותרים הספק יצוק על היעילות הקלינית שלהם,9,10. בנוסף, שיפור תפקוד הריאות היו צנועים (2.6-4% בלבד עבור שילוב ivacaftor-lumacaftor) לעומת ההצלחה מושגת עם יחידני IVA אצל חולים הנושאת מוטציה (10.6-12.5%) G551D8. אינטראקציות-תרופתיים אויבת פוטנציאלית בין IVA וכי LUMA העלול להגביל את היעילות הקלינית של שילוב ivacaftor-lumacaftor באים שלה פחות אידיאלי של המאפיינים פרמוקוקינטיים7,11. IVA עובר מטבוליזם בהרחבה על ידי ציטוכרום P450 אנזימים (CYP), בעיקר כדי של המטבוליט הפעיל hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) וטופס לא פעיל IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)7,12. משרן CYP3A4 LUMA, מצד שני, היא לא בהרחבה חילוף חומרים, מופרש בעיקר לא השתנה בתוך צואה11. כפי CYP3A4 inducers זירוז חילוף החומרים ציטוכרום, ריכוזי ivacaftor (CYP3A4 המצע) יכול להיות מופחת. יתר על כן, IVA והן LUMA מולקולות הידרופוביות מאוד, ~ 99% מאוגדים פלזמה חלבונים, אשר באופן משמעותי מגביל את ריכוז סמים (פעילים) חינם1,13.
באופן קולקטיבי, גורמים אלה אולי יבוא יחד כדי להגביל את היעילות הקלינית של שילוב ivacaftor-lumacaftor. לא ידוע אם ריכוזים מיטביים פלזמה מושגות תחת משטר המינון הנוכחי עבור שילוב ivacaftor-lumacaftor או אם הסף הטיפולי נשמר8. תוך זמן קצר, יש במחסור של מידע לגבי פרמוקוקינטיים פרמטרים כגון הפסגה וריכוזי הפלסמה מצב יציב של ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor. בהינתן החומרים ראוה של ivacaftor ו- lumacaftor, פיקוח על מערכות יחסים חשיפה-תגובה הוא נחוץ כדי להשיג משטרי המינון האופטימלי לטיפול ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor. הקבוצה שלנו לאחרונה לאור השיטה HPLC/LC-MS הראשונה עבור בקרה של מערכות יחסים חשיפה-תגובה של IVA, LUMA14. אין טכניקות חלופיות של מדידת ריכוז ivacaftor שלה מטבוליטים, lumacaftor דווחו עד היום. כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של קולקטיב המטופל גדול יותר, כדי להפחית באופן משמעותי את זמן הניתוח, הקבוצה שלנו כולל אופטימיזציה שיטת דיווח באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל ומערכת ממיס צבע זה מפחית את עלות ושעות פועל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:480px;">IVA (Cat#S114)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">SelleckChem (USA).&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LUMA (Cat#S1565)&#160;</td>
			<td>SelleckChem (USA).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)&#160;</td>
			<td>Clearsynth (Canada).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)&#160;</td>
			<td>Clearsynth (Canada).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol (MeOH, LC-MS grade),&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile (ACN, LC-MS grade)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formic acid (FA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenomenex Kinetex (2.6 &#181;m C8 100 &#197;; 50 &#215; 2.1mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5430</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">13-mm syringe filter (0.45 &#181;m nylon, GRACE, USA)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 &#181;L, PTFE/Silicone septa].&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized lc-ms/ms method for the high-throughput analysis of clinical samples of ivacaftor, its major metabolites, and lumacaftor in biological fluids of cystic fibrosis patients

פגמים המתקן מוליכות הטרנס-הממברנה סיסטיק פיברוזיס (CFTR) הן הגורם סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה עם סכנת חיים ביטויים ריאתי. Ivacaftor (IVA) ivacaftor-lumacaftor (LUMA) שילוב שתי תרופות פריצת דרך CF חדש ישירות לווסת את הפעילות וסחר של החלבון-CFTR פגומים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. עם זאת, יש עדיין מחסור של הבנה על פרמטרים פרמוקוקינטיים/pharmacodynamic פרמקולוגיה של ivacaftor ושל lumacaftor. הטכניקה HPLC-MS לניתוח בו זמנית של הריכוזים של ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate ו- lumacaftor של נוזלים ביולוגיים בחולים שקיבלו תקן שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor טיפול כבר בעבר שפותחה על ידי הקבוצה שלנו ואומת חלקית בתקני ה-FDA. עם זאת, כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של מספר גדול יותר של דוגמאות החולה, הקבוצה שלנו יש אופטימיזציה שיטת דיווח באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל (2.6 מיקרומטר, C8 100; 50 x 2.1 מ"מ) ו (מערכת ממיס צבע של 0-1 דקות: 40% ב'; 1-2 דקות: 40-70% ב'; מינימום 2-2.7: שנערך ב-70% ב'; 2.7-2.8 מין: 70-90% ב'; 2.8-min 4.0: 90% B כביסה; 4.0-4.1 מין: 90-40% ב'; 4.1-6.0 מין: שנערך ב- 40% B) במקום • תנאי איזוקראטית. מטרת מחקר זה הייתה כדי לצמצם את הזמן ניתוח HPLC-MS עבור דגימה באופן דרמטי מ ~ 15 דקות רק 6 דקות לכל דגימה, אשר חיוני לניתוח של כמות גדולה של דגימות החולה. שיטה זו מועיל יהיה של השירות ניכר ללימודים למערכות יחסים חשיפה-תגובה של תרופות אלו CF פריצת דרך.

לאחרונה דיווחנו שיטה, לאמת חלקית בתקני ה-FDA, טריפל-פאול LC-MS, מערכת גלאי HPLC, משתמש בעמודה C8 (5 מיקרומטר, זיהוי 3.9 מ"מ x 50 מ"מ) עם השלב ניידים בהיקף של 100% לחצן מצוקה ו- 0.1% חומצה פורמית במים (40:60 וי/v) בספיקה של 1 מ"ל לדקה. מתאם ליניארי של הפסגות נצפתה מעל טווח הריכוז מ 0.01 µg 10/mL בפלסמה אנושית עבור כל מטבוליטים, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 ו lumacaftor14. הנה שיטה זו מוטבה כדי לאפשר באופן דרמטי מופחתת LC השמירה פעמים ו, לכן, מהזמן וזמינותו, אשר חיוני לניתוח תפוקה גבוהה של כמות גדולה של דגימות קלינית מלאה. וזמינותו אופטימלי באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל ומערכת הממס הדרגתיות במקום • תנאי איזוקראטית, צמצום הזמן עבור דגימה מן ~ 15 דקות רק 6 דקות. Analytes נקבעים במצב חיובי ספקטרומטריית electrospray באמצעות התגובה מרובים ניטור (MRM). ההליך לאמת בחברה לפני השימוש, כפי שתוארו קודם לכן14.
הדיוק של שיטת היה 94.2% ± ± 4.53 97.5% 2.94%, בהתאם analyte14. טווח כיול מ 0.01 µg 10/mL ישימה עבור שימוש בהגדרה קלינית, בפרט בהתחשב בכך תחת טיפול ivacaftor-lumacaftor, ריכוז נמוך מאוד של IVA ו- M1 active דווחו על ידי הקבוצה שלנו בעבר, בפלסמה פוטנציאל תופיפצה אינדוקציה של CYP3A4 מאת LUMA, אשר התוצאות IVA נרחב חילוף החומרים14. הדיוק היומיות של כל analyte נאמד עם ששת המדגמים מוכן באופן עצמאי בקרת איכות (QC) באותו יום בריכוזים של 0.05, 0.5 ו- 8 µg/mL. הדיוק יום אינטר הוערכה עם ששת המדגמים QC מוכן באופן עצמאי על שלושה ימים רצופים. דיוק ונכונות חושבו באמצעות סטיית תקן יחסית (RSD). עבור כל דגימה QC, הערכים RSD צריכים להיות פחות מ 15%15. כל analytes ארבעה הראו ערכי RSD של פחות מ- 15%14. הגבול התחתון של זיהוי (לוד), כמת (LOQ) הוקמו: עבור IVA 2.50 לוד-10-3 µg/mL ו- 7.57 LOQ x µg-3 10/mL; עבור M1, לוד 4.57 x 10-4 µg/mL... ו- 10-3 LOQ x 1.38 אינץ µg/mL; עבור M6 לוד 5.86 x 10-4 µg/mL ו- 10-3 LOQ 1.78 x µg/mL; LUMA לעיר לוד היה 6.08 x 10-4 µg/mL LOQ 1.84 x 10-3 µg/mL14. Chromatogram טיפוסי מוצג באיור1. כרומטוגרפי של פתרון אופטימיזציה הושג באמצעות שלב ניידות 100% לחצן מצוקה ו- 0.1% חומצה פורמית במים (40:60, נקודת ההתחלה וי/v) עם • תנאי מעבר הצבע על עמודה C8 (מיקרומטר 2.6; 100; 50 מ"מ x 2.1 מ"מ). ההפרדה הדרגתיות שימש עם 40% ניידות שלב B 0 1 דקות; ואז 40% - 70% של הנייד שלב B מ 1 דקה עד 2 דקות; מחזיק 70% ניידים שלב B מ 2 דקות דקות 2.7; גדל מ- 70% ל 90% ניידים שלב ב' של מין 2.7 2.8 מינימום; מחזיק 90% ניידים שלב ב' מ- 2.8 דקות מינימום 4.0 לכביסת למטרות; סוף סוף חוזר מ- 90% ל-40% מ- B ניידים מכל מין 4.0 4.1 מינימום; ואז מחזיקה 40% ניידות שלב ב' מ 4.1 דקות מינימום 6.0 תנאים הראשונית (איור 1). LC השמירה הפעמים היו כדלקמן M6 1.0 דקות; M1 1.3 דקות; עבור IVA: 1.55 דקות; עבור LUMA: 2.3 min (איור 1). בדגימות הפלסמה ריק כל, ללא הפרעה עם הזמן שמירה של כל אחד analytes נצפתה, וגם לא זוהתה הפרעה משילוב של ivacaftor עם lumacaftor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56084/56084fig1.jpg"> 
איור 1 : נציג LC-MS chromatogram לפלסמה אנושית עם 10 µg/mL של IVA-M6, IVA-M1, lumacaftor ו- ivacaftor ביחס • תנאי מעבר של משאבת. חומצה פורמית 0.1% ב- acetonitrile 100% מים, משאבות B (0-1 דקות: 40% B; 1-2 דקות: 40%-70% B; 2-2.7 min: שנערך ב-70% B; 2.7-2.8 מין: 70%-90% B. B 3.8-4.0 מין: 90% רחיצה; 4.0-min 4.1: 90%-40% B; 4.1-6.0 min: שנערך ב- 40% B). מעברים יון של m/z 392.49 ← 393, מ/z 408.49 ← 409, מ/z 422.47 ← 423 ו m/z 452.40 ← 453 היו בשימוש על MS/MS ניטור של ivacaftor, IVA - M1, IVA-M6 ו- lumacaftor, בהתאמה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56084/56084fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">תנאים HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>טור</td>
			<td>C8; 2.6 מיקרומטר; 100 Å; 50 x 2.1 מ מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">משמר עמודה</td>
			<td>HPLC בשורה מסנן 0.5 מיקרומטר; סנן עומק x 0.004 inID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מסנן x 0.004 inID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>טמפרטורה עמודה:</td>
			<td>30 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>נייד שלב א':</td>
			<td>0.1% פא במים</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>נייד שלב ב':</td>
			<td>לחצן מצוקה 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>הרכב הנייד-נקודת המוצא</td>
			<td>60 / 40 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>לדוגמה טמפרטורה:</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>נפח הזרקה:</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>שטיפת מחט</td>
			<td>80% מתנול, 20% מים 300 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קצב הזרימה:</td>
			<td>0.5 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="7">הדרגה:</td>
			<td>-min 1:40 % B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1-2 דקות: 40% - 70% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2-2.7 מין: שנערך ב-70% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2.7 - 2.8 מין: 70% - 90% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>כביסה min 4.0: 90% B - 2.8-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4.0 - 4.1 מין: 90% - 40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4.1-6.0 מין: שהתקיים ב-40%,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סה כ להפעיל:</td>
			<td>6 דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">שעות השמירה:</td>
			<td>זמן השמירה על M6: מין 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>זמן השמירה על M1: מינימום 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>זמן השמירה על IVA: 1.55 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>זמן השמירה על LUMA: 2.3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">תנאים MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>זיהוי מצב:</td>
			<td>ספקטרומטריית electrospray ESI חיובי +</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>יון ספריי מתח:</td>
			<td>4.5 kV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אנרגיית התנגשות:</td>
			<td>295.9 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גז nebulizing (חנקן):</td>
			<td>3 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גז CID:</td>
			<td>230 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ייבוש זרימת גז (חנקן):</td>
			<td>20 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>רוד קדם Q1 הטיה:</td>
			<td>- & #1</td></tr></tbody></table>60;      5 V
		
		<tr>
			<td>CE:</td>
			<td>-25 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q3 רוד קדם הטיה:</td>
			<td>-5 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ממשק הנוכחי:</td>
			<td>0.1 UA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desolvation טמפרטורה:</td>
			<td>250 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>חום בלוק טמפרטורה:</td>
			<td>400 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVA מ/z</td>
			<td>392.49 ← 393</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 מ/z</td>
			<td>408.49 ← 409</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 מ/z</td>
			<td>422.47 ← 423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMA מ/z</td>
			<td>452.40 ← 453</td>
		</tr>
	

טבלה 1: פרטים של התנאים HPLC-MS.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cys

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

שילוב Ivacaftor ivacaftor-lumacaftor הן שתי תרופות CF חדש. עם זאת, יש עדיין מחסור ההבנה שלהם PK/PD, פרמקולוגיה. אנו מציגים טכניקה HPLC-MS ממוטבים לניתוח בו זמנית של ivacaftor שלה מטבוליטים הגדולות ואת lumacaftor.

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

optimized-lc-msms-method-for-high-throughput-analysis-clinical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.2K Views.  Monash University. שילוב Ivacaftor ivacaftor-lumacaftor הן שתי תרופות CF חדש. עם זאת, יש עדיין מחסור ההבנה שלהם PK/PD, פרמקולוגיה. אנו מציגים טכניקה HPLC-MS ממוטבים לניתוח בו זמנית של ivacaftor שלה מטבוליטים הגדולות ואת lumacaftor.

Video: Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control seizures. However, a significant minority of patients continues to exhibit post-operative seizures, even in those cases in which the suspected source of seizures has been correctly localized and resected. The protocol presented here combines a clinical procedure routinely employed during the pre-operative evaluation of temporal lobe epilepsy (TLE) patients with a novel technique for network analysis. The method allows for the evaluation of the temporal evolution of mesial network parameters. The bilateral insertion of foramen ovale electrodes (FOE) into the ambient cistern simultaneously records electrocortical activity at several mesial areas in the temporal lobe. Furthermore, network methodology applied to the recorded time series tracks the temporal evolution of the mesial networks both interictally and during the seizures. In this way, the presented protocol offers a unique way to visualize and quantify measures that considers the relationships between several mesial areas instead of a single area.

This protocol describes a procedure to track the evolution of mesial network measures in temporal lobe epilepsy (TLE) patients. It is based on the combination of intracranial recordings with a novel numerical technique for data analysis. Specifically, we present a protocol for network analyses of foramen ovale recordings.

ניתוח רשת של הקלטות אלקטרודה foramen ovale בחולים עמידים בפני תרופות Temporal Lobe אפילפסיה

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

אסטרטגיות דגימה ועיבוד של דגימות רקמה Biobank של מודלים ביו חזירי

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Collecting Hair Samples for Hair Cortisol Analysis in African Americans

The hormone cortisol is typically assessed in saliva, serum, or urine samples. More recently, cortisol has been successfully extracted from hair, including humans. The advantage of hair cortisol concentration is that it reflects a retrospective representation of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis function over time, much like hemoglobin A1C represents glycemic control. However, obtaining hair samples can be challenging, due to the cultural beliefs and hair care practices of minority participants. For example, African Americans may be reluctant to provide samples. Additionally, few researchers are trained to collect hair samples from African Americans. The purpose of this paper is to present a culturally informed protocol to help researchers obtain hair samples from African Americans. To illustrate the representative results of this protocol implementation, de-identified data from African Americans that participated in a community-based study on chronic stress are provided. Hair practice preferences are assessed. The participants are made comfortable by showing pictures of hair samples prior to cutting their hair. The single strain twist and gently pull method is used to collect approximately 30 - 50 strands of hair from the posterior vertex region of the scalp. This protocol will significantly improve collection of hair samples from African Americans.

Hair cortisol concentration analysis provides an alternative to traditional measures of cortisol; however, to collect hair samples from African Americans, scientists need to be culturally informed and competent. The purpose of this protocol is to demonstrate a culturally informed technique to collect hair samples for cortisol analysis from African Americans.

איסוף דגימות שיער עבור בדיקת קורטיזול שיער אפריקאים אמריקאים

The hormone cortisol is typically assessed in saliva, serum, or urine samples. More recently, cortisol has been successfully extracted from hair, ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

ניתוח תפוקה גבוהה של נתוני מיפוי אופטי באמצעות מידע אלקטרומגנט

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

תפוקה גבוהה בשיטת באתרו להערכת הפטציט הגרעיני בעכברים

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

מאומת LC-MS/MS הפאנל לכמת 11 תרופות עמידות לפני שחפת בדגימות שיער קטן

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. Microbes have traditionally been classified based on their ability to use or tolerate oxygen. Supplemental oxygen is a common medical therapy administered to people with cystic fibrosis (pwCF); however, existing studies on oxygen and the airway microbiome have focused on how hypoxia (low oxygen) rather than hyperoxia (high oxygen) affects the predominantly aerobic and facultative anaerobic lung microbial communities. To address this critical knowledge gap, this protocol was developed using an artificial sputum medium that mimics the composition of sputum from pwCF. The use of filter sterilization, which yields a transparent medium, allows optical methods to follow the growth of single-celled microbes in suspension cultures. To create hyperoxic conditions, this model system takes advantage of established anaerobic culturing techniques to study hyperoxic conditions; instead of removing oxygen, oxygen is added to cultures by daily sparging of serum bottles with a mixture of compressed oxygen and air. Sputum from 50 pwCF underwent daily sparging for a 72-h period to verify the ability of this model to maintain differential oxygen conditions. Shotgun metagenomic sequencing was performed on cultured and uncultured sputum samples from 11 pwCF to verify the ability of this medium to support the growth of commensal and pathogenic microbes commonly found in cystic fibrosis sputum. Growth curves were obtained from 112 isolates obtained from pwCF to verify the ability of this artificial sputum medium to support the growth of common cystic fibrosis pathogens. We find that this model can culture a wide variety of pathogens and commensals in CF sputum, recovers a community highly similar to uncultured sputum under normoxic conditions, and creates different culture phenotypes under varying oxygen conditions. This new approach might lead to a better understanding of unanticipated effects induced by the use of oxygen in pwCF on airway microbial communities and common respiratory pathogens.

The goal of this protocol is to develop a model system for the effect of hyperoxia on cystic fibrosis airway microbial communities. Artificial sputum medium emulates the composition of sputum, and hyperoxic culture conditions model the effects of supplemental oxygen on lung microbial communities.

תכנון ופיתוח של מודל לחקר ההשפעה של חמצן משלים על המיקרוביום של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...