J.l. und t.v. werden durch das National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) von den National Institutes of Health (R01 AI111965) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten oder die National Institutes of Health. MC ist eine australische NHMRC Principal Research Fellow. J. L. ist eine australische National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Research Fellow und t.v. ist eine australische NHMRC Industrie Career Development Level 2 Research Fellow. E.K.S ist eine ausgestattete junge Botschafter 2017 für ASM (American Society for Microbiology) und wird von den australischen Postgraduate Award unterstützt. Teile dieser Arbeit wurde auf 12th Australiasian Konferenz über Mukoviszidose In Melbourne (5-8th August 2017) präsentiert.

Genehmigung für Ethik wurde von Monash Universität menschliche Forschung Ethics Committee (MUHREC).
 1. Anwendung des Tests: Patient Musterkollektion <ol><li>nehmen Sie die Zeit, wann der Patient ihre standard-Dosis von 150 mg Ivacaftor oder Ivacaftor 125 mg /lumacaftor nimmt, 200 mg.</li>
	<li>Hinweis unten die genaue Uhrzeit, wann der Patient Blutprobe erfasst. 
	Hinweis: Wir empfehlen 4-5 Probenahmen über einen 24 h-Zeit-Verlauf. Wenn die Auflistung nur eine Probe möglich ist, ist der angegebene Zeitpunkt 2,5-4 h Post Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor Kombination Dosierung wie C max Konzentrationen im Steady-State nach erreichbar sein werden &#62; 5 Tage in Folge Behandlung.</li>
	<li>4 bis 5 mL Blut in handelsüblichen unbehandelten blauen Röhren sammeln.</li>
	<li>Nach der Entnahme des Vollblutes, das Blut gerinnen lassen es bei Zimmertemperatur ungestört lassen. 
	Hinweis: Dies dauert in der Regel 15-30 min.</li>
	<li>Entfernen das Gerinnsel durch Zentrifugieren bei 1.000-2.000 x g für 10 min bei 4 ° C in einer gekühlten Zentrifuge. Den daraus resultierende Überstand als Plasma zu bezeichnen.</li>
	<li>Nach Zentrifugation, den überstand (Plasma) in ein sauberes Polypropylen Röhrchen mit einer Pasteurpipette sofort übertragen. Label das Plasma Schlauch mit der Patienten-ID (z. B. Patient 1), die verabreichten Arzneimittels (z.B. Ivacaftor-Lumacaftor-Kombination) und Zeit der Patientenprobe war gesammelt (z. B. Post-Dosierung 2,5 h).</li>
	<li>Pflegen Proben bei 2 bis 8 ° C bei der Handhabung. Nach Abschluss der Bearbeitung speichern Proben bei &#8211; 20 ° c</li>
	<li>Bei Bedarf versenden Proben mit einer genehmigten Kurier an die Analyse Institut. 
	Hinweis: Proben auf Trockeneis bis Ankunft geliefert werden sollen und aufbewahrt werden, am &#8211; 80° C bis zur Analyse.</li>
</ol> 2. Vorbereitung und Bearbeitung der anfallenden Proben und Standards Hinweis: Plasma von gesunden Spendern naiv auf Ivacaftor/Lumacaftor-Therapie wurde von dem australischen Roten Kreuz erhalten. Um die Integrität zu gewährleisten, sollten alle Proben/Standards während der Erhebung und Verarbeitung bei 2 bis 8 ° C gehalten werden. Nach Abschluss der Bearbeitung speichern Proben bei &#8211; 20 ° c
<ol><li>, IVA, IVA-Carboxylat, Hydroxymethyl-IVA und LUMA dienen als Referenz für die internen Standards wiegen.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei unabhängige Stammlösungen der einzelnen Analyten (IVA, M1, M6 und LUMA) in LC-MS Grade Methanol 100 µg/ml und 10 µg/ml. 
	Hinweis: Verbindungen endet nach 10 Tagen auf die Benchtop.</li>
	<li>Frisch zubereiten LC-MS Kalibrierstandards vor jedem analytischen Lauf durch Verdünnung der Kalibrierstandards Stammlösungen in menschlichem Plasma nach Konzentrationen zu erreichen: 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 und 10,0 µg/mL. Diese Proben werden als Standard bezeichnet.</li>
	<li>Proteine ausgefällt, 0,1 % Ameisensäure (FA) in Acetonitril (ACN, LC-MS-Grade) Vorbereitung und lassen im Kühlschrank bis benötigt.</li>
</ol> 3. Vorbehandlung der entstandenen Muster und Normen <ol><li>erlauben beide Patienten und leere Plasma-Proben auf Raumtemperatur equilibrate.</li>
	<li>Vortex mischen jede Plasma-Probe für 15 s pro Probe.</li>
	<li>Einer 100 µL Aliquot entweder leer Plasma für Standards oder Proben für die Analyse in einem 1,5 mL Polypropylen Microcentrifuge Schlauch übertragen.</li>
	<li>Fügen Sie den internen standard IVA in jedes standard Rohre (z.B. 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 und 10,0 µg/mL potenzielle Konzentrationsbereich abdecken), schließen Sie den Deckel und Vortex für 2-3 S. Hinweis, dass interne Standard ist nur Hinzu kommt die leere Plasma und keine internen Standards wird hinzugefügt, um die Patientenproben.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.4. für die anderen internen Standards M1, M6 und LUMA.</li>
	<li>Spin-down jedes Rohr kurz um sicherzustellen, dass auf dem Deckel gibt es keine Tröpfchen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL einer Mischung aus 0,1 % FA ACN in jedes Rohr, Plasmaproteine auszufällen.</li>
	<li>Vortex die Mischung kräftig für ca. 15 s.</li>
	<li>Röhrchen 10 min. im Kühlschrank ruhen lassen.</li>
	<li>Wenn möglich bei 10.000 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert.</li>
	<li>Filtern eine aliquote 200 µL des Überstands durch ein 13 mm-Spritze-Filter in einem 1,5 mL HPLC Vials.</li>
	<li>Transfer 100 µL des Überstands in der LC-MS-Fläschchen für die HPLC-MS-Analyse.</li>
</ol> 4. HPLC-MS-Analyse Hinweis: der HPLC-MS-Analyse erfolgte auf einem LC-MS-System gekoppelt mit dem triple Quadrupol-Massenspektrometer (Tabelle 1).
<ol><li>Biegen Sie auf dem LC-MS-System, das Tablett mit den Proben in der Auto-Sampler.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte auf eine Vorsäule und verbinden mit der LC-MS-System.</li>
	<li>Fügen Sie beide Flaschen der mobilen Phasen (Flasche A: 100 % ACN; Flasche B: 0,1 % Ameisensäure im Wasser) und das LC-MS-System equilibrate.</li>
	<li>Die folgenden Parameter in der LC-MS-Protokoll integrieren.
	<ol><li>Teilen den Fluss der mobilen Phase vor dem Eintritt in das Massenspektrometer im Verhältnis 2:1 (verschwenden: MS Einlass).</li>
		<li>Führen Sie einen Gradienten Elution mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einer mobilen Phase, bestehend aus 100 % ACN und 0,1 % Ameisensäure im Wasser (Ausgangspunkt bei 40: 60, V/V). Beachten Sie, dass die Volumenprozent der mobilen Phase während Analyse.</li>
		<li>Das Massenspektrometer in einem positiven Elektrospray-Ionisation-Modus zu betreiben.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die LC-MS-Einstellungen wie folgt sind: Ionen-Spray Spannung 4,5 kV, Aufprallenergie 295.9 V, Vernebelung Gas: Stickstoff bei 3 L/min; Kollision Gas: Argon; Trocknungsgas flow 20 L/min, Spannung Q3-Objektiv:-22 V, zugeführten Temperatur 250 ° C mit einem Heizblock Temperatur von 400 ° c</li>
		<li>Injizieren 10 µL Volumen pro Probe.</li>
		<li>Detect Analyten mit mehreren Reaktion monitoring (MRM). Überwachen Sie die Ionen-Übergänge von m/Z 392.49 &#8594; 393, m/Z 408.49 &#8594; 409, m/Z 422.47 &#8594; 423 und m/Z 452.40 &#8594; 453 für IVA, IVA-M1, IVA-M6 und LUMA, bzw.. 
		Hinweis: Die neu optimierte Methode noch nicht vollständig gemäß FDA-Standards validiert werden.</li>
	</ol></li></ol> 5. Kalibrierkurven <ol><li>Konstrukt der LC-MS Kalibrierkurven vor jedem analytischen Lauf unter Zugrundelegung der Beziehung zwischen die Flächenverhältnisse der Höhepunkt eines jeden der vier Analyten zu internen Standard und die Kalibrierung standard geringe Konzentrationen von Ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 oder LUMA) Einstellungen programmintern LC-MS. 
	Hinweis: Die genauen Schritte für den Bau der Eichkurve richtet sich nach dem Vorbild der LC-MS-Ausrüstungen. Diese Informationen möglicherweise in das Gerätehandbuch verfügbar.</li>
	<li>Kleinste-Quadrate-lineare Regressionsanalyse durch Gewichtung 1/C 2 nach der Kehrwert der Konzentrationen führen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor.">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li><li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).</li><li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis.">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li><li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation.">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li><li>Wainwright, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis.">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).</li><li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).</li><li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertex prescribing infomation. , (2015).</li><li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+(ivacaftor).">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+HPLC+and+LC-MS/MS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor,+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO.">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li><li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+LC-MS/MS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma:+application+to+a+pharmacokinetic+study.">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wie bereits berichtet hat unsere Gruppe für das erste Mal entwickelt und validiert eine HPLC und LC-MS Methode zur schnellen Erkennung und Quantifizierung von Ivacaftor und seiner wichtigsten Metaboliten Hydroxymethyl-IVA M1 (aktiv) und IVA-Carboxylat M6 (inaktiv); und Lumacaftor im Plasma und Auswurf von CF Patienten14. Der Test unserer Gruppe zuvor berichtet wurde erfolgreich eingesetzt, um die Konzentration von LUMA, IVA, IVA-M1 und IVA-M6 im Plasma und Auswurf von CF-Patienten, die eine stationäre Standardtherapie mit IVA 150 mg /q12 h zu quantifizieren (lateinische Terminologie: Quaque 12 h; einmal alle 12 h) oder 200 mg /q12 h LUMA-125 mg /q12 h IVA Kombination14. Für die Hochdurchsatz-Analyse großer Mengen von Patientenproben, haben wir durch die Verwendung einer kleineren Poren Größe Reverse-Phase-Chromatographie Spalte C8 die gemeldeten Methode optimiert (2,6 µm; 100 Å; 50 x 2.1 mm2) und ein gradient Lösungsmittelsystem statt wie bisher isokratischen Elution. Dies verringert die Laufzeit bis 6 min pro Probe.
Diese zuverlässige und neuartige Methode bietet einen einfachen, sensiblen und schnellen Ansatz für therapeutisches Drug monitoring der Kombination aus Ivacaftor und Ivacaftor-Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten. Angesichts der Notwendigkeit, Exposition-Wirkungs-Beziehungen zur Maximierung der Wirksamkeit von Medikamenten sowie enthalten Kosten im Gesundheitswesen zu entwickeln, müssen empfindlicher Instrumente entwickelt und validiert, um Kliniker bei der Evidenz-basierten Therapien mit hohem Durchsatz Analysetechniken für Patienten mit unserer Gruppe vgl. hat bereits berichtet eine teilweise validierten HPLC-MS für IVA, IVA-M1, IVA-M6 und LUMA im Plasma und Auswurf von CF Patienten14gleichzeitig zu analysieren. Zur Gründung einer gemeinsamen und leicht zu bedienende analytische Protokoll für die Analyse von Patienten, die Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor Kombination würde Datenvergleich und Interpretation der Ergebnisse von zukünftigen pharmakokinetischen Studien erleichtern. Messung von IVA, IVA-M1, IVA-M6 und LUMA in biologischen Flüssigkeiten mittels LC-MS Techniken könnte ein mächtiges Werkzeug für die Erkundung der Exposition-Wirkungs-Beziehung in Bezug auf therapeutische Ergebnisse verkörpern.
Im Allgemeinen, HPLC-MS-Analyse von Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor Kombination in biologischen Flüssigkeiten könnten bieten eine molekulare Grundlage für die Umsetzung der individuellen pharmakotherapeutische Strategien bei Patienten mit CF und erweisen sich auf dem Gelände machen die teurere Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor Kombinationstherapie von potenziell auf die Notwendigkeit für weniger häufige Dosierung kostengünstiger, nützlich. Durch die Anwendung der vorgeschlagenen Analysemethode klinische Pharmakokinetische/pharmakodynamische Studien, ist die Möglichkeit entstanden, um weiter zu untersuchen, die pharmakokinetischen Parameter von Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor Kombination an einem größeren Patienten Kollektiv.

Cystische Fibrose (CF) ist eine gemeinsame genetische Krankheit unter Einbeziehung der exokrinen Schleim Drüsen von Lunge, Leber, Bauchspeicheldrüse und Darm verursacht progressive Multi-Organversagen, wie einen Rückgang der Lungenfunktion und Pankreasinsuffizienz1, 2,3. Ivacaftor (IVA) ist der erste Food and Drug Administration (FDA, USA) und European Medicines Agency (EMA) genehmigt Mukoviszidose Trans-Membran Leitwert Regulator (CFTR) Potentiator Droge, mit nachgewiesenen klinischen Wirksamkeit produziert eine erhebliche Verbesserung der Lungenfunktion gegenüber Placebo in eine kleine Teilmenge der CF-Patienten mit G551D-CFTR [Glycin (G) in Stellung 551 wird ersetzt durch Asparaginsäure (D)] Missense-Mutation (~ 4-5 % der Bevölkerung CF)4,5. Oral verabreicht das Medikament erhöht die CFTR-Kanal öffnen, wodurch die Chlorid-Ionen-Fluss und Beeinflussung der primären Defekts, der die die klinischen Manifestationen von CF4,6führt. IVA-Monotherapie ist leider nicht wirksam bei Patienten mit häufiger homozygoten F508del-Mutation [in Frame Löschen des CFTR-Gens führt zu Verlust von Phenylalanin (F) an Position 508] wodurch fehlgefaltete CFTR, die in ~ 50 % der zu sehen ist die CF Bevölkerung7,8.
Vor kurzem hat die FDA Zulassung für die Kombination von IVA mit der CFTR-Korrektor Medikament Lumacaftor gewährt. Die clevere Strategie verbinden CFTR-Korrektor (Lumacaftor, LUMA), der F508del-CFTR an der Zelloberfläche mit einem Modulator (IVA) birgt die CFTR-Kanal Aktivität, potenziert, erweitert effektiv das Behandlungsfenster zu einem Großteil der CF Bevölkerung5 . Es bleiben Fragen über ob diese Medikamente ihre Versprechen zu erfüllen wie eine Reihe von widersprüchlichen berichten, dass Zweifel auf ihre klinische Wirksamkeit9,10entstanden sind. Außerdem wurden Verbesserungen der Lungenfunktion nur bescheiden (2,6-4 % für Ivacaftor-Lumacaftor Kombination) im Vergleich zu dem Erfolg mit IVA-Monotherapie bei Patienten mit einem G551D Mutation (10,6-12,5 %)8. Potenzielle antagonistische Wechselwirkungen zwischen IVA und LUMA, die potenziell die klinische Wirksamkeit der Ivacaftor-Lumacaftor Kombination einschränken stammen aus seiner weniger als ideal pharmakokinetischen Eigenschaften7,11. IVA ist umfassend durch Cytochrom P450 Enzyme (CYP), in erster Linie auf einen aktiven Metaboliten Hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) und eine inaktive Form IVA-Carboxylat (IVA-M6, M6)7,12metabolisiert. CYP3A4-Induktor LUMA, auf der anderen Seite ist nicht extensiv metabolisiert und ist weitgehend unverändert in den Kot11ausgeschieden. Wie CYP3A4 Induktoren Cytochrom Stoffwechsel induzieren, konnte Ivacaftor (CYP3A4-Substrat) Konzentrationen reduziert werden. Darüber hinaus IVA und LUMA sind sehr hydrophobe Moleküle und sind ~ 99 % gebunden an Plasmaproteine, welche Grenzen deutlich frei (Wirkstoff) Konzentration1,13.
Gemeinsam können diese Faktoren zusammen kommen, die klinische Wirksamkeit der Ivacaftor-Lumacaftor Kombination zu begrenzen. Es ist nicht bekannt, ob optimale Plasmakonzentrationen unter dem aktuellen Dosierungsplan für Ivacaftor-Lumacaftor Kombination erreicht werden oder wenn die therapeutische Schwelle8beibehalten wird. Derzeit gibt es einen Mangel an Informationen hinsichtlich der pharmakokinetischen Parameter wie die Peak und Steady-State Plasmakonzentrationen von Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor. Angesichts den notierten Metabolismus von Ivacaftor und Lumacaftor, ist Überwachung der Exposition-Wirkungs-Beziehungen Voraussetzung für optimale Dosierung Therapien für Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor Therapie zu erreichen. Unsere Gruppe hat kürzlich die erste HPLC/LC-MS-Methode zur Überwachung der Exposition-Wirkungs-Beziehungen von IVA und LUMA14veröffentlicht. Bisher wurden keine alternativen Verfahren zur Messung der Konzentrationen von Ivacaftor, seiner Metaboliten und Lumacaftor beschrieben. Hochdurchsatz-Analyse eines größeren Patienten Kollektivs ermöglichen und Analysezeit drastisch verringern, unsere Gruppe wurde optimiert, die gemeldeten Methode durch den Einsatz einer kleineren Poren Größe Reverse-Phase-Chromatographie Spalte und ein gradient Lösungsmittelsystem, reduziert Kosten und Laufzeiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:480px;">IVA (Cat#S114)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">SelleckChem (USA).&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LUMA (Cat#S1565)&#160;</td>
			<td>SelleckChem (USA).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)&#160;</td>
			<td>Clearsynth (Canada).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)&#160;</td>
			<td>Clearsynth (Canada).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol (MeOH, LC-MS grade),&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile (ACN, LC-MS grade)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formic acid (FA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenomenex Kinetex (2.6 &#181;m C8 100 &#197;; 50 &#215; 2.1mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR).&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5430</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">13-mm syringe filter (0.45 &#181;m nylon, GRACE, USA)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 &#181;L, PTFE/Silicone septa].&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized lc-ms/ms method for the high-throughput analysis of clinical samples of ivacaftor, its major metabolites, and lumacaftor in biological fluids of cystic fibrosis patients

Mängel in der Mukoviszidose-Trans-Membran Leitwert Regulator (CFTR) sind die Ursache für Cystische Fibrose (CF), eine Krankheit mit lebensbedrohlichen pulmonale Manifestationen. Ivacaftor (IVA) und Ivacaftor-Lumacaftor (LUMA) Kombination sind zwei neue Durchbruch CF-Medikamente, die direkt die Aktivität und des Handels des defekten CFTR-Proteins modulieren. Allerdings gibt es noch einen Mangel an Verständnis auf Pharmakokinetische/pharmakodynamische Parameter und der Pharmakologie des Ivacaftor und Lumacaftor. Die HPLC-MS-Technik für die gleichzeitige Analyse der Konzentrationen von Ivacaftor, Hydroxymethyl-Ivacaftor, Ivacaftor-Carboxylat und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten bei Patienten, die Standardkombination Ivacaftor oder Ivacaftor-lumacaftor Therapie wurde bisher von unserer Gruppe entwickelt und teilweise validiert, um FDA-Standards. Jedoch um die Hochdurchsatz-Analyse einer größeren Anzahl von Proben zu ermöglichen, unsere Gruppe wurde optimiert, die gemeldeten Methode durch den Einsatz einer kleineren Poren Größe Reverse-Phase-Chromatographie Spalte (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2,1 mm) und ein gradient Lösungsmittelsystem ( 0-1 min.: 40 % B; 1-2 min: 40-70 % B; 2-2,7 min: hielt bei 70 % B; 2,7-2,8 min: 70-90 % B; 2,8-4,0 min: 90 % B waschen; 4.0-4,1 min: 90-40 % B; 4,1-6,0 min: hielt bei 40 % B) anstelle einer isokratischen Elution. Ziel dieser Studie war es, HPLC-MS Analyse pro Probe dramatisch von ~ 15 min, nur 6 Minuten pro Probe, verkürzen die für die Analyse einer großen Menge von Patientenproben unerlässlich ist. Diese sinnvolle Methode werden erhebliche Dienstprogramm für Studien in der Exposition-Wirkungs-Beziehungen dieser Durchbruch CF Medikamente.

Eine Methode, teilweise validiert, um FDA-Standards auf einem Triple-Quadrupol-LC-MS und einer HPLC-Detektor-System haben wir vor kurzem berichtet über eine Spalte C8 (5 µm, 3,9 x 50 mm i.d.) mit der mobilen Phase, bestehend aus 100 % ACN und 0,1 % Ameisensäure in Wasser (40: 60 V/V) bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min. Eine lineare Korrelation der Gipfel wurde über einen Konzentrationsbereich von 0,01 bis 10 µg/mL im menschlichen Plasma für alle Metaboliten, Ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 und Lumacaftor14beobachtet. Hier wurde diese Methode optimiert erlauben drastisch reduziert LC Retentionszeiten und somit die komplette Laufzeit des Tests, der für die Hochdurchsatz-Analyse einer großen Menge von klinischen Proben unerlässlich ist. Der Test wurde durch den Einsatz einer kleineren Poren Größe Reverse-Phase-Chromatographie Spalte und ein gradient Lösungsmittelsystem anstelle einer isokratischen Elution, Verringerung der Zeit pro Probe von ~ 15 min auf nur 6 min optimiert. Die Analyte werden in Elektrospray positiv Mode mit mehreren Reaktion monitoring (MRM) ermittelt. Das Verfahren sollte im eigenen Haus vor dem Einsatz überprüft werden, wie wir bisher14detaillierte haben.
Die Genauigkeit der Methode war 94,2 % ± 4,53 % bis 97,5 % ± 2,94 %, abhängig von der Analyten14. Die Kalibrierung zwischen 0.01 und 10 µg/mL ist für den Einsatz in der klinischen Einstellung, insbesondere angesichts der Tatsache, dass unter Ivacaftor-Lumacaftor Therapie, sehr niedrige Konzentrationen von aktiven IVA und M1 von unserer Fraktion zuvor im Plasma potenziell zu gemeldet wurden die Induktion von CYP3A4 durch LUMA, führt zu umfangreichen IVA Stoffwechsel14. Die Intraday-Genauigkeit der einzelnen Analyten wurde am selben Tag in Konzentrationen von 0,05, 0,5 und 8 µg/mL mit sechs selbständig vorbereitete Qualitätskontrolle (QC) Proben beurteilt. Die Inter Tage Genauigkeit war mit sechs selbständig vorbereitete QC-Proben an drei aufeinanderfolgenden Tagen bewertet. Genauigkeit und Präzision waren über relative Standardabweichung (RSD) berechnet. Für jede Probe QC der RSD-Werte sollte weniger als 15 %15. Alle vier Analyten zeigten RSD-Werte von weniger als 15 %14. Die untere Grenze der Nachweisgrenze (LOD) und Quantifizierung (LOQ) entstanden: für IVA LOD 2,50 x 10-3 µg/mL und LOQ 7,57 x 10-3 µg/mL; für M1, LOD 4,57 X 10-4 µg/mL und LOQ 1,38 X 10-3 µg/mL; für M6 LOD 5,86 x 10-4 µg/mL und LOQ 1,78 X 10-3 µg/mL; LUMA LOD war 6,08 x 10-4 µg/mL und LOQ 1,84 x 10-3 µg/mL14. Ein typisches Chromatogramm ist in Abbildung 1dargestellt. Eine optimierte chromatographische Auflösung erhielt mit einer mobilen Phase 100 % ACN und 0,1 % Ameisensäure im Wasser (Ausgangspunkt bei 40: 60, V/V) mit einem Gradienten Elution auf eine Spalte C8 (2,6 µm; 100 Å; 50 x 2,1 mm). Die gradient Trennung war mit 40 % der mobilen Phase B von 0 bis 1 min verwendet; dann 40 % - 70 % der mobilen Phase B von 1 min, 2 min; 70 % der mobilen Phase B 2 min bis 2,7 min halten; Erhöhung von 70 % bis 90 % der mobilen Phase B von 2,7 min bis 2,8 min; hält 90 % der mobilen Phase B 2,8 min bis 4,0 min zum Waschen verwendet; endlich wieder von 90 % auf 40 % der mobilen B von 4,0 min bis 4,1 min; dann hält 40 % der mobilen Phase B 4,1 min bis 6,0 min für Anfangsbedingungen (Abbildung 1). Die Retentionszeiten LC wurden wie folgt für M6 1,0 min; für M1 1,3 min; für IVA: 1,55 min; für LUMA: 2,3 min (Abbildung 1). In allen leeren Plasma-Proben keine Interferenz mit der Retentionszeit von entweder der Analyten wurde beobachtet, noch Störungen erkannt wurde, aus der Kombination von Ivacaftor mit Lumacaftor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56084/56084fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Vertreter LC-MS-Chromatogramm von Humanplasma gespickt mit 10 µg/mL IVA-M6, IVA-M1, Lumacaftor und Ivacaftor in Bezug auf die Gradienten Elution von Pumpe. Eine 0,1 % Ameisensäure in Wasser und Pumpe B 100 % Acetonitril (0-1 min.: 40 % B; 1-02:00 %-70 % B; 2-2,7 min: hielt bei 70 % B; 2,7-2,8 min: 70 %-90 % B; 3,8-4,0 min: 90 % B waschen; 4.0-4,1 min: 90 %-40 % B; 4,1-6,0 min: bei 40 % B gehalten). Die Ionen-Übergänge von m/Z 392.49 → 393, m/Z 408.49 → 409, m/Z 422.47 → 423 und m/Z 452.40 → 453 dienten für MS/MS Ivacaftor, IVA - M1, IVA-M6 und Lumacaftor, bzw. überwacht. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56084/56084fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">HPLC-Bedingungen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spalte</td>
			<td>C8; 2,6 µm; 100 Å; 50 x 2,1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Vorsäule</td>
			<td>HPLC mit Netzfilter 0,5 µm; Tiefenfilters x 0,004 inID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter x 0,004 InID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Säulentemperatur:</td>
			<td>30 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Die Mobile Phase A:</td>
			<td>0,1 % FA im Wasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Die Mobile Phase B:</td>
			<td>100 % ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Phase Komposition am Ausgangspunkt</td>
			<td>60 / 40 (V/V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatur der Probe:</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injektionsvolumen:</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadel-Waschanlagen</td>
			<td>80 % Methanol, Wasser 20 % 300 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durchfluss:</td>
			<td>0,5 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="7">Gefälle:</td>
			<td>01:00 % B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1-02:00 % - 70 % B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2-2,7 min: hielt bei 70 % B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2,7 - 2,8 min: 70 % - 90 % B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2,8 - 4,0 min: 90 % B waschen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4.0 - 4,1 min: 90 % - 40 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4,1-6,0 min: hielt bei 40 %,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insgesamt laufen:</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Retentionszeiten:</td>
			<td>Aufbewahrungszeit für M6: 1,0 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aufbewahrungszeit für M1: 1,3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aufbewahrungszeit für IVA: 1,55 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aufbewahrungszeit für LUMA: 2,3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">MS-Bedingungen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erkennungsmodus:</td>
			<td>Electrospray positive ESI +</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionen-Spray Spannung:</td>
			<td>4.5 kV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aufprallenergie:</td>
			<td>295.9 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vernebelung Gas (Stickstoff):</td>
			<td>3 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CID Gas:</td>
			<td>230 kPa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocknen Gasstrom (Stickstoff):</td>
			<td>20 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q1 Pre-Rod Bias:</td>
			<td>- & #1</td></tr></tbody></table>60;      5 V
		
		<tr>
			<td>CE:</td>
			<td>-25 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q3 Pre-Stab Bias:</td>
			<td>-5 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strom-Schnittstelle:</td>
			<td>0,1 UA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zugeführten Temperatur:</td>
			<td>250 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitze-Block-Temperatur:</td>
			<td>400 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVA m/z</td>
			<td>392.49 → 393</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 m/z</td>
			<td>408.49 → 409</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 m/z</td>
			<td>422.47 → 423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMA m/z</td>
			<td>452.40 → 453</td>
		</tr>
	

Tabelle 1: Details der HPLC-MS-Bedingungen.

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Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Kombination aus Ivacaftor und Ivacaftor-Lumacaftor sind zwei neue CF-Medikamente. Allerdings gibt es noch ein Mangel an Verständnis über ihre PK/PD und Pharmakologie. Wir präsentieren Ihnen eine optimierte HPLC-MS-Technik für die simultane Analyse von Ivacaftor und seine Hauptmetaboliten und Lumacaftor.

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

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Serie: Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Forschung

Medizin

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control seizures. However, a significant minority of patients continues to exhibit post-operative seizures, even in those cases in which the suspected source of seizures has been correctly localized and resected. The protocol presented here combines a clinical procedure routinely employed during the pre-operative evaluation of temporal lobe epilepsy (TLE) patients with a novel technique for network analysis. The method allows for the evaluation of the temporal evolution of mesial network parameters. The bilateral insertion of foramen ovale electrodes (FOE) into the ambient cistern simultaneously records electrocortical activity at several mesial areas in the temporal lobe. Furthermore, network methodology applied to the recorded time series tracks the temporal evolution of the mesial networks both interictally and during the seizures. In this way, the presented protocol offers a unique way to visualize and quantify measures that considers the relationships between several mesial areas instead of a single area.

This protocol describes a procedure to track the evolution of mesial network measures in temporal lobe epilepsy (TLE) patients. It is based on the combination of intracranial recordings with a novel numerical technique for data analysis. Specifically, we present a protocol for network analyses of foramen ovale recordings.

Netzwerkanalyse von Foramen Ovale Elektrode Recordings in Resistente Temporallappen Epilepsie-Patienten

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Optimierte Analyse von<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Hepatosteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Collecting Hair Samples for Hair Cortisol Analysis in African Americans

The hormone cortisol is typically assessed in saliva, serum, or urine samples. More recently, cortisol has been successfully extracted from hair, including humans. The advantage of hair cortisol concentration is that it reflects a retrospective representation of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis function over time, much like hemoglobin A1C represents glycemic control. However, obtaining hair samples can be challenging, due to the cultural beliefs and hair care practices of minority participants. For example, African Americans may be reluctant to provide samples. Additionally, few researchers are trained to collect hair samples from African Americans. The purpose of this paper is to present a culturally informed protocol to help researchers obtain hair samples from African Americans. To illustrate the representative results of this protocol implementation, de-identified data from African Americans that participated in a community-based study on chronic stress are provided. Hair practice preferences are assessed. The participants are made comfortable by showing pictures of hair samples prior to cutting their hair. The single strain twist and gently pull method is used to collect approximately 30 - 50 strands of hair from the posterior vertex region of the scalp. This protocol will significantly improve collection of hair samples from African Americans.

Hair cortisol concentration analysis provides an alternative to traditional measures of cortisol; however, to collect hair samples from African Americans, scientists need to be culturally informed and competent. The purpose of this protocol is to demonstrate a culturally informed technique to collect hair samples for cortisol analysis from African Americans.

Sammeln von Haarproben für Cortisol Haaranalyse bei Afroamerikanern

The hormone cortisol is typically assessed in saliva, serum, or urine samples. More recently, cortisol has been successfully extracted from hair, ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Hochdurchsatzanalyse optischer Mapping-Daten mit ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. Microbes have traditionally been classified based on their ability to use or tolerate oxygen. Supplemental oxygen is a common medical therapy administered to people with cystic fibrosis (pwCF); however, existing studies on oxygen and the airway microbiome have focused on how hypoxia (low oxygen) rather than hyperoxia (high oxygen) affects the predominantly aerobic and facultative anaerobic lung microbial communities. To address this critical knowledge gap, this protocol was developed using an artificial sputum medium that mimics the composition of sputum from pwCF. The use of filter sterilization, which yields a transparent medium, allows optical methods to follow the growth of single-celled microbes in suspension cultures. To create hyperoxic conditions, this model system takes advantage of established anaerobic culturing techniques to study hyperoxic conditions; instead of removing oxygen, oxygen is added to cultures by daily sparging of serum bottles with a mixture of compressed oxygen and air. Sputum from 50 pwCF underwent daily sparging for a 72-h period to verify the ability of this model to maintain differential oxygen conditions. Shotgun metagenomic sequencing was performed on cultured and uncultured sputum samples from 11 pwCF to verify the ability of this medium to support the growth of commensal and pathogenic microbes commonly found in cystic fibrosis sputum. Growth curves were obtained from 112 isolates obtained from pwCF to verify the ability of this artificial sputum medium to support the growth of common cystic fibrosis pathogens. We find that this model can culture a wide variety of pathogens and commensals in CF sputum, recovers a community highly similar to uncultured sputum under normoxic conditions, and creates different culture phenotypes under varying oxygen conditions. This new approach might lead to a better understanding of unanticipated effects induced by the use of oxygen in pwCF on airway microbial communities and common respiratory pathogens.

The goal of this protocol is to develop a model system for the effect of hyperoxia on cystic fibrosis airway microbial communities. Artificial sputum medium emulates the composition of sputum, and hyperoxic culture conditions model the effects of supplemental oxygen on lung microbial communities.

Design und Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Atemwegsmikrobiom

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...