우리는 소프트웨어 최적화와 도움 뿐만 아니라 락 쉬 미와 Narasimhan Govindarajan TPST1 EGFP DNA 플라스 미드, 디 스티븐 스 (브리스톨의 대학, 브리스톨, 영국) 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 L.L. 국립 의학 연구 위원회 (NMRC/CBRG/007/2012), 교육 (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 및 RG132/15 AcRF Tier2 MOE2015-t 2-2-073)에서 교부 금에 의해 지원 되었다

<ol>
	<li>Glick, B. S., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Golgi+traffic:+a+critical+assessment.">Models for Golgi traffic: a critical assessment.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).</li><li>Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mammalian+Golgi.">Architecture of the mammalian Golgi.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).</li><li>Lu, L., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endosomes+to+the+trans-Golgi+network.">From endosomes to the trans-Golgi network.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li><li>De Matteis, M. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+localization+of+galactosyltransferase+in+HeLa+cells:+codistribution+with+thiamine+pyrophosphatase+in+trans-Golgi+cisternae.">Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae.</a> J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).</li><li>Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+sulfation+is+a+trans-Golgi-specific+protein+modification.">Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification.</a> J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).</li><li>Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. 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K., Melancon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+large+ADP-ribosylation+factor-guanine+nucleotide+exchange+factors+to+different+Golgi+compartments:+evidence+for+distinct+functions+in+protein+traffic.">Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).</li><li>Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. 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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이전, 가벼운 현미경 검사 법에서 골 지 단백질의 지 방화는 주로 상관 관계 또는 알려진된 지역화15,16, Golgi 마커 이미지와 단백질의 이미지의 중첩의 정도 의해 계량 17. 결과 상관 관계 또는 겹치는 계수 얼마나 가까운 테스트 단백질이 골 마커를 공간적으로 반영 합니다. 이 접근에 대 한 적어도 3 개의 경고가 있다. 첫째, 상관 관계 또는 겹치는 계수 비선형 이며 직접 공간적 거리 표시 하지 않습니다. 둘째, 상관 관계의 정도 비판적으로 현미경 시스템의 해상도에 따라 달라 집니다. 따라서, 두 골 단백질 사이의 계수 시스템 상수 아니다. 셋째, 같은 축 지역화 cisternae 따라 다른 측면 배포와 두 골 단백질 고유 계수를 가질 수 있습니다. 따라서, 상관 관계 또는 겹치는 계수 나타내지 않습니다 Golgi 단백질의 축 지역화. Dejgaard 외에 의해 제안 된 다른 방법에서., cis, 트랜스-Golgi 마커 및 관심사의 단백질은에 트리플 표시 nocodazole 골 지 미니-스택, GLIM와 비슷한 취급. 각 골 미니 스택 내 3 최대 강도 픽셀의 위치를 인수 하 고 테스트 단백질의 상대적 위치는 거리 비율18로 계산 됩니다. 그러나, 그들의 방법은 크게 제한 응용 프로그램 하위 픽셀 해상도 달성 하기 위해 수 없습니다. 이전 양적 방법, GLIM, 독립적으로 개발 되었다 그러나 곰 Dejgaard 외의 비슷한 개념에 비해., 전례가 없는 정확도와 일관성 Golgi 단백질의 축 지역화를 정할 수 있다.
우리는 것 표현된 GFP 태그 단백질-TPST1-EGFP LQ를 얻으려고 GLIM의 프로토콜을 제시. 내 생 단백질의 LQ는 항 체는 사용할 수 있는 경우 확인할 수 있습니다. 1 차적인 항 체, 마우스 또는 토끼, 토끼 또는 마우스 안티-GM130 항 체의 종류에 따라 각각 사용할 수 있습니다 트리플 라벨 프로토콜. 토끼와 마우스 안티-GM130 항 체 면역 형광 라벨에 대 한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리는 이전 토끼와 마우스 안티-GM130 항 체 GLIM7에서 동일한 결과 줄을 증명 하고있다. 만약 테스트 단백질은 본질적으로 빨간색 형광 방출, mCherry 퓨전, GM130 항 체 라벨와 함께에서 알려진된 LQ와 마커 단백질 트리플 레이블 셀에 사용 하 고 테스트 단백질의 LQ를 직접 추론할 수 GFP 태그 골 등 이다. 마커 단백질의 가정 LQ LQm 이며 GM130의 마커 단백질의 중심 으로부터 거리 dm, LQ는 테스트 단백질의 x (dx/dm) × LQm로 산출 될 수 있다. 슈퍼 해상도 현미경에 비해 GLIM의 가장 큰 장점 중 하나입니다 그것은 쉽게 기존의 미세한 설정에서 라이브 셀 이미징에 적용할 수 있습니다. 우리는 LQ의 GFP-Golgin84 단일 골 미니 스택7동적으로 모니터링에 대 한 3 개의 형광 단백질, GFP-Golgin84, mCherry GM130, 갈 트-iRFP670의 조합을 노력 했다.
GLIM, 가장 시간이 많이 걸리는 단계에서는 analyzable 골 미니-스택 선택에 특히 후 수집 분석입니다. 골 지 미니-스택 크기와 분자 구성19이종은, 그것은 분명 LQs (그림 3 층)의 분포 골 미니-스택의 이기종 아키텍처 또는의 우리의 계산의 불확실성을 나타내는 경우는 LQ입니다. 원인에 우리 때 n은 작은 타협은 analyzable 골 미니-스택 (n) LQ의 정확도 보장 하기 위해 다 수 중요 하다는 것을 발견. 일반적으로, n ≥ 100 여러 셀에서 데이터는 신뢰할 수 있는 LQs를 생성합니다. 따라서, GLIM 골 지 미니-스택 개성 왜곡 앙상블 평균 지역화 데이터를 제공 합니다. GLIM의 또 다른 한계는 모든 골 단백질 단일 센터 주위는 좁은 분포는 가정 이다. COPI 소 단위, ARF1 및 수용 성 N-ethylmaleimide-민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (SNAREs)20,21, 같은 일부 골 단백질, 트랜스- cis 에서 광범위 하 게 배포 보고 되었습니다. 골 고는 TGN입니다. 아마는 LQ에 의해 그들의 골 지 방화 연구를 적합 하지 않다. GLIM는 현재 모두 힘들고 주관적입니다 Golgi 미니-스택, 수동 선택 포함 최소한의 인간의 간섭으로 Golgi 미니-스택 자동으로 선택 하는 소프트웨어 도구를 구현 하 GLIM의 미래 발전 될 것입니다.
GLIM의 공간적 해상도 무엇입니까? LQ는 비율을 단위 이므로 공간 거리를 나타내지 않습니다. 여기, 우리는 매우 거칠게 추정을 제공 하려고 합니다. GLIM의 공간 해상도 두 확인할 Golgi 단백질 사이의 작은 축 거리도 정의할 수 있습니다. 우리 주위에 0.03 n ≥ 100 범위와 데이터 집합의 SEMs 발견 다양 한 골 단백질7의 LQs를 검사. 가정 두 골 단백질 같은 n 100과 sem의 = 0.03, 단백질에 의해 중요 한 다른 지역화는 두 골 = t-검정 (p < 0.05), 즉, 확인, 그들의 LQs 사이의 차이점은 ≥ 3 × sem의 경우 = 0.09. EM 데이터에서 우리는 또한 GM130에서 GLIM에 갈-mCherry 거리, 골 지 미니 스택의 축 길이 예상할 수 있습니다 ~ 300 nm8. 따라서, GLIM의 해상도 0.09 × 300 = 30 추정 골 축 nm. GLIM에서 큰 n 일반적으로 작은 SEM를 차례로 더 높은 해상도 얻을 수 있습니다.
아마 후자의 기법 양적 현지화 데이터를 직접 생성 하지 않습니다 이후 면역-골드 그들의 GLIM의 해상도 직접 비교를 적합 하지 않다. GLIM와 마찬가지로 골 축 면역-골드 그들의 해상도 수로 정의할 수 두 확인 Golgi 마커 사이의 작은 거리. 해상도 측정 하 골 축을 따라 서로 밀접 하 게 인접 한 두 골 지 단백질의 듀얼-면역-골드 라벨의 연구가 필요 합니다. 이러한 조직의 연구 아마 우리의 지식에 따라 제공 되지 않습니다. 면역-골드 그들의 공간 해상도에 제한 요소 중 하나는 해상도 보다 더 나쁜 것을 시키는 항 체 복잡 한의 큰 크기 소개에서 설명 했 듯이, ~ 20 nm. 이미지 해상도의 또 다른 중요 한 제한 요인은 항 원 분자의 라벨 밀도입니다. 나이 키스 트 샘플링 이론에 따르면 해상도 단위 당 금 입자를 두 개 이상 있어야 합니다. 대부분의 면역-골드 EM 연구에서 이웃 금 입자 사이 거리는 매우 낮은 인 < 15 nm 하지 라벨 효율성; 이것은이 기술이 30 보다 작은 이미지 해상도 달성 하기 어려운 nm. 이 관점에서 우리는 GLIM의 해상도 적어도 면역-골드 그들의 예상.
GLIM 높게 일관 된 결과 제공 하는 강력한 방법입니다. 그것은 사용 하는 현미경의 종류의 독립입니다. 같은 결과가 나왔고 그 넓은 필드와 회전 디스크 confocal 현미경 테스트 했습니다. 실험의 다른 배치에서 인수 같은 골 단백질의 LQs 서로와 좋은 계약에 또한 있었다. 다양 한 골 주민 단백질의 구성 된 LQ 데이터베이스 비교 및 해석에 대 한 생성 되었습니다. 우리는 연구 커뮤니티에서 GLIM의 더 많은 사용 데이터베이스 확장 크게 것입니다 기대 합니다. 따라서, 양적 Golgi 단백질의 많은 수의 지역화를 설명 하는 자세한 데이터베이스 조직 그리고 Golgi 단지의 기능을 이해에 크게 도움이 됩니다.

골 복잡 한 포유류 세포1,2,3분 비/endocytic 단백질과 지질 (이 화물)의 인신 매매에 필수적인 역할을 재생 합니다. 골에서 화물은 다양 한 하위 세포질 구획 정렬 뿐만 아니라 또한 다양 한 유형의 glycosylation 수정. 포유류 골 복잡 한 일반적으로 구성 된 4-11 밀접 하 게 인접 하 고 평평한 막 낭 cisternae 라는 수많은 옆으로 연결 된 골 스택 구성 되어 있습니다. 순차적으로 누적된 골 cisternae 더로 분류 됩니다, 다른 한쪽 끝에서 cis, 중간 및 트랜스-cisternae. 트랜스에서-Golgi 스택, 트랜스의 측면-대부분 막 sac 트랜스라고 하는 관 및 그물 막 네트워크로 개발-Golgi 네트워크 (TGN)4. 분 비 통로에서 바인딩과 그물 (응급실)에서 파생 된 화물의 cis에 Golgi 스택에 입력-측면 및 다음 순차적으로 통과 중간 및 트랜스-cisternae. 화물 결국 종료 트랜스에서 골-골 또는 TGN destining 원형질 막, endosomes 또는 분 비과 립.
어떻게 화물 운송 Golgi 스택 및 어떻게는 Golgi의 cisternal 조직 유지의 분자 및 세포 메커니즘 신비로운 남아 있다 고 현재 열띤된 토론1의 밑에 아직도. 이 분야에 있는 어려움 중 하나는 Golgi cisternae만 확인할 수 전자 현미경 (EM) 아래는 광학 현미경의 해상도 때문입니다 (~ 200 nm) 개별 Golgi cisternae 두 cisternal 두께에서 (< 100 nm를 해결 하기 위해 충분 하지 않습니다 그리고 거리)입니다. 따라서, 거주 단백질과 외계 화물의 하위 Golgi 지역화 통상 면역-골드 EM에 의해 결정 됩니다. 그러나, 면역-골드 그들은 매우 기술적으로 요구 하 고 그것은 대부분의 세포 생물학 실험실의 기능. EM의 해상도 하위 나노미터 수 면역-골드 엠에서 제공 하는 해상도 크게 복잡 한 항 체의 크기 (1 차 및 이차 항 체)와 금 입자에 의해 방해 하 고 20 보다 더 나쁠 수 있다 nm. 또한, EM 이미지 2D 얇은-섹션 대신 상대 위치 및 2D 섹션5의 방향에 따라 잘못 된 결론에 발생할 수 있습니다 골의 3 차원 세계 보기에서에서 얻을 수 있습니다. 예를 들어 EM 단일 섹션 공부 아니다 안정적으로 구별할 수 있는 소포는 관의 직교 보기 때문에 둘 다 동일한 라운드 막 프로필을 표시할 수 있습니다. 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM) 같은 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술의 최근 출현 자극 방출 소모 (호텔 위치), photoactivated 지역화 현미경 (팜)와 추계 광 재건 현미경 ( 폭풍), 가벼운 현미경6에서 하위 골 구조를 해결 하기 위해 가능 하 게. 그러나, 적어도 4 개의 단점이 크게는 Golgi의 세포 생물 학적 연구에 그들의 사용을 제한할 수 있습니다. 1) 현재 슈퍼 해상도 기법 대부분 세포 생물학 실험실 넘어는 비싸고 특별 한 하드웨어 구성이 필요 합니다. 2) 특별 한 형광 라벨 프로토콜 슈퍼 해상도 기법 필요 합니다. 최고의 조건 하에서 이러한 기술을 공간 해상도에 20-110 nm 주장, 3) 하지만, 실제 샘플에서 얻은 실용적인 해상도 훨씬 더 수 있습니다. 4) 비교에 전통적인 현미경 검사 법, 이러한 슈퍼 해상도 기법 여전히 어려움에서 다 색, 3D 또는 라이브 셀 이미징, 단독으로 또는 조합에서. 아마 가장 중요 한 것은, 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술 및 면역-골드 그들 항복 질적 양적 지역화 데이터 대신.
부분적으로 위에서 언급 한 문제를 해결 하려고, 우리는 최근 개발 센터의 질량 (GLIM), 체계적이 고 양적 지역화는 골을 이미징 하 여 골 단백질 지 방화 라는 기반으로 하는 기존의 가벼운 현미경 검사 법 방법 면역-골드 엠7의 동일한 해상도에서 단백질. 이 방법에서는, 경작된 한 포유류 세포에서 골은 골 지 미니-스택으로 nocodazole, microtubule depolymerizing 약물의 치료에 의해 분산 됩니다. 광범위 한 학문은 nocodazole 유도 골 미니-스택 (이 골 지 미니-스택)에 유사한 조직에 세포 기능8,,910, 기본 골 더미는 설명 했다 11. 테스트 단백질의 지역화 지 수 (LQ) GLIM 통해 취득 될 수 있다 그리고 그것은 양적 하위-Golgi 지역화를 나타냅니다. LQs의 숫자 값을 비교할 수 있습니다 하 고 25 개 이상의 골 마커의 LQ 데이터베이스 사용할 수 있다.
GLIM, 골 지 미니-스택 트리플 생 또는 것 표현 GM130, 갈 트 mCherry 및 테스트 단백질 (x)에 의해 표시 된 있습니다. GM130와 갈 트-mCherry, cis-및 트랜스-Golgi 마커 각각12,13, 제공 참조 포인트. 트리플 형광, 빨강 (R), 녹색 (G), 빨강 (B), 인위적으로 각각 빨강, 녹색 및 파랑으로 표시 됩니다. 형광 질량 (이 하 센터)의 센터 하위 픽셀 해상도 달성 하기 위하여 채택 된다. 골 축 GalT mCherry의 GM130의 센터에서 벡터로 정의 됩니다. 골 지 미니 스택 Golgi 축을 무한 회전 대칭 구조를 원통형으로 모델링 됩니다. 따라서, 골 지 미니 스택 골 축 1 차원 구조 더 모델링 될 수 있습니다. LQ 테스트 단백질의 x dx/d1, 있는 dx GM130의 x의 중심 으로부터 거리 d1 은 GM130의 갈 트 mCherry의 센터에서 거리로 정의 됩니다. X의 중심 축에서 인 경우에, 그것의 프로젝션 축 거리 계산을 위해 사용 됩니다. 골 축, 축 각도, dx, d1, 각도 α와 각도 β를 포함 하 여 GLIM에 대 한 변수는 그림 1에서 개요로 설명 된다. LQ는 Golgi 미니-스택 방향 셀에 무작위로 비록 골 축 각도 무관 합니다.
골 지 미니-스택 휘도가 이미지에 나타납니다. 우리는 GLIM에 대 한 analyzable 골 미니-스택 선택 하 세 기준 개발. 골 지 미니 스택 백그라운드의 표준 편차 (SD)의 총 강도의 비율 ≥ 30 각 채널에는, 1)는 신호 대 잡음 비율 기준. 이 표준은 골 미니-스택의 신호 대 잡음 비율에 달려 있는 질량의 중심의 위치 정확도 지키기 위하여 이다. 2) 축 각도 또는 거리 기준을는 d1≥ 70 nm. d1 골 축 각도의 증가 함께 감소합니다. 때 축 각도 90 °에 도달 또는 수직, 미니 스택 d1 으로 확인할 수 없는 0에 접근 하는. d1≥ 70 nm 세로 골 지 미니-스택 근처 효과적으로 제외할 수 있습니다. 어느 하나에서 3) co 선형성 기준 | α 탄 | 또는 | β 탄 | ≤ 0.3입니다. 이 기준 미니 스택 세 센터는 골 지 미니 스택 1 차원 모델에 대 한 공동 선형 충분히 보장 합니다. 모든 가벼운 현미경 빨강, 녹색 및 빨강 형광 센터의 상대적 위치를 왜곡 심각 하 게 수 있는 색수차에서 고통. 색수차 현미경 시스템의 실험적으로 110 nm 구슬, 트리플-이라고 표시 된 빨간색, 녹색 및 빨강 형광을 이미징 하 여 보정 됩니다. 각 구슬 이미지에 대 한 레드의 중심은 구슬의 진정한 위치도 정의 하며 반음계 녹색과 빨강 센터의 교대 있습니다 1 차 다항식 함수. 골 지 미니-스택 센터 녹색 및 빨강 채널의 색채 변화를 해결 하기 위해 다항식 함수를 받게 됩니다.
GLIM 통해 우리의 해상도 얻을 수 있습니다 ~ 30 nm 표준 조건 하에서 골 축. 중요 한 것은, 양적 어떤 골 단백질 지도 하는 체계적인 방법을 제공 합니다. GLIM는 넓은 필드와 같은 기존의 현미경 또는 confocal 현미경, 일반적인 형광 라벨 프로토콜을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이미징 및 데이터 처리는 짧은 한 시간 걸릴 수 있습니다. GLIM를 통해 우리는 직접 증명 분 비 화물의 진보적인 전환에서 cis- 트랜스-7골 측면.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl67">fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">T7279</td>
			<td class="xl67">As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Glass coverslip &#934; 12 mm (No. 1.5)</td>
			<td class="xl67">Menzel</td>
			<td class="xl75">CB00120RAC</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Glass coverslip &#934; 25 mm (No. 1.5)</td>
			<td class="xl67">Menzel</td>
			<td class="xl75"></td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">DMEM</td>
			<td class="xl67">Capricon</td>
			<td class="xl75">DMEM-HPA-P50</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl67"></td>
			<td class="xl75"></td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">FBS</td>
			<td class="xl67">GE Hyclone</td>
			<td class="xl75">SV30160.03</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Nocodazole</td>
			<td class="xl67">Merck</td>
			<td class="xl75">487928</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">11668-019</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">transfection medium. Commercial name: OptiMEM</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">31985070</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">TPST1-EGFP</td>
			<td class="xl67">Addgene</td>
			<td class="xl75">66617</td>
			<td class="xl67">A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">GalT-mCherry</td>
			<td class="xl67"></td>
			<td class="xl75"></td>
			<td class="xl67">Made in our lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">paraformaldehyde</td>
			<td class="xl67">Merck</td>
			<td class="xl75">1.04005.1000</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">saponin</td>
			<td class="xl67">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl75">47036</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488</td>
			<td class="xl67">CALBIOCHEM</td>
			<td class="xl75">475904</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">BSA</td>
			<td class="xl67">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl75">A9647</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Mouse anti-GM130</td>
			<td class="xl67">BD Biosciences</td>
			<td class="xl75">610823</td>
			<td class="xl67">Primary antibody for human GM130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">A-21235</td>
			<td class="xl67">Far red fluorescence conjugated secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative localization of a golgi protein by imaging its center of fluorescence mass

Cis를 포함 하 여 하위 골 지역으로 더 분류 될 수 있다 직렬 스택된 막 cisternae 골 복잡 한 구성-골, 중간-골, 트랜스-골 및 트랜스-Golgi 네트워크. 골 세포 기능 그것의 거주 단백질의 특성 분포에 의해 결정 됩니다. 기존의 가벼운 현미경의 공간 해상도 하위 골 구조 또는 cisternae 해결 하려면 너무 낮습니다. 따라서, 면역-골드 전자 현미경 지역화 하위 골 수준에서 단백질을 선택 하는 방법 이다. 그러나, 기술과 악기는 대부분 세포 생물학 실험실의 기능을 넘어. 여기 이미징 센터의 질량 (GLIM) 체계적이 고 양적 Golgi 단백질을 지역화 하 여 골 단백질 지 방화 라는 우리의 최근에 개발한 슈퍼 해상도 방법을 설명 합니다. GLIM 표준 형광 라벨 프로토콜 및 일반적인 넓은 필드 또는 confocal 현미경을 기반으로 합니다. 그것은 현미경 시스템, 이미지 수집 및 사후 수집 분석의 시프트 반음계 수 차 보정을 포함 한다. 테스트의 하위 Golgi 지역화 지역화 몫으로 양적 표현 된다. GLIM;의 4 개 주요 이점이 있다 그것은 급속 한, 전통적인 방법과 도구에 따라, 지역화 결과 양적, 그리고 요 극 ~ 골 축 30 nm 실용적인 해상도. 여기는 지역화 테스트 Golgi 단백질 GLIM의 상세한 프로토콜에 설명 합니다.

우리 실험실에서 사용 하는 것과 같은 계획 apochromatic 렌즈를 갖춘 현대 연구 급료 가벼운 현미경 최소한의 색수차 (그림 2A)를 보여줍니다. 그러나, 다 색 형광 구슬 이미지의 주의 깊은 검사는 같은 구슬 (그림 2B)의 다른 컬러 이미지의 변화를 알아낼 수 있습니다. 빨강 채널 색수차의 무료 이며 따라서 빨간색 형광의 센터는 구슬의 진정한 위치를 정의 합니다. 녹색과 빨강 형광의 상대 반음계 교대 붉은 형광 (그림 2C)의 중심에서 발생 하는 녹색 및 파랑 벡터에 의해 나타낼 수 있습니다. 이미징-비행기 내에서 반음계 시프트 경험적으로 각 구슬 (그림 2D)에 대 한 녹색 및 파랑 벡터 그림입니다. 우리의 현미경에 대 한 색채 변화 균일 하지 않습니다 크기와 x에 따라 교대 변경의 방향 및 y 위치. 반음계 시프트 크게 영향을 미칠 수 GLIM의 정확도 빨강 센터의 변화 수로 50 nm. 따라서 색채 변화를 수정 해야 합니다. 구슬의 센터는 획득 되 면 우리 처음 주문 다항식 피팅 보정 후 센터의 색채 변화를 해결 하기 위해 사용 합니다. 이 방법은 (그림 2 D-G) 시프트 반음계 수 차 크게 향상 됩니다.
포유류 세포에서 골 복잡 한은 일반적으로 기존의 광학 현미경 (그림 3A) 확인할 perinuclear 지역에서 집계 됩니다. Nocodazole 치료 후 3 시간 동안, perinuclear 골 복잡 사라진다 고 수십 골 미니-스택 (그림 3B) 세포질 걸쳐 바인딩과 그물 출구 사이트에서 조립. 골 막과 집계 골 미니-스택의 큰 덩어리는 존재 하 고 그들은 분석을 위해 선택 하지 않은. 골 지 미니-스택 선택 설명 예제 이미지는 그림 3C에 표시 됩니다. "매크로-Golgi ROI 검사" 도구, 40 선택한 골 지 미니 스택 그림 3D에 나열 사용 하. 세 가지 조건, 적용 한 후 21 골 미니-스택 되었고 analyzable LQs의 TPST1-EGFP 계산에 대 한 선택 (그림 3D; "L"로 표시), 그림 3E그들의 통계로. 총에서 111 analyzable 골 미니-스택 12 셀에서 선정 되었다과 TPST1 EGFP의 LQ는 0.76 0.04 측정 (평균 ± SEM; n = 111) (그림 3F). TPST1 EGFP의 LQ giantin 사이 그것의 위치 (LQ = 0.59) 및 EGFP Rab6 (LQ = 1.04)7. 그것은 GS15 근처 (LQ = 0.83) 및 ST6GalT1 AcGFP1 (LQ = 0.82). LQs에 따라 하위 Golgi 지역 문학에서 질적 현지화 데이터를 고려 하 여 정의: 당신은/ERGIC <-0.25; cis, 0.00 ± 0.25; 중간, 0.50 ± 0.25; 트랜스-골, 1.00 ± 0.25 및 TGN, 1.25-2.00. TPST1 EGFP의 LQ는 그러므로 그것의 트랜스를 나타냅니다-14이전 연구는 Golgi 지역화.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig1.jpg"> 그림 1 . GLIM의 계산에 사용 되는 변수를 보여주는 도식 일러스트. (A) xz 보기 GM130, 갈 트 mCherry 및 단백질의 동축 센터가 골 미니 스택의 보여주는 골 축, 축 각도, dx d1형광 x. 골 지 미니 스택의 이미지 이미지 평면에의 투영 이다. 꺼짐-축 축 각도 α, 각도 β 및 프로젝션 보여주는 x 단백질의 센터와 골 지 미니 스택 (B) xy 보기 dx거리. A 와 B 각각 그림 1E 와 우리의 이전 간행물7 그림 1F 에서 적응 됩니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55996/55996fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig2.jpg"> 그림 2 . 반음계 교대의 수정. (A)는 넓은 필드 현미경에 의해 인수 110 nm 다 색 구슬의 3 색 병합 된 이미지. 각 구슬 방출 녹색, 빨강, 및 빨강 (인공적으로 착 색 된 파랑으로) 형광. 눈금 막대, 10 µ m. (B) 확대 보기 눈에 띄는 색채 시프트와 병합 된 단일 구슬 이미지의. 스케일 바, 200 nm. (C) 회로도 녹색 및 빨강 구슬 이미지의 교대도 나타낼 수 있습니다 벡터 빨간 구슬 이미지 (0, 0)의 중심에서 녹색 (녹색 벡터)와 빨강 (블루 벡터) 구슬 이미지의 중심을 각각 보여주는. (D, E) 반음계 시프트 교정의 효과입니다. 필드 내에 같은 이미지의, 녹색 및 파랑 벡터 전에 그려집니다 고 후 보정을 이동. 작은 변화를 시각화 하려면 각 벡터의 크기는 200-fold 증폭. (F, G) 시프트 보정 전후 녹색 (녹색 점), 빨강 (파란색 점) 구슬의 센터를 표시 하는 음모를 피해 라. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55996/55996fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig3.jpg"> 그림 3 . GLIM, 여기 TPST1 EGFP LQ 취득의 전형적인 예. 헬러 세포 TPST1-EGFP (녹색)와 갈 트-mCherry (레드) (블루) 생 GM130에 대 한 얼룩 했다. (A) A 일반 셀입니다. (B, C, D, E) Nocodazole 치료 셀은 몇 군데 (B). 이미지에서 analyzable 골 미니-스택 C와 같이 선정 되었다. 선택 된 골 지 미니-스택 식별 번호로 표시 되어 있습니다. 이러한 마스크 골 미니-스택 이미지 D 그들의 식별 번호 아래 표시 됩니다. "L" LQ (analyzable 골 미니 스택)의 계산에 대 한 골 지 미니 스택 올바른지를 나타냅니다. 셀에서 21 미니-스택 LQs의 히스토그램에 에서표시 됩니다. (F) 히스토그램의 LQs 111 미니-12 셀에서 스택. 히스토그램에 표시 된 값은 평균 ± SEM. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55996/55996fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 자료: 매크로-골 아 inspection.ijm, 매크로 출력 3 채널 data.ijm, Matlab 코드, My_train.exe, My_test.exe, 및 스프레드시트 template.opj.

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Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

quantitative-localization-golgi-protein-imaging-its-center

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K 조회수.  Nanyang Technological University. 골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

연구

생물학

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.