我々 はソフトウェアの最適化を助けるため TPST1 EGFP DNA のプラスミッドとしてラクシュミ Narasimhan Govindarajan D. ステファン (ブリストルの大学, ブリストル, イギリス) を感謝したいです。この作業は、l. l. に国立の医療研究評議会 (ナノ材研/CBRG/007/2012 年)、文部省 (AcRF Tier1 RG 18/11、RG 48/13 と RG132/15 AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) からの助成金によって支えられました。

<ol>
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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

以前は、光学顕微鏡のゴルジ体蛋白質のローカリゼーション主の相関または蛋白質の画像とローカリゼーションの既知15,16、ゴルジ体マーカーの画像の重なりの度合いによって定量化を行った 17。結果の相関関係または重複度係数は、どれだけ近いテスト タンパク質はゴルジ体のマーカーに空間的反映されます。このアプローチのために少なくとも 3 つの注意事項があります。まず、相関関係や重複度係数は非線形とは直接の空間的距離を示しません。第二に、相関度は顕微鏡の解像度に大きく依存します。したがって、2 つのゴルジ体のタンパク質間の係数は、システムに依存しない定数ではありません。第三に、同じ軸ローカリゼーション cisternae 分布の異なる側面が 2 つのゴルジ体タンパク質が異なる係数を持つことができます。したがって、相関関係や重複度係数軸ゴルジ タンパク質局在は示されません。Dejgaardらによって提案された方法で。、 cis、 trans-ゴルジ マーカーおよび興味の蛋白質はのトリプル ラベル ノコダゾール扱わゴルジ ミニ スタック、かすかな光のよう。各ゴルジ ミニ スタック内の 3 つの最大輝度のピクセル位置を取得し、テスト蛋白質の相対的な位置の距離比18として計算されます。ただし、そのメソッドは大きくそのアプリケーションを制限するサブ ピクセルの解像度を達成することではありません。以前の定量法、かすかな光が独自に開発、Dejgaardらと似た概念をクマと比較します。、は前例のない正確さと一貫性とゴルジ体タンパク質の軸のローカリゼーションを定量化することができます。
外に表現された GFP 付けられた蛋白質 - TPST1 EGFP の LQ を取得するかすかな光のプロトコルを提案します。その抗体が利用可能な場合、内因性のタンパク質の LQ を決定ことができます。一次抗体、マウスやウサギ、ウサギまたはマウス抗商品番号:gm130 抗体の種に応じて、それぞれで使えるトリプル分類のプロトコル。蛍光ラベリングのウサギとマウスの両方の対策商品番号:gm130 抗体が市販されています。我々 は以前、ウサギとマウス抗商品番号:gm130 抗体がかすかな光7では同じ結果を与えることを実証しました。場合テスト蛋白質は mCherry 融合、GFP タグのゴルジ商品番号:gm130 抗体の分類との組み合わせで知られている LQ がマーカー蛋白質がトリプル ラベルのセルを使用してテスト蛋白質の LQ を直接推論などの蛍光性の放出で本質的に赤です。マーカー蛋白質の LQ が LQm商品番号:gm130 のマーカー蛋白質の中心からの距離は dm、LQ テスト蛋白質の x (x/dm) × LQmとして計算できます。超解像顕微鏡法と比較してかすかな光の最大の利点の 1 つは、それは簡単に、従来の顕微鏡のセットアップでライブセル イメージングに適用することができますです。我々 は、LQ の GFP-Golgin84 単一ゴルジ ミニ スタック7を動的に監視するため、GFP Golgin84、mCherry 商品番号:gm130、GalT-iRFP670、3 つの蛍光タンパク質の組み合わせを試みた。
かすかな光、最も時間がかかるステップは買収後の分析は、分析可能なゴルジ ミニ スタックの選択に特にです。LQs (図 3 f) の分布はゴルジ ミニ スタックの異種のアーキテクチャまたはの私達の計算の不確かさを表す場合は明らかだゴルジ ミニ スタックのサイズの分子組成19異種とおり、LQ。原因を問わず n が小さい場合に侵害分析可能なゴルジ ミニ ・ スタック (n)、LQ の精度を確保するための多数を持っていることが重要だとわかりました。通常、n ≥ 100 複数のセルからのデータは、信頼性の高い LQs を生みます。したがって、かすかな光は、ゴルジ ミニ スタックの個性を隠すことのアンサンブル平均ローカリゼーション データを与えます。かすかな光のもう一つの制限は、すべてのゴルジ体タンパク質単一の中心のまわりの狭い分布をある前提があります。トランス-シスから広く配布するコピ サブユニット、ARF1 可溶性 N エチルマレイミド感受性因子添付ファイル蛋白質受容体 (スネア)20,21, などのいくつかのゴルジ体タンパク質が報告されています。ゴルジと、TGN。それは LQ で、ゴルジのローカリゼーションを調査するおそらく適していません。かすかな光は、現在は骨の折れる、主観的、ゴルジ ミニ スタックの手動の選択を含むようかすかな光の将来の発展は人間の干渉を抑えたゴルジ ミニ スタックを自動的に選択するソフトウェア ツールを実装すること。
かすかな光の空間分解能とは何ですか。LQ は比、単位であるので、空間距離は示しません。ここでは、非常に大まかな見積もりを与えることを試みた。かすかな光の空間分解能は 2 つの解決可能なゴルジ体タンパク質間最小軸距離として定義できます。N ≥ 100 範囲 0.03 周りでデータセットの SEMs 様々 なゴルジ体タンパク質7の LQs を調べると、分かった。2 ゴルジ体のタンパク質は、同じ n を持っていると仮定すると = 100 と SEM = 0.03、蛋白質によってかなり異なる局在がある 2 つのゴルジt 検定(p < 0.05)、すなわち、解決、LQs の違いが ≥ 3 × SEM = 0.09。商品番号:gm130 からかすかな光でゴルト mCherry までの距離はまた、ゴルジ ミニ スタックの軸の長さである EM データから推定できる ~ 300 nm8。それ故に、かすかな光の解像度は、0.09 × 300 = 30 と推定されるゴルジ体軸に沿って nm。かすかな光、n が大きいほど一般的に小さい SEM の場合より高い解像度で、結果が生成されます。
おそらく後者の手法が定量的なローカリゼーション データを直接生成されませんので直接免疫金 EM のかすかな光の解像度を比較すると不適切なもの。かすかな光と同様に、ゴルジ体軸に沿って免疫金 EM の解像度は、2 つの解決可能なゴルジ マーカー間の最小の距離として定義できます。その解像度を測定するためのデュアル免疫金標識ゴルジ体軸に沿って互いに密接に隣接している 2 つのゴルジ体のタンパク質の研究が必要です。このような全身性の研究は我々 の知識によるとおそらく利用できません。導入部分で説明したように免疫金 EM の空間分解能の制限要因の一つはより悪化する解像度になる抗体の複雑な大きいサイズ ~ 20 nm。画像解像度の別の重要な制限要因は抗原分子のラベリングの密度です。ナイキスト サンプリング理論によると解像度の単位あたりの少なくとも 2 つの金粒子があります。ほとんどの免疫金 EM 研究隣人金粒子間距離、非常に低いためありません < 15 nm の効率をラベリングします。これは難しく 30 未満の画像の解像度を達成するためにこの手法の nm。このような観点から、かすかな光の解像度は、少なくとも免疫金 EM に匹敵する推定します。
かすかな光は、非常に一貫した結果を与える堅牢な方法です。顕微鏡使用の種類に依存しないです。私たちは、同じ結果が得られた、広視野と回転のディスク共焦点顕微鏡をテストしています。実験の別のバッチを取得同じゴルジ体蛋白質の LQs もお互いによく一致しました。比較とその解釈の多様な範囲のゴルジ常駐タンパク質から成る LQ データベースが生成されました。かすかな光の研究コミュニティのより多くの使用がデータベースを大幅拡大することを見込んでいます。その結果、多数のゴルジ体蛋白質のローカリゼーションを定量的記述するより完全なデータベースは、組織とゴルジ複合体の機能の理解に大きく役立ちます。

ゴルジ複合体は、哺乳類細胞1,2,3でタンパク質や脂質 (以下貨物) の分泌/エンドサイトーシス人身売買に必須の役割を果たしています。ゴルジ体、貨物だけでなく様々 な細胞内コンパートメントにソートしますが、グリコシル化反応の様々 な種類によっても変更します。哺乳類のゴルジ複合体は、通常から成っている 4-11 しっかりと隣接してフラット膜嚢 cisternae と呼ばれる多数の横に接続されているゴルジ スタックを構成されています。順次積み上げゴルジさらとして分類される、他の一方の端からcis内側、トランス-cisternae。トランスで-側ゴルジ スタック、トランス-トランスと呼ばれる管状、胞体膜ネットワークに発展するほとんどの膜嚢-ゴルジ ネットワーク (TGN)4。分泌経路の小胞体 (ER) から派生した貨物は、そのcisでゴルジ スタックを入力-側し、順次内側とトランスを通過-cisternae。貨物が最終的にトランスでゴルジを終了-ゴルジ体や TGN 膜、エンドソームまたは分泌顆粒に運命にあります。
貨物がゴルジ スタックを通過する方法とゴルジ装置がその大槽内の組織を維持する方法の分子・細胞メカニズムは謎のままし、激論1の下でまだ現在が。このフィールドの難しさの 1 つはゴルジのみ解決できることを電子顕微鏡検査 (EM) の下で光学顕微鏡の解像度から (~ 200 nm) 個々 のゴルジ (< 100 nm 両方の大槽内厚を解決するのに十分ではないです。距離)。したがって、居住者のタンパク質とトランジット貨物のサブ ゴルジ装置の局在は、従来免疫金 EM によって決まります。しかし、免疫金 EM は技術的に非常に難しく、それはほとんどの細胞生物学の実験室の能力を超えています。EM の解像度は、サブナノメータをすることができます、免疫金 EM によって与えられる解像度が大きく複雑な抗体 (一次および二次抗体) のサイズと金粒子によって妨げられて、それは 20 よりも悪化することができますが nm。さらに、EM 画像は相対的な位置と 2D 断面図5の向きによって誤った結論につながるゴルジ装置の 3 D 地球ビューではなく 2D 薄いセクションから取得されます。たとえば、EM の単一セクションの勉強は両方は同一ラウンド膜プロファイルを表示することができますので、確実に、尿細管の直交ビューから、小胞を区別することがないです。排出量の枯渇 (STED)、センサー ローカリゼーション顕微鏡 (パーム) と確率光再建顕微鏡 (刺激して 3 D 構造照明顕微鏡を用いて (3 D SIM) などの超解像顕微鏡技術の最近の出現嵐)、光顕微鏡6下サブ ゴルジ構造を解決することが可能になります。ただし、ゴルジ体の細胞生物学的研究の使用を大幅に制限することができます、少なくとも 4 つの欠点があります。1) 現在の超解像技術では、高価で特別なハードウェアの構成ほとんどの細胞生物学の実験室を超えている必要があります。2) 特別な蛍光ラベリング プロトコルは、いくつかの超解像技術に必要です。3) が、最高の条件の下でこれらの技術は 20 110 nm の空間分解能を主張、実際サンプルで得られた実用的な解像度が悪化することができます。4) 従来の顕微鏡で比較してこれらの超解像技術まだまたは問題がある実施で多色、3 D ライブ細胞イメージング、単独または組み合わせで。おそらく最も重要なは、免疫金 EM と超解像顕微鏡技術収量定性的定量的なローカリゼーション データの代わりに。
部分的に上記の問題を解決しようとして、我々 は最近 (かすかな光)、体系的にかつ定量的にゴルジをローカライズする質量の中心をイメージングによるゴルジ体蛋白質のローカリゼーションの名前は基づく従来の光学顕微鏡法を開発しました。免疫金 EM7と同等の解像度でタンパク質。この方法では培養された哺乳類細胞におけるゴルジ分散ゴルジ ミニ スタックとしてノコダゾール、微小管重合薬物の治療。広範な研究は、組織で細胞機能8,9,10、ネイティブのゴルジ スタックが近いノコダゾール誘起ゴルジ ミニ スタック (以下ゴルジ ミニ ・ スタック) を示しています。 11。テスト蛋白質のローカリゼーション商 (LQ) は、かすかな光を介して取得することができます、それは量的なサブ-ゴルジ装置の局在を表します。LQs の数値の値を比較することができます、以上 25 のゴルジ体マーカーの LQ データベースが利用されています。
かすかな光、ゴルジ ミニ スタックは、内因性あるいは外因表現商品番号:gm130、ゴールト mCherry テスト蛋白質 (x)、トリプル ラベルします。商品番号:gm130 と GalT-mCherry、 cis- および-ゴルジ マーカーそれぞれ1213,,の参照ポイントを提供します。トリプル蛍光、赤 (R)、緑 (G) と遠 (B) 人工的にそれぞれ赤、緑、青、として表示されます。蛍光質量 (以下、センター) の中心は、サブピクセルの解像度を達成するために採用しています。ゴルジ体の軸は、商品番号:gm130 のセンターからゴルト mCherry へのベクトルとして定義されます。ゴルジ ミニ スタックは、ゴルジ体軸周り無限の回転対称性を有する円筒構造としてモデル化されます。したがって、ゴルジ ミニ スタックは、ゴルジ体軸に沿って一次元構造としてさらにモデル化します。LQ テスト蛋白質の x はx/d1、d1は商品番号:gm130 の距離ゴルト mCherry センターからのxは、商品番号:gm130 の x の中心からの距離として定義されています。X の中心は軸を計算のための投影軸距離が使用されます。かすかな光のゴルジ体軸、軸角度、x、d1角度 α、角度 β を含む変数は、図 1に示す図式。LQ は、ゴルジ ミニ スタックのセルにランダムに向きがゴルジ体軸角の独立しています。
ゴルジ ミニ スタック表示画像で不均一です。かすかな光の解析可能なゴルジ ミニ スタックを選択するための 3 つの条件を開発しました。1) 信号対雑音比の基準、ゴルジ ミニ スタック バック グラウンドの標準偏差 (SD) の合計強度の比率は各チャンネルの ≥ 30。この条件は、ゴルジ ミニ スタックの信号対雑音比に依存する重心の位置決め精度を確保するためです。D1≥ 70 が必要です 2) 軸の角度または距離基準 nm。d1ゴルジ体軸角の増加と共に減少します。軸角が 90 ° に近づいているまたは垂直、ミニのスタックになります d1として解決可能な場合は、0 に近づいています。d1≥ 70 nm を垂直ゴルジ ミニ スタック近く効果的に除外できます。3) 直線性基準、いずれかに | α を日焼け |または | β を日焼け |≤ 0.3 です。この基準により、ミニ スタックの 3 つのセンターが十分に co ゴルジ ミニ スタックの 1 次元モデルの線形。すべて光顕微鏡は赤、緑および遠赤色蛍光中心の相対的な位置を歪めることができる真剣に色収差に苦しみます。顕微鏡システムの色収差を 110 nm のビーズがあり、赤、緑、遠赤色蛍光によるトリプル ラベルであるイメージングによる校正実験します。各ビーズ イメージの一次多項式関数によって緑と遠中心の波長シフトが施され、赤のセンターはビードの真の位置として定義されています。ゴルジ ミニ スタックの中心は、緑と遠のチャンネルの波長シフトを修正する多項式関数にさらされます。
かすかな光の解像度を実現することができます 〜 30 nm ゴルジ体軸の標準的な条件の下で。重要なは、定量的、ゴルジ体のタンパク質をマップする体系的な方法を提供します。かすかな光は、全体のフィールドなど、従来の顕微鏡や共焦点顕微鏡、蛍光ラベリングの共通のプロトコルを使用して実行できます。画像とデータ処理は、最短時間で取ることができます。かすかな光を直接を実証した分泌貨物の進歩的な移行からシス-トランス-ゴルジ7の側。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl67">fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">T7279</td>
			<td class="xl67">As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Glass coverslip &#934; 12 mm (No. 1.5)</td>
			<td class="xl67">Menzel</td>
			<td class="xl75">CB00120RAC</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Glass coverslip &#934; 25 mm (No. 1.5)</td>
			<td class="xl67">Menzel</td>
			<td class="xl75"></td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">DMEM</td>
			<td class="xl67">Capricon</td>
			<td class="xl75">DMEM-HPA-P50</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl67"></td>
			<td class="xl75"></td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">FBS</td>
			<td class="xl67">GE Hyclone</td>
			<td class="xl75">SV30160.03</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Nocodazole</td>
			<td class="xl67">Merck</td>
			<td class="xl75">487928</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">11668-019</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">transfection medium. Commercial name: OptiMEM</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">31985070</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">TPST1-EGFP</td>
			<td class="xl67">Addgene</td>
			<td class="xl75">66617</td>
			<td class="xl67">A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">GalT-mCherry</td>
			<td class="xl67"></td>
			<td class="xl75"></td>
			<td class="xl67">Made in our lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">paraformaldehyde</td>
			<td class="xl67">Merck</td>
			<td class="xl75">1.04005.1000</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">saponin</td>
			<td class="xl67">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl75">47036</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488</td>
			<td class="xl67">CALBIOCHEM</td>
			<td class="xl75">475904</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">BSA</td>
			<td class="xl67">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl75">A9647</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Mouse anti-GM130</td>
			<td class="xl67">BD Biosciences</td>
			<td class="xl75">610823</td>
			<td class="xl67">Primary antibody for human GM130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">A-21235</td>
			<td class="xl67">Far red fluorescence conjugated secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative localization of a golgi protein by imaging its center of fluorescence mass

ゴルジ複合体から成っているcisを含むサブ ゴルジ領域にさらに分類できる直列積層膜 cisternae-ゴルジ、内側-ゴルジ体トランス-ゴルジとトランス-ゴルジ ネットワーク。細胞ゴルジ装置の機能は、その居住者のタンパク質の分布特性によって決定されます。従来の光学顕微鏡の空間分解能が小さすぎるため、サブ ゴルジ構造または cisternae 解決。したがって、免疫金電子顕微鏡はサブ ゴルジ体レベルでタンパク質をローカライズする選択の方法です。しかし、技術と楽器はほとんどの細胞生物学の実験室の能力を超えるです。ここで質量の中心 (かすかな光) 体系的かつ定量的ローカライズ ゴルジ体のタンパク質のイメージングによるゴルジ体蛋白質のローカリゼーションと呼ばれる最近開発された超解像手法について述べる。かすかな光は、共焦点顕微鏡や従来の広視野標準蛍光ラベリング プロトコルに基づいています。それは顕微鏡システム、画像の取得と取得後解析波長シフト収差の校正を含みます。テスト蛋白質のサブ ゴルジ装置の局在は定量的局在商として表されます。かすかな光の 4 つの主な利点があります。それは急速に従来の方法とツールに基づいて、ローカライズ結果は定量的、それを与える 〜 ゴルジ体軸に沿って 30 nm 実用的な解像度。ここでテストのゴルジ体のタンパク質をローカライズするかすかな光の詳しいプロトコルについて述べる。

私たちの研究室で使用されるなど、計画のアポクロマート レンズを搭載した現代の研究グレード光顕微鏡は、最小限の色収差 (図 2A) を示しています。ただし、マルチカラー蛍光ビーズ画像の精査は、同じビーズ (図 2B) の異なるカラー画像のシフトを明らかにできます。我々 は、赤のチャネルが色収差の無料したがって赤い蛍光性の中心は、ビーズの本当の位置を定義します。緑と遠赤色蛍光の相対的な波長シフトは、赤い蛍光性 (図 2C) の中心から発信された緑および青のベクトルで表現できます。画像平面内で波長シフト経験的各ビーズ (図 2D) に緑および青のベクトルによって示されています。我々 の顕微鏡の波長シフトは、大きさと x によるとシフト変更の方向は統一でされていないおよび y 位置。波長シフトがかすかな光の精度に影響する大幅遠中心のシフトはできる限り 50 nm。したがって波長シフトを修正する必要があります。ビーズのセンターが取得されると、我々 は一次多項式フィッティングを調整し、その後センターの波長シフトを修正を採用しています。このアプローチ (図 2 D G) して波長シフト収差を大幅に向上します。
哺乳類細胞におけるゴルジ複合体が通常従来の光学顕微鏡 (図 3A) で解決できない核領域に集計されます。3 時間ノコダゾール治療後ゴルジ複合体の核が消え、ゴルジ ミニ スタックの数十を細胞質 (図 3B) 小胞体出口各地で組み立てます。ゴルジ膜と集約されたゴルジ ミニ スタックの大きな塊が存在し、彼らが分析のために選択されていません。図 3Cにゴルジ ミニ スタックの選択を示す例を示します。図 3Dミニ スタックのとおり 40 選択したゴルジ「マクロ ゴルジ投資収益率検査」ツールを使用してください。3 つの条件を適用すると、21 ゴルジ ミニ スタックが分析できると計算 TPST1 EGFP の LQs の選ばれた (図 3D;"L"としてラベル付け)、図 3Eに示すように、統計情報付き。12 セルから選ばれた合計 111 解析可能なゴルジ ミニ スタックと TPST1 EGFP LQ 0.76 0.04 と測定 (平均 ± SEM; n = 111) (図 3F)。TPST1 EGFP LQ giantin 間配置 (LQ = 0.59) と EGFP Rab6 (LQ = 1.04)7。それは GS15 近く (LQ = 0.83) と ST6GalT1 AcGFP1 (LQ = 0.82)。文学から質的なローカライズ データを考慮した LQs によるとサブ ゴルジ領域を定義した: ERES/ERGIC <-0.25;cis、0.00 ± 0.25;内側、0.50 ± 0.25;トランス-ゴルジ、1.00 ± 0.25、TGN、1.25 2.00。したがってを示すそのトランスに TPST1 EGFP LQ-ゴルジ装置の局在は、前研究14と一致しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig1.jpg"> 図 1.かすかな光の計算で使用される変数を示す図。商品番号:gm130、ゴールト mCherry および蛋白質のコーアクシャル センター ゴルジ ミニ スタックの (A) xz ビュー軸、軸角度、x d1ゴルジを示す蛍光 x。ゴルジのミニ スタックのイメージは、画像平面に射影です。(B) xy 表示ゴルジ ミニ スタックの x 軸角度 α、β と投影を示す蛋白質の軸を中心にxの距離。AとBはそれぞれ図 1Eと前文書7の図 1Fから適応です。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55996/55996fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig2.jpg"> 図 2.波長シフトの補正します。(A) 広視野顕微鏡で取得した 110 nm マルチカラー ビーズの 3色マージされた画像。それぞれのビーズを発する緑、赤、および遠 (人工的に着色ブルーとして) 蛍光。スケール バー、10 μ m (B) 拡大表示の顕著な波長シフトと合併シングル ビーズ イメージ。スケール バー、200 nm。(C) A 図、緑と遠ビーズ画像のシフトに表されます。 ベクトルの赤のビーズ画像 (0, 0) の中心から緑 (緑ベクトル) と遠 (青いベクトル) ビーズ画像のセンターにそれぞれ示します。(D, E)波長シフト補正の効果。イメージの同じフィールド内にある緑と青のベクトルはの前にプロットし、後シフト補正。小さな変化を視覚化するには、それぞれのベクトルの大きさは 200-fold で増幅されます。(F, G)散布図のシフト補正の前後に緑 (緑の点) と遠 (青い点) ビーズの中心を示します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55996/55996fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55996/55996fig3.jpg"> 図 3.TPST1 EGFP の LQ を取得ここで、かすかな光の典型的な例です。TPST1 EGFP (緑) と GalT-mCherry (レッド) を表現する HeLa 細胞染色による内因性商品番号:gm130 (青)。(A) は典型的なセル。(B、C、D、E)ノコダゾールと扱われる細胞をイメージしました (B)。イメージからCに示すように分析可能なゴルジ ミニ スタックが選ばれました。選択したゴルジ ミニ スタックの識別番号でラベルです。これらの仮面ゴルジのミニ スタックのイメージは、その識別番号を持つD下に表示されます。"L"は、ゴルジのミニ スタックが LQ (解析可能なゴルジ ミニ スタック) の計算に有効であるを示します。Eのセルから 21 ミニ スタックの LQs のヒストグラムが表示されます。(F) LQs ヒストグラム 12 セルから 111 ミニ スタックの。ヒストグラムに表示される値は平均 ± SEM.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55996/55996fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足資料:マクロ ゴルジ投資収益率 inspection.ijm、マクロ出力 3 チャンネル data.ijm、Matlab コード、My_train.exe、My_test.exe、およびスプレッドシートの template.opj。

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Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

ゴルジの住民の正確な局在はゴルジ体の細胞の機能を理解するために不可欠です。しかし、従来の光学顕微鏡ではサブ ゴルジ構造を解決できません。ここで定量的蛋白質のサブ ゴルジ装置の局在を決定する従来の顕微鏡による超解像法のプロトコルについて述べる。

そのセンターの蛍光質量イメージングによるゴルジ体タンパク質の量的なローカリゼーション

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

quantitative-localization-golgi-protein-imaging-its-center

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K ビュー.  Nanyang Technological University. ゴルジの住民の正確な局在はゴルジ体の細胞の機能を理解するために不可欠です。しかし、従来の光学顕微鏡ではサブ ゴルジ構造を解決できません。ここで定量的蛋白質のサブ ゴルジ装置の局在を決定する従来の顕微鏡による超解像法のプロトコルについて述べる。

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

生物学

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

蛍光ベースのカルシウム動員アッセイによるGタンパク質共役受容体のキャラクタリゼーション

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.