우리는 비판적으로 원고 읽기 위한 박사 제시카 Habashi 감사 합니다. 우리 DR5 GFP 분석 결과의 지역화를 수행 하기 위한 이미징 센터,의 생명 과학, 수도 사범 대학 (베이징, 중국), 대학 박사 Xianyong Sheng을 감사 합니다. 이 작품은 베이징 시 정부 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (CIT &#38; TCD20150102) 국가 자연 과학 재단의 중국 (31600248)에서.

참고:이 프로토콜은 세 부분: 1) DIC 현미경;를 사용 하 여 야생-타입 애기 배아에서 패턴 형성 관찰 2) 특성화는 배아 패턴 형성을 통해 마커 단백질 표정 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법;를 사용 하 여 관찰 그리고 3) embryogenesis (예를 들어 naa10 돌연변이 사용)에서 특정 유전자의 역할을 결정.
1. 난 개간
<ol>
	<li>식물 소재 준비 참고: 여기에 설명 된 프로토콜; 건강 한 식물을 성장 하는 방법에 예입니다. 건강 한 식물을 성장 하는 다른 방법 또한 작동 합니다.<ol>
		<li>1.5 mL 튜브에 100 씨앗을 추가 하 고 소독 하 5 분 반전에 대 한 씨앗 튜브 여러 번 씨와 솔루션은 완전히 표면 씨앗 소독을 잘 혼합 되도록 1.5% 염소 (믹스 물 85 mL와 10% 염소의 15 mL)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>30에 대 한 원심 분리 하 여 튜브의 하단에 씨앗을 강제로 s 1200 x g에서 상쾌한, 제거 하 고 잔류 염소를 제거 하는 벤치에서 씨앗 살 균 물으로 4 번 세척.</li>
		<li>1 l의 초순 4.4 g Skoog (MS)와 村 重 기저 소금 혼합물의 고 자당의 10 g를 추가 합니다. 소금 및 자당 분해 혼합물을 저 어. 고 에이전트, Phytagel, 등의 3 세대 MS 자당 솔루션에 추가 1 m 코, pH 5.8에 솔루션을 조정 하 고 MS 매체를 15 분 동안 121 ° C에서 솔루션을 소독.</li>
		<li>MS 중간 접시를 생성 하는 12 cm 문화 요리에 MS 매체의 30 mL를 붓으십시오.</li>
		<li>MS 판에 소독된 씨앗을 놓습니다. 성장 챔버에 접시를 전송 하 고 씨앗 층 리 (어둠 속에서 4 ° C에서 3 일) 후 긴 하루 조건 (22 ° C 16 h는 빛과 어둠 속에서 8 h 동안 18 ° C)에서 접시를 유지.</li>
		<li>8 일 후의 성장, 식물 토양 (혼합 영양이 풍부한 토양 및 1:1 비율로 vermiculite) 쟁반에 전송 하 고 물 손실을 방지 하기 위해 5 일 흰색, 투명 한 뚜껑 트레이 커버 식물의 vitrification를 피하기 위해 간격을 두고.</li>
		<li>용지함에서 뚜껑 하 고 긴 하루 조건 (1.1.5 참조)에서 도보 약 실에 있는 식물을 육성. 오전 6 시 빛을 전환 하 고에서 오후 10 시. 대형 챔버에 성장의 약 20 일 후 식물은 꽃 있고 siliques 생산.</li>
		<li>씨앗의 위치에서 스레드가 있는 꽃 봉 오리는 꽃이 핌에서 오후 8 시 줄기 마크 (세 번째 꽃 봉 오리를 첫 번째 사용 하지 않는, 보통이 꽃 봉 오리에서 생성 된 siliques 몇 중단된 씨앗, 개발과이 비정상적인 ovules 정상의 비율을 변경할 수 있습니다). 표시 된 버드 오전 8 시 다음 날 아침 꽃 열 때로 난의 수 분의 시작을 정의 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoyer의 솔루션의 준비
	<ol>
		<li>50 mL 튜브에 chloral 하이드 레이트의 24 g을 추가 하 고 완전히 알루미늄 호 일 (chloral 하이드 레이트의 솔루션은 빛 아래에서 안정)와 함께 튜브 포장.</li>
		<li>다음, 위의 솔루션을 9 mL 초순 물과 글리세롤의 3 mL를 추가 하 고 해산 chloral 하이드 레이트 튜브를 흔들어. Hoyer의 솔루션으로 만들기 위해 모든 거품을 제거 하기 위해 실내 온도에 밤새 서 튜브를 하자.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>난 분리 및 정리
	<ol>
		<li>양면 접착 테이프의 조각을 현미경 유리 슬라이드에 연결 합니다. 원하는 수 분 (DAP) pseudoseptum; 표면에 수직으로 슬라이드에 후 일 수에 대 한 성장 하는 silique 배치 이것은 carpels (그림 1A 및 1B)를 쉽게 할 것 이다.</li>
		<li>주사기 바늘으로는 pseudoseptum의 양쪽에 carpels를 분할 하 고 2 개의 해 부 carpels 슬라이드 연결 하는 silique에서 ovules (그림 1C 및 1d) stereoscope 아래 볼 수 있습니다.</li>
		<li>유리 슬라이드에 Hoyer의 솔루션의 70 µ L를 분배 하 고 파 버 Hoyer의 솔루션으로 뾰족한 핀셋의 쌍의 끝을 축. stereoscope를 사용 하 여 이동은 ovules Hoyer의 솔루션으로 슬라이드에 배아를 청소를 핀셋으로. 부드럽게 모든 거품을 생성 하지 않으려면 슬라이드는 coverslip을 적용 됩니다.</li>
		<li>둔다 2-12 h에 대 한 어두운 방에 상자에 완성 된 슬라이드를 (더 성숙 된 난, 더 많은 시간이 필요 하 게 됩니다) 실내 온도에. 2/4-셀 단계 (1-2 DAP)에서 배아 배아 octant 구형 초기 (3 DAP) 사이 4 h 후 관찰 될 수 있다 그러나 2 시간 후 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 더 성숙한 배아 (4-8 DAP) 12 h 후 관찰할 수 있습니다.</li>
		<li>현미경의 DIC 함수를 사용 하 여 지운된 ovules를 검사 합니다. 저전력 필드 (10 배)에서 배아를 찾아서 다음 개발 된 배아에서 세포 패턴을 관찰 하 고 전력 분야 (100 X 기름 침수 렌즈)로 변경 합니다.</li>
		<li>다른 발달 단계에서 배아를 검사 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 배아 패턴화 및 마커 단백질 식의 관찰을 통해 셀 Id의 특성
<ol>
	<li>식물 재료의 준비
	<ol>
		<li>발기인 및 코딩 시퀀스 마커 유전자 또는 호르몬 응답 요소를 복제 하 고 형광 단백질 ( GFP); 같은 퓨즈 다음 구문이 삽입 (예: pCambia1300) 이진 벡터. 여기, auxin 응답 요소 DR5 예제10으로 제공 됩니다.</li>
		<li>Agrobacterium tumefaciens에 의해 야생 형 식물으로 결과 DR5 GFP 플라스 미드를 소개-변환11중재. T1 식물 hygromycin 포함 된 MS 중간 접시를 사용 하 여 선택 (50 mg/mL의 어머니 주류, 희석 1:1, 000). 유전자 변형 식물 긴 뿌리를 전시 하 고 1.1.5에 설명 된 조건 하에서 성장의 8 일 후 두 장미 잎을 생성.</li>
		<li>토양에 유전자 변형 식물을 전송 및 1.1.6 및 1.1.7에 표시 된 대로 그들을 육성.</li>
		<li>독립적인 T1 라인에서 T2 씨앗을 수집 합니다. MS hygromycin 접시에 씨앗을 뿌리 다, DR5 GFP 삽입 (민감한 식물에 저항 하는 식물의 비율이 될 것 이다 대략 3:1)의 복사본 하나를 운반 하는 식물을 선택 하 고 토양에 그들을 전송.</li>
		<li>1.1.6에 1.1.7 같이 t 2 식물을 육성.</li>
		<li>T2 식물에서 T3 씨앗을 수집 합니다. MS hygromycin 접시에 씨앗을 뿌리 다, homozygous 유전자 변형 식물 (모두 한 줄에서 식물의 전시 hygromycin 저항)을 선택 하 고 토양에 그들을 전송.</li>
		<li>1.1.8에 표시 된 대로 homozygous T3 식물의 꽃 봉 오리를 표시 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP 신호 관측
	<ol>
		<li>6% 글리세롤 솔루션을 생성 하기 위해 초순의 47 mL와 글리세롤의 3 mL를 혼합.</li>
		<li>양면 접착 테이프의 조각 유리 현미경 슬라이드를 부착 하 고는 silique 1.3.1에 표시 된 대로 수정.</li>
		<li>주사기 바늘으로는 pseudoseptum의 양쪽에 carpels를 분할 하 고 1.3.2에 표시 된 대로 stereoscope 아래 슬라이드에 두 개의 해 부 carpels를 연결 합니다.</li>
		<li>유리 슬라이드에 6% 글리세롤의 30 µ L를 분배 고 해 부 carpels에서 ovules의 모든 솔루션 뾰족한 핀셋을 사용 하 여 합니다. 부드럽게 슬라이드에는 coverslip을 놓습니다.</li>
		<li>씨 외 투 및 각 난에 endosperm GFP 신호 태아에서의 관찰을 방지할 수 있습니다,으로 난에서 태아를 추출 합니다. 신속 하 고 부드럽게 슬라이드를 누릅니다 (더 성숙한는 난은, 슬라이드에 더 적은 힘을 적용 한다)는 난에서 태아를 돌출 시킬.</li>
		<li>GFP 형광 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여에 대 한 슬라이드를 검사 합니다. 낮은-전력 분야 (10 배)에서 격리 된 배아를 찾을 그들의 위치를 기록 그리고 DR5 GFP 식 배아에 488을 여기 광원을 설정 하 여 관찰 하 고 전력 분야 (100 X 기름 침수 렌즈) 변경 GFP 신호 검출에 대 한 nm.</li>
		<li>추가 분석을 위해 적당 한 T3 라인 선택 배아에 GFP 식 감지.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 특성화의 난 클리어런스 및 마커 단백질 관찰을 통해 배아 치명적인 돌연변이에 배아 패턴 형성: 예를 들어 Naa10
<ol>
	<li>Naa10 돌연변이 식물에 모방 하는 태아
	<ol>
		<li>1.1.1-1.1.7에 표시 된 대로 식물 재료를 준비 합니다.</li>
		<li>Naa10식별+ / − 식물 유전자 특정 뇌관5, 다음 표를 사용 하 여 PCR에 의해 naa10의 꽃 봉 오리+ / − 1.1.8에 표시 된 대로 식물.</li>
		<li>난 정리 및 naa10의 현미경 검사 수행+ / − 배아 1.2와 1.3에 표시 된 대로.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naa10 배아를 사용 하 여 마커 단백질 분석
	<ol>
		<li>2.1-2.2에 명시 된 절차를 사용 하 여 적합 한 DR5-GFP 유전자 변형 라인을 얻을.</li>
		<li>구나10 homozygous DR5-GFP 유전자 변형 라인 크로스+ − naa10를 공장+ / − 식물 homozygous GFP 형광 마커 (유전자 특정 PCR에 의해 식별 된) F2 세대에서 naa10특성을+ −5 GFP 신호 homozygous DR5 GFP 라인을 사용 하 여 현미경으로 관찰 하 고.</li>
		<li>Naa10의 꽃 봉 오리를 표시+ / − DR5-GFP 2.1.7에서 homozygous 식물.</li>
		<li>DR5-GFP 2.2에서 homozygous naa10 배아에서 GFP 신호에 대 한 검색.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li><li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+flowering+plants:+setting+up+the+basic+body+pattern.">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li><li>Wendrich, J. 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D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation.">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li><li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li><li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8.">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li><li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein.">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

난 클리어런스는 세포 분열을 감지 하 고 애기;에서 embryogenesis 동안 형태를 평가 하는 유용한 방법 이 기술을 사용 하 여, 배아 DIC 현미경5,12에서 직접 관찰할 수 있습니다. 난 정리를 위한 중요 한 단계는 단계 1.3.4. 1.3.4 단계에서 난 허가에 필요한 시간은 변수입니다. 2/4-셀 단계에서 배아 Hoyer의 솔루션에서 2 시간 후 그들은 불명료 한 후 12 h 보이는 반면 명확 하 게 관찰할 수 있습니다. 따라서, 더 성숙한 한 난, 더 이상 시간 이다 허가에 필요한.
2.2.5 단계는 난에서 배아를 분리 하는 슬라이드에 적용 되는 힘의 양을 중요 합니다. 태아 수 있습니다 짓 눌린 경우 너무 많은 힘이 적용 됩니다. 그러나, 너무 작은 힘을 사용 하는 경우 태아는 난에서 돌출 될 수 없습니다. 우리의 경험에서는, 더 성숙한는 난, 더 적은 힘이 필요 하다. 어 뢰 무대와 성숙한 배아 필 링 오픈 한 난 주사기 바늘을 사용 하 여 직접 고립 될 수 있다. Suspensor 세포의 일부 고립 된 배아에서 분리 과정에서 파괴 수도, 형광 신호는 suspensor에서 손실 되거나 불완전 한 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 한계는 4 셀 단계 전에 배아 했다 그들은 너무 작고 난 조각에 의해 차폐 된 배아에서 찾기 어렵다 이다.
발달 단계와 배아의 형태학; 특정 유전자의 돌연변이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 효과 난 클리어런스에 따라 현미경에 의해 설명할 수 있습니다. 이 접근은 어느 특정 유전자 중재 하십시오 embryogenesis5분자 메커니즘의 이해에 도움이 됩니다. 알 수 없는 기능 유전자GFP 융해 embryogenesis 동안의 식을 패턴 관찰 배아 패턴화와 그 유전자의 표현 사이의 링크를 제공 하 고 애기13에 embryogenesis에 필요한 새로운 유전자의 식별을 용이 하 게 수 있습니다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 애기에 embryogenesis 특성에 대 한 기본 메서드를 제공 합니다.

Embryogenesis 높은 공장 개발에서 초기 이벤트입니다. 세포 분열 및 엄격한 유전자 제어1,2차별화 통해 zygote에서 성숙한 배아 형태. 애기 배아는 embryogenesis 동안 세포 분열의 순서 예상된 패턴3,4를 따르기 때문에 morphogenesis의 제어를 공부 하는 유용한 모델입니다. 그러나, 여러 셀에 하나를 포함 하는 애기 배아 관찰 하 고 분석에 너무 작습니다. 또한, 특정 유전자의 돌연변이 배아 치 사 율5, embryogenesis에서 그 유전자의 중요 한 역할을 나타내는 발생할 수 있습니다. 배아-치명적인 돌연변이에 패턴 형성의 특성 필수 유전자 배아 개발을 규제 하는 의하여 분자 메커니즘을 이해 하기 위한 기초를 제공 한다.
자세한 방법은 직접 현미경 관찰에 의해 모델 공장 애기 배아 패턴 형성 특성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. 방법은 난 클리어런스를 배아의 현미경 관찰에 의해 다음을 포함 한다. 배아-치명적인 돌연변이의 특성 또한 설명 되어 있습니다.
다른 발달 단계에서 배아의 형태 Hoyer의 솔루션6,7지운 ovules를 사용 하 여 현미경으로 직접 확인할 수 있습니다. 이러한 ovules 전시 높은 굴절률; 따라서, 메서드를 비운이 난 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경으로 관찰 한다 견본을 위해 특히 유리 하다.
또한, embryogenesis 동안 특정 셀 또는 셀 제한 된 수에 표현 되는 유전자 배아에서 세포를 식별 하기 위해 마커로 사용할 수 있습니다. 따라서, embryogenesis 동안 셀 id 사양 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 GFP 태그 마커 단백질의 식이 모니터링 하 여 주석 첨부 될 수 있습니다. 반대로, 그것이 embryogenesis 중 한 알 수 없는 기능 유전자-GFP 융해의 식 패턴을 관찰 배아 패턴화와 그 유전자의 표현 사이의 링크를 제공를 애기에 embryogenesis에 필요한 새로운 유전자의 식별을 용이 하 게 됩니다.
여기 설명 하는 방법을 사용할 수 있습니다 또한 배아 치명적인 돌연변이의 표현 형을 특성화 하 고 세포 수준에서 embryogenesis에 영향을 받는 유전자의 영향을 확인 하. 또한, 함께 비교 마커 유전자의 표현 패턴의 야생 형 및 돌연변이 식물 사이 embryogenesis 동안, 방법은 분자 메커니즘 및 신호 경로 embryogenesis8,9에 참여에 대 한 단서를 얻을 수 있습니다. 실제로, 메서드 naa10 식물에 적용 된 그리고 그것은 돌연변이에 hypophysis의 비정상적인 부문 변화 embryogenesis5동안 auxin 배포에 의해 발생할 수 있습니다 발견 했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Chloral Hydrate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15307</td>
			<td style="width:293px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phytagel</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Hygromycin&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber&#160;</td>
			<td>Percival</td>
			<td style="width:119px;">CU36L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss Image M2</td>
			<td>camera: AxioCam 506 color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss LSM 5</td>
			<td>filters: BP 495-555 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Axio Zoom V16</td>
			<td>camera: AxioCam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient-rich&#160;soil</td>
			<td colspan="2">KLASMANN, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">10% sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KOH</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture dish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vermiculite</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass slide</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">syringe needle</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fine-tipped tweezers</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">super clean bench</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis

그들의 개발의 높은 예측 가능한 특성을 감안할 때, 애기 배아 사용 되었습니다 모델로 morphogenesis 식물에서의 연구에 대 한. 그러나, 초기 단계 공장 배아 작은 그리고 그들을 관찰 하 고 분석 어렵게 만드는 몇 가지 셀을 포함. 메서드는 특성화 모델 유기 체 애기를 사용 하 여 현미경으로 식물 배아에서 패턴 형성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. Hoyer의 솔루션을 사용 하 여 신선한 ovules의 정리, 다음에 휴대폰 번호와 배아의 형태 관찰 될 수 있었다, 그리고 그들의 발달 단계는 기름 침수 렌즈 X 100을 사용 하 여 미분 간섭 명암 현미경에 의해 결정 될 수 있었다. 또한, 특정 마커 단백질 녹색 형광 단백질 (GFP)와 태그의 표현 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 셀 id 사양 배아 패턴화 하는 동안 주석을 모니터링 했다. 따라서, 세포 및 분자 수준에서 야생-타입 식물 배아에서 패턴 형성을 관찰 하 고 야생-타입 식물 및 배아 치명적인 돌연변이 배아에서 패턴 형성을 비교 하 여 모방 하는 태아에서에서 특정 유전자의 역할을 특성화 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 따라서 메서드는 애기에 embryogenesis 특성을 사용할 수 있습니다.

이 문서에서 설명 하는 방법은 embryogenesis 직접 현미경으로 관찰 하 고, 특정 마커, embryogenesis 동안 셀 id 사양 주석을 추가 하 고 embryogenesis 동안 특정 유전자의 역할의 특성을 사용할 수 있습니다.
배아 (성숙한 스틱 산책 단계로 길쭉한 접합 자 단계)에서 야생-타입 애기 에 패턴의 분석에서 대표적인 결과 그림 2에 표시 됩니다. 난 정리 후 다른 발달 단계에서 배아 DIC 현미경 검사 법 (그림 2)에 의해 구별 될 수 있는. DR5-GFP 의 표현 패턴 embryogenesis에서 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (그림 3) 배아에 auxin의 분포를 결정 하 고 애기에 embryogenesis 동안 auxin의 잠재적인 역할을 검사 하는 동안 기록 되었다.
이 프로토콜은 또한 embryogenesis 동안 특정 한 유전자의 역할을 특성화 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, 애기 에 embryogenesis 동안 Naa10 의 역할은 예를 들어 시험 되었다. hypophysis의 비정상적인 부문 ( Naa10 야생-타입 식물, 그림 4에서 hypophysis의 가로 비대칭 부분을 가진 비교에서 hypophysis의 비스듬히 및 수직 사업부) 관찰 되었다. 구형 무대에 auxin의 분포 대부분 Naa10 배아에서 거의 균일 한 고 야생 유형 배아 (그림 5)에 비해 hypophysis에 광범위 한 신호를 유지. 이러한 결과 Naa10 embryogenesis에 대 한 필요 하 고 애기에 통로 신호 하는 auxin 통해 embryogenesis에 관련 되어있을 수 있습니다 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig1.jpg"> 
그림 1: 애기 Silique의 해 부에 대 한 회로도. (A) 유리 슬라이드에 연결 된 silique 양면 접착 테이프의 조각으로 붙여 넣 했다. (B) a에서 상자의 확대 이미지 2 상상의 선을 표현에 분할 위치. (C) 디 (D) 분할 silique의 이미지 상자에 분할 silique의 확대 이미지. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig2.jpg"> 
그림 2: DIC 현미경 검사 법에 의해 야생-타입 (열 0) 애기 에 Embryogenesis의 시험. (A) Elongated zygote. (B) A 1 셀 단계 태아 1 DAP에서. (C) A 2 DAP에서 2/4-셀 단계 배아. (D) 3 octant 단계 배아 튐. (E) A 3 DAP에 dermatogen 단계 배아. (F) 4 초기 구형 단계 배아 튐. (G) A 5 DAP에 늦은 구형 단계 배아. (H) A 6 DAP에 심장 단계 배아. (나) 7 DAP에서 어 뢰 단계 배아. (J) 8 DAP에 스틱 산책 단계 배아. 스케일 바 = 10 µ m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig3.jpg"> 
그림 3: DR5 야생-타입 (열 0) 애기 배아에서의 표현 패턴입니다. (a - d) GFP 신호. (A-D) 밝은 분야 이미지 병합 된 이미지입니다. DR5 야생-타입 구형 단계 (a 와 A, 4 DAP)와 마음 (b 와 B, 6 DAP) 단계 배아의 루트 극에 표현 했다. DR5 배아 떡 팁 (c 와 C, 7 DAP)와 성숙한 야생-타입 배아 (d 와 D, 8 DAP)의 맥 관 구조에도 표현 되었다. 스케일 바 = 50 µ m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig4.jpg"> 
Embryogenesis 애기에 동안 Naa10 의 역할의 그림 4: 특성 야생-타입 식물 (A)에서 hypophysis의 정상적인 부분. Naa10 돌연변이 식물에 hypophysis의 비정상적인 부분 흰 선 (B)는 (hypophysis 비스듬히 부문) 및 (C)는 (hypophysis 수직 부문)로 표시 됩니다. 스케일 바 = 10 µ m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig5.jpg"> 
그림 5: DR5 식 패턴 구형 무대 야생-타입 (열 0) 애기 와 Naa10 배아에. (a 와 b) GFP 신호입니다. (A 와 B) 밝은 분야 이미지 병합 된 이미지입니다. DR5 야생-타입 구형 단계 배아(및 A) 의 루트 극에 표현 했다. DR5 구형 단계 Naa10 배아에 거의 균일 하 게 표현 했다 고 야생 유형 (b 와 B)에 비해 hypophysis에 광범위 한 신호를 유지. 스케일 바 = 50 µ m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

11.0K 조회수.  Capital Normal University. 이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

정적 장기 문화를 사용하여 구개 퓨전 공부의 방법

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

연구

발생학

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid fissure closure. Recently, the identification of individuals with coloboma in the superior aspect of the iris, retina, and lens led to the discovery of a novel structure, referred to as the superior fissure or superior ocular sulcus (SOS), that is transiently present on the dorsal aspect of the optic cup during vertebrate eye development. Although this structure is conserved across mice, chick, fish, and newt, our current understanding of the SOS is limited. In order to elucidate factors that contribute to its formation and closure, it is imperative to be able to observe it and identify abnormalities, such as delay in the closure of the SOS. Here, we set out to create a standardized series of protocols that can be used to efficiently visualize the SOS by combining widely available microscopy techniques with common molecular biology techniques such as immunofluorescent staining and mRNA overexpression. While this set of protocols focuses on the ability to observe SOS closure delay, it is adaptable to the experimenter&#39;s needs and can be easily modified. Overall, we hope to create an approachable method through which our understanding of the SOS can be advanced to expand the current knowledge of vertebrate eye development.

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Here, we present a standardized series of protocols to observe the superior ocular sulcus, a recently-identified, evolutionarily-conserved structure in the vertebrate eye. Using zebrafish larvae, we demonstrate techniques necessary to identify factors that contribute to the formation and closure of the superior ocular sulcus.

Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...