이 작품은 중국 자연 과학 재단 (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 및 81402907), 절강 성 자연 과학 재단 (LR15H310001) 및 S &amp; T 혁신 팀 (2011R50014)의 Zhejiang Leading Team을위한 프로그램에 의해 지원되었습니다.

모든 실험은 Zhejiang 대학 동물 실험위원회의 윤리 지침에 따라 승인되고 시행되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 보건 연구소의 지침을 완벽하게 준수했습니다. 고통이나 불편 함을 최소화하기위한 노력이 이루어졌으며 최소한의 동물 수가 사용되었습니다. 1. Corticostriatal 조각의 OGD <ol><li> 솔루션 준비 : <ol><li> 1000 mL의 R-ACSF (124 밀리몰 / L, 염화나트륨을 준비 5 밀리몰 / L의 KCl, 1.25 밀리몰 / L의 KH 2 PO 4, 2 밀리몰 / L 황산, 26 밀리몰 / L의 NaHCO3, 2 밀리몰 / L의 CaCl2를, 10 mmol / L 포도당, 최종 pH 7.4). 실험 전반에 걸쳐 5 % CO 2 및 95 % O 2 를 포함한 거품. </li><li> 5 % CO 2 및 95 % N 2 버블 글루코스 위는 제외 200 mL의 포도당없는 ACSF (GF-ACSF)를 준비한다. br에 적용하기 전에 30 분 동안 기체를 버블 링하십시오.용액의 산소 함량을 줄이기 위해 얇게 썬 것입니다. OGD 절차가 끝날 때까지 버블 링을 계속하십시오. </li><li> 20 % CO 2 및 80 % O 2로 r-ACSF 200 mL를 평형화하여 산성 ACSF (a-ACSF)를 준비한다. 뇌 조각에 적용하기 전에 30 분 동안 가스를 버블 링하여 용액의 pH를 pH 6.8로 낮추고 APC 절차가 끝날 때까지 버블 링을 계속하십시오. </li><li> 3 개의 조직 홀더를 각각 r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF에 놓습니다. </li></ol></li><li> 두뇌 준비 : 참고 :이 연구에서는 8 주 된 수컷 C57Bl / 6J 마우스를 사용했습니다. 동물들은 조절 된 온도 (22 ± 2 ℃)하에 12 시간의 명암 사이클주기 및 펠렛 화 된 음식 및 물에 접근하여 보관 하였다. <ol><li> 유도 챔버에서 isoflurane의 과다 복용으로 마우스를 희생. 마우스를 처치하십시오. 작은 가위와 집게를 사용하여 두뇌를 해부. 얇은 주걱으로 뇌를 제거하고 조심스럽게 유리 비이커에 넣으십시오이닝 빙냉 R-ACSF 5 % CO 2, 95 % O 2로 평형화. 참고 :이 단계는 가능한 한 신속하지만 세 심하게 수행해야합니다. </li><li> ice-cold r-ACSF에 뇌를 5 분간 보관하십시오. 뇌의 움직임을 피하기 위해 가스 압력을 조절하십시오. </li><li> 두 stripe에 vibratome 접시에 cryoprecipitate 접착제를 놓으십시오. 두뇌를 지원하기 위해 블레이드에서 멀리 접착제 스트립에 3 % 아가로 오스 조각을 넣어. </li><li> 얼음에 10cm 페트리 접시를 뒤집은 다음 접시에 여과지를 넣어. 얼음처럼 차가운 r-ACSF로 여과지를 적 십니다. </li><li> 집게로 두뇌를 여과지에 옮기십시오. 전두엽과 소뇌를 칼날과 집게로 잘라냅니다. 참고 : 횡단면은 가능한 한 부드럽고 시상면에 수직이어야합니다. </li><li> 나머지 두뇌 조직을 접착제의 다른 스트립에 수직으로 배치하고 두뇌가 아가로 오스에 기대어 두도록하십시오. 얼음 저온 r-ACSF를 절단 저장조에 추가뇌를 잠수하고 얼음 홀더 영역에 얼음을 추가하십시오. 5 % CO 2 및 95 % O 2로 버블 링 된 저장소의 r-ACSF를 유지합니다. </li><li> 공기통을 들어 올리고 면도날을 가능한 한 두뇌 가까이에두고 뇌의 바로 위에 면도날의 위치를 ​​조정하십시오. </li><li> 두뇌 섹션을 계속 슬라이스하려면 &quot;연속&quot;모드를 선택하십시오. 절단 두께를 400 μm, 진동 주파수를 6 - 8, 속도를 3 - 4로 설정하십시오. &quot;start / stop&quot;버튼을 눌러 자동 절단을 시작하십시오. </li><li> 뇌 조각의 크기에 맞는 개구부를 만들기 위해 3 mL 파스퇴르 피펫의 끝 부분을 자릅니다. 참고 : 개구부는 뇌 조각에 대한 추가 손상을 피할 수있을만큼 커야합니다. </li><li> 오 개 뇌 조각에게 팁 cutPasteur 피펫 하나 하나를 그려 얼음처럼 차가운 R-ACSF의 조직 홀더에 넣지 5 % CO 2, 95 % O 2 부풀어. 생산 된 첫 조각을 수집하지 마십시오. 가스 압력을 조정하십시오뇌 조각의 움직임. 참고 : 두뇌 조각은 서로를 가려서는 안됩니다. </li><li> 30 분 동안 실온에서 r-ACSF로 두뇌 슬라이스를 놓고 시냅스 기능을 회복하기 위해 수 욕에서 37 분간 추가로 10 분간 두었다. </li></ol></li><li> OGD 및 APC : <ol><li> 37 ℃의 수조에 gf-ACSF와 a-ACSF를 놓고 위에서 언급 한 1.1 f와 1.1.3의 해당 가스로 완충액을 버블 링하십시오. </li><li> r-ACSF의 한 조각을 컨트롤로 둡니다. 조심스럽게 예열 gf - ACSF와 조직 홀더에 다른 네뇌 두 조각을 전송하고 15 분 동안 품어. 재관류를 달성하기 위해 슬라이스를 r-ACSF의 조직 홀더로 다시 옮긴다. </li><li> APC 시간대를 연구하려면 gf-ACSF에서 a-ACSF로 직접 슬라이스 하나를 전송하십시오. 처음에 다른 세 조각을 r-ACSF로 옮긴 다음 재관류 후 5 분과 15 분에 각각 ACSF로 조직 홀더로 옮깁니다. </li><li> Incubata-ACSF에서 2 조각을 3 분간 추출한 다음 r-ACSF로 다시 전송합니다. r-ACSF의 세 조각을 다른 1 시간 동안 품어 낸다. r-ACSF의 나머지 슬라이스를 OGD 그룹으로 설정하십시오. </li><li> 용량 반응 연구를 위해, OGD 후 r-ACSF의 조직 보유자에게 4 개의 모든 조각을 옮기고 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 한 조각을 r-ACSF에 OGD 그룹으로두고 다른 세 조각을 ACSF로 전송합니다. a - ACSF의 조각을 각각 1, 3, 5 분 동안 품어 낸 다음 다시 r-ACSF로 전송합니다. r-ACSF의 세 조각을 다른 1 시간 동안 품어 낸다. </li></ol></li><li> 슬라이스 생존력 측정 : <ol><li> 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride (TTC) 0.25 % 생리 식염수 용액을 준비한다. 500 mL의 생리 식염수에 TTC 분말 1.25 g을 넣는다. 참고 : 분말이 완전히 녹은 후 호일로 덮인 24- 웰 플레이트 (500 μL / 웰)에 용액을 옮기고 4 ° C에 보관하십시오. TTC 및 TTC로 염색 된 조직은 빛 센sitive. </li><li> 슬라이스를 TTC 솔루션이 들어있는 24- 웰 플레이트 (웰당 한 조각)에 옮기고 용액에서 슬라이스를 늘립니다. 37에서 TTC 솔루션의 조각을 품어 ° C 30 분 얕은 수조에서. </li><li> 호일로 덮인 깨끗한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 조각을 옮기고 슬라이스의 건조 중량을 측정합니다. </li><li> 원심 분리기 튜브 (v : w = 10 : 1)에 에탄올 / 디메틸 술폭 시드 (1 : 1)를 첨가하여 포르 마잔을 추출한다. 24 시간 동안 빛으로부터 멀리 실온에서 에탄올 / 디메틸 술폭 시드의 조각을 품어. </li><li> 모든 에탄올 / 디메틸 sulfoxide를 96- 웰 플레이트에 넣고 플레이트 판독기로 490 nm에서 흡광도를 측정한다. </li><li> 흡광도를 슬라이스의 건조 중량으로 표준화하고 생존력을 대조 슬라이스의 백분율로 나타냅니다. </li></ol></li></ol> 2. MCAO <ol><li> 예비: <ol><li> 작업대, 레이저 도플러 유량계의 표면을 소독하십시오.y (LDF) 장비 및 70 % 에틸 알콜을 포함한 액세서리. </li><li> 오토 클레이브 된기구 준비 : 두 개의 가위, 10cm; 두 포셉, 10cm; 한 안과 용 집게, 11cm; 하나의 마이크로 안과 가위, 9cm; 하나의 미세 혈관 클램프, 1.8cm; oneneedle 운전, r 12.5 cm; 몇몇 수술 봉합사 (△ 1/2 4 × 10); 면봉. </li><li> 수화 작용 영역을 유지하기 위해 식염수로 주사기 (바늘 제외)를 준비하십시오. </li><li> 마취 가스 (100 % O 2 + isoflurane)를 준비하십시오. </li></ol></li><li> 뇌 혈류 탐지 : <ol><li> LDF 장비를 설치하십시오. </li><li> Metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg 및 buprenorphin 0.1 mg / kg으로 마우스에 복강 내 진통제를 주입하십시오. </li><li> 마우스를 유도 챔버에 4 % isoflurane을 산소와 함께 마취시켜 신체와 정맥류의 자발적인 움직임이 멈출 때까지 마취시킨다. </li><li> 코를 엎드린 위치에 마우스를 놓고코 콘을 투여하고 후속 절차를 위해 이소 플루 란을 1.5 %로 유지한다. </li><li> 양쪽 눈에 dexpanthenol 안 연고제를 바르십시오. </li><li> 70 % 에틸 알코올로 머리를 소독하십시오. </li><li> 브레 그마를 폭로하기 위해 메스를 사용하여 눈과 귀 사이의 올바른 파라 메디아 피부 절개를하십시오. </li><li> 두개골을 멸균면으로 문지릅니다. </li><li> 두개골 표면에 수술 용 접착제 1-2 방울을 바르십시오. </li><li> bregma에 5mm 꼬리 광섬유 프로브의 팁을 넣고 정중선에 6mm 측면을 놓습니다. </li><li> 컴퓨터 소프트웨어에서 혈류 기록을 시작하십시오. 안정된 혈류량 기준선이 생길 때까지 기다린 다음 접착제에 20 μL 촉매를 가하여 프로브를 고정하십시오. 참고 : 이상적인베이스 라인은 500 플럭스 이상이어야합니다. </li><li> 기준선이 200 플럭스보다 작 으면 적절한 기준선을 얻기 위해 미세하게 위치를 조정합니다. 실험 기간 동안 두개골에 프로브를 붙이십시오. </li><li> iodophor af로 머리를 소독하십시오.광섬유 프로브가 부착되어 있습니다. </li></ol></li><li> MCAO : <ol><li> 마취 된 마우스 (그 두개골에 부착 된 LDF 탐침 포함)를 앙와위로 놓고 수술 중에 열 램프를 사용하여 체온을 유지하십시오. 70 % 에틸 알코올로 목을 소독하십시오. </li><li> 메스를 사용하여 목에 paramedian 피부 절개를하십시오; 부드러운 조직을 포셉로 절개하여 혈관을 노출시킵니다. 수분을 유지하기 위해 노출 된 조직에 한 방울의 식염수를 추가하십시오. </li><li> 안과 집게를 사용하여 주변 조직과 미주 신경에서 총 경동맥을 해부합니다. 미주 신경을 손상시키지 않도록주의하십시오. 총 경동맥이 노출 된 후 iodophor로 목 피부를 다시 소독하십시오. </li><li> 총 경동맥의 말단에 미세 혈관 클램프를 놓은 다음 기단에서 6-0 실크 봉합사로 죽은 매듭을 묶습니다. 후속 작업을 위해 클램프를 가능한 한 근위에 놓습니다. 길이가클램프와 데드 매듭 사이의 용기는 후속 작업을 위해 가능한 한 길다. </li><li> 느슨한 매듭을 묶어 클램프의 근위에 임시 봉합을하십시오. 모노 필라멘트 삽입을위한 두 개의 매듭 사이에 충분한 공간이 있는지 확인하십시오. </li><li> 마이크로 안과 가위로 두 개의 매듭 사이에 종 방향 절개를하십시오. 후속 수술을 위해 가능한 한 절개가 죽은 매듭에 가까워 졌는지 확인하십시오. 배를 자르지 않도록주의하십시오. </li><li> 절개를 통해 12mm 팁 둔화 모노 필라멘트를 삽입하여 동맥 루멘에 들어가서 몇 mm 전진시킵니다. 모노 필라멘트 끝에 느슨한 매듭을 조인 다음 클램프를 제거하십시오. </li><li> LDF 소프트웨어가 혈류량이 급격히 감소 (기준 혈류보다 80 % 이상 감소) 될 때까지 안과 용 집게로 필라멘트를 내 경동맥 (중간 대뇌 동맥을 막기 위해 10mm)으로 전진시킵니다. 오 클루 전 시작 시간을 기록하십시오. 참고 : LDF 장비 설정은 다음과 같습니다.2.2 절에서 설명했다. </li><li> 중간 대뇌 동맥을 1 시간 동안 폐색한다. LDF 프로브를 차단하고 교합 기간 동안 30 ° C 배양기에 마우스를 넣으십시오. </li></ol></li><li> 재관류 및 APC : <ol><li> occlusion의 시작 시간 후 55 분 위에서 설명한대로 isoflurane로 동물을 다시 마취. 쥐를 눕히거나 눕히십시오. 목 절개를 열고 총 경동맥을 다시 노출 시키십시오. </li><li> 가려움 기간 후 안과 용 집게로 부드럽게 필라멘트를 꺼내어 재관류를 이루고 매듭을 조여 임시 봉합사를 영구 고정시켜줍니다. </li><li> 산증의 치료를위한, 재관류 후 5, 50, 또는 100 분 20 %의 5 분 동안 CO 2, 20 % O 2 및 60 % N 2를 포함하는 혼합 가스로 노즈콘 의해 흡입 가스를 변경. 중단 수술 봉합과 절개를 닫습니다. </li><li> 생쥐가 의식을 회복 할 때까지 30 ° C 열 케이지에 마우스를 놓습니다.마우스를 깨끗하고 개별적인 우리로 되 돌린다. 물과 축축한 음식의 페트리 접시를 쥐에게 제공하십시오. 과도한 통증과 사망에 대한 수술 후 마우스를 면밀히 관찰하십시오. </li></ol></li><li> 뇌경색 체적 측정 : <ol><li> 재관류 24 시간 후 TTC 염색을 사용하여 뇌경색 양을 측정하십시오. </li><li> 지정된 희생 시간 이전에 1.4.1 단계에서 언급 한대로 0.25 % TTC 용액을 준비한다. 호일로 덮인 24 - 웰 플레이트 (우물당 1 ML)에 솔루션을 전송하고 4 ° C에 보관하십시오. 참고 : TTC 및 TTC로 염색 된 조직은 빛에 민감합니다. </li><li> 재관류 24 시간 후 유도 챔버에서 isoflurane의 과다 복용으로 동물을 희생. 마우스를 처치하십시오. 작은 가위와 집게를 사용하여 머리를 해부하십시오. 윌리스 서클에서 지주막 하 출혈을 일으킨 마우스를 제외하기 위해 두뇌의 피가 섞이는 부분을 검사하십시오. </li><li> -20 °에 깨끗한 유리 슬라이드에 두뇌를 놓습니다<html> C 아이스 팩. 뇌를 조각 내기가 더 쉽도록 5 분 동안 -20 ° C 냉장고에 두뇌와 유리 슬라이드를 놓습니다. </li><li> -20 ° C에서 두뇌와 유리 슬라이드를 꺼내 -20 ° C 얼음 팩에 올려 놓습니다. 정면 기둥과 소뇌를 칼과 포셉로 해부하십시오. </li><li> 블레이드를 사용하여 뇌 부분을 수평으로 1mm 두께로 슬라이스하여 5 개의 슬라이스를 만듭니다. 슬라이스를 집게로 TTC 용액 (웰 당 1 슬라이스)이 들어있는 24- 웰 플레이트로 옮기고 용액에서 슬라이스를 뻗는다. 37에서 TTC 솔루션의 조각을 품어 ° C 30 분 얕은 수조에서. </li><li> TTC 솔루션을 대기음. 10 % 포름 알데히드 (웰 당 1 mL)를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한다. 셀로판 시트에 자른 순서대로 슬라이스를 놓고 사진 플레이트 이미 저로 세그먼트를 스캔합니다. </li><li> ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 전체 뇌 조각의 백분율로 경색 크기 분석lass = &quot;xref&quot;&gt; 8 시각적 식별에 기초; 그림 2 (왼쪽)를 참조하십시오. </li></ol></li></ol>

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여기에 우리는 뇌 허혈에 대한 APC의 신경 보호를 연구하기위한 두 가지 실험 모델을 제시한다. 뇌 조각에서, APC는 MCAO 모델에서, APC는 재관류 후 마우스에 20 % CO 2 흡입에 의해 달성되는 동안 마우스, 재관류 개시 후 20 % CO 2로 버블 산성 완충액 슬라이스 corticostriatal 배양함으로써 달성된다. 두 모델 모두 대뇌 허혈에 대한 APC의 신경 보호를 반영한다. 보호는 허혈성 후 컨디셔닝에 의해 달성되는 것과 유사하지만 더 넓은 시간 창을 지녔다. MCAO 모델에서, 재관류 후 50 분의 허혈 후 조절 조건에 비해 10 분까지의 시간 범위가 길어질 수 있습니다 15 . 또한 APC의 절차가 더 쉽고 안전합니다. corticostriatal 조각 모델에서 부드럽고 빠른 작업은 뇌 조각의 생존 가능성을 최대로 보증하는 데 중요합니다. MCAO 성능의 경우, 뇌 혈류 모니터링은중대 뇌동맥의 폐색을 확실히하기 위해서는 혈류의 급격한 감소가 관찰되어야한다. 뇌가 TTC 염색을 위해 해부 된 후, 지주막 하 출혈을 배제하기 위해 뇌의주의 깊은 검사가 필요합니다. 산증의 연장과 지속 기간은 APC의 신경 보호를 달성하는 데 중요합니다. acidosis 치료의 지속 기간은 corticostriatal 조각 모델 ( 그림 1A )에 도움이되지 않습니다. 또한, 우리의 이전 연구는 모두 10 %와 20 % CO 2 흡입보다는 30 % CO 2 흡입 쥐 8 일에 신경을 부여하는 것으로 나타났다. 다음은 온화한 산증은 APC의 신경에 대한 중요 제안, 따라서 CO 2의 농도와 APC의 기간은 산증 신경에 반드시 필요하다. TTC 염색 이외에 많은 기술을 s다양한 연구 필요를 만족시킨다. 예를 들어, extra-cellular 전기 녹음은 허혈과 산성 증이 신경 잠재력 16에 어떻게 영향을 미치는지 관찰하기 위해 최종 단계에 추가 될 수 있습니다. 두뇌 슬라이스의 관류 용액을 수집하여 HPLC에 의한 APC 후 아미노산 신경 전달 물질의 농도 변화를 측정 할 수도 있습니다 17 . 특정 뇌 영역의 조각은 국소 빈혈과 APC에 대한 특정 영역의 반응을 연구하기 위해 준비 할 수 있습니다. 전반적으로 허혈과 산성 증의 영향을 조명하기 위해 많은 대안을 도입 할 수 있습니다.

뇌졸중은 전 세계적으로 사망률과 장애를 유발하는 주요 원인 중 하나입니다. 지난 수십 년 동안 뇌졸중에 대한 효과적인 치료법을 찾기 위해 많은 노력을 기울 였지만 그 성과는 아주 불만족 스럽습니다. 사후 조절 (postconditioning)는 허혈성 에피소드에 따른 독성 스트레스에 의해 조작되는 과정입니다. 허혈, 저산소증, 저 포도당 및 원격 허혈 후 조절을 포함한 사후 조건 조절은 내인성 적응 메커니즘을 유발하고 뇌허혈에 대한 유망한 치료법으로 입증되었습니다 1 , 2 , 3 , 4 . 그러나, 허혈 후 조절은 추가적인 상해를 유발할 수 있습니다. 사지의 원격 허혈성 후 조절은 동측 또는 양측 뒷다리 5 , 6 , 7 에 5 ~ 20 분간의 폐색과 재관류를 반복해야합니다. Th따라서 이러한 사후 조건 조종 조작은 임상 적으로 위험하거나 비실용적입니다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 우리는 생쥐 8 국소 뇌허혈에 대한 치료로 APC를 개발했다. 단순히 CO 2 20 %를 흡입에 의해 유도, APC는 훨씬 더 실현 가능한 안전한 방법으로 허혈성 뇌 손상을 줄일 수 있습니다. 최근에 우리는 APC가 뇌졸중 치료 9 APC의 중요성을 강조, 재관류 창을 확장 함을 확인 하였다. 여기에 우리는 뇌 허혈에 대한 APC의 신경 보호를 연구하기위한 두 가지 실험 모델을 제시한다. 첫 번째는 생쥐 corticostriatal 조각에서 산소 - 포도당 박탈 (OGD) 모델입니다. 인공적인 환경으로 신속한 준비 및 뇌 슬라이스 전송 보통 인공 뇌척수액 (ASCF) 가능 체외 10 &lt;뇌 기능을 연구 할 수있는 세포 생존 및 신경 회로를 유지할 수있다11 . ASCF의 OGD는 대뇌 국소 빈혈을 모방하고 허혈성 손상을 유발한다 ( 12 , 13 , 14) . OGD 후 뇌 조각은 재관류를 제공하기 위해 정규 ASCF (R-ASCF)에서 갱신 된 후 20 % CO 2로 버블 산성 ASCF APC를 사용하여 처리 하였다. corticostriatal 조각은 일차 배양 세포와 비교하여 손상되지 않은 조직학 특성을 유지합니다. 생체 내에서 뇌 기능을 연구하기 위해 마우스 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델을 사용합니다. 중간 대뇌 동맥은 총 경동맥을 통해 난연성 모노 필라멘트를 삽입하여 막습니다. 가장 널리 사용되는 뇌졸중 모델 중 하나 인 MCAO 모델은 임상 관련성을 보여 주며 monofilament의 적용으로 재관류를보다 쉽게 ​​수행 할 수 있습니다. 전자 reperfusio의 발병 후 20 %의 CO2를 함유하는 정상 산소의 혼합 가스를 흡입하여n, APC는 뇌경색의 감소로 나타나는 뇌허혈에 유의 한 보호 효과를 나타냈다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:157px;">S5886</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:157px;">P5405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:157px;">P9791</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:157px;">M2643</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:157px;">S5761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:157px;">C5080</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:157px;">G7021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vibratome</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:157px;">VT1000 S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:157px;">T8877</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Aladdin Industrial Corporation</td>
			<td style="width:157px;">E111993</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:157px;">D8418</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laser Doppler Flowmetry</td>
			<td style="width:183px;">Moor Instruments Ltd</td>
			<td style="width:157px;">Model Moor VMS-LDF2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Diethyl ether anhydrous</td>
			<td style="width:183px;">Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td>
			<td style="width:157px;">80059618</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trichloroacetaldehycle hydrate</td>
			<td style="width:183px;">Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td>
			<td style="width:157px;">30037517</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10% Formalin</td>
			<td style="width:183px;">Aladdin Industrial Corporation</td>
			<td style="width:157px;">F111936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-well plates</td>
			<td style="width:183px;">Jet Biofil</td>
			<td style="width:157px;">TCP-010-024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental models to study the neuroprotection of acidic postconditioning against cerebral ischemia

뇌졸중은 전 세계적으로 사망률과 장애의 주요 원인 중 하나이며 제한된 치료 방법을 사용합니다. 신경 보호를위한 내생 적 전략으로서, 후 조절 (postconditioning treatment)은 뇌 허혈에 대한 유망한 치료법으로 입증되었다. 그러나 복잡한 절차와 잠재적 인 안전 문제로 인해 임상 적용이 제한됩니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 우리는 실험적인 국소 뇌 허혈에 대한 치료법으로 산성 후 조절 (acidic postconditioning, APC)을 개발했습니다. APC는 허혈 재관류 동안 CO 2를 흡입하여 온화한 산증의 치료를 의미합니다. 여기서 우리는 각각 in vitro 및 in vivo에서 APC를 수행 할 수있는 두 가지 모델을 제시합니다. 생쥐의 산소 - 포도당 결핍 (OGD) 처리 및 생쥐의 대뇌 피질 선종 및 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)을 사용하여 뇌허혈을 모방 하였다. APC는 단지 20 % CO 2로 버블 산성 버퍼 뇌 조각을 전송함으로써 달성 될 수있다 O20 % CO 2 마우스를 흡입하여 R. APC는 조직 생존력 및 뇌경색 양에 의해 반영되는 바와 같이, 뇌허혈에 대한 유의적인 보호 효과를 나타내었다.

위에서 설명한 corticostriatal 슬라이스 모델에서, corticostriatal 슬라이스 생존 능력은 재관류 후 1 시간 TTC 분석에 의해 계량되었다. TTC 변환은 490 nm에서의 흡수를 대조 절편으로 정규화함으로써 계산 하였다. TTC 전환에 따라, APC는 발병 시간과 지속 시간에 따라 OGD 유발 재관류 손상으로부터 보호했다. 구체적으로, 1 분 및 3 분의 산증 치료는 모두 15 분 OGD 후 5 분에서 생존율을 유의하게 향상 시켰지만 5 분 (OGD : 0.609 ± 0.029, 5/1 : 0.758 ± 0.034, 5/3 : 0.821 ± 0.041, 5/5 : 0.672 ± 0.053, 평균 ± SEM으로보고 된 데이터) ( 도 1A ). 산혈증 치료에 의한 신경 보호는 재관류 후 5 분 이내에 보호되어 있었으나 15 분 (OGD : 0.584 ± 0.044, 0/3 : 0.762 ± 0.036, 5/3 : 0.833 ± 0.062, 15/3 : 0.627 ± 0.038) ( 그림 1 </strong&gt; B ). MCAO 모델에서, 재관류 시작 5 분 후에 시작된 5 분간의 산증 화 치료는 허혈성 손상으로 인한 세포 사멸을 완화 시켰으며, 경색 성 손상 (MCAO : 33.4 ± 4.4 %, 5/5 : 16.6 ± 2.7 %, 50 / 5 : 19.5 ± 2.1 %, 100/5 : 37 ± 2.1 %). 재관류 후 발병 시간이 50 분으로 지연 되더라도 신경 보호는 여전히 견고했습니다. 그러나, 100 분에 시작된 acidosis 치료는 허혈성 손상을 막지 못했다 ( 그림 2 ). 모든 데이터는 수집되어 맹목적인 방식으로 분석되었습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. corticostriatal 조각 모델에서 각 그룹은 6-8 샘플 있습니다. MCAO 모델에서 각 그룹에는 9-10 개의 샘플이 있습니다. 가장 중요한 차이가있는 편도 분석을 다중 비교에 적용했습니다. 그림 1 . APC는 Corticostriatal 조각에 OGD 유발 재관류 손상을 방지합니다. Corticostriatal 조각은 OGD 후 표시된 기간 (A) 및 회복 기간 (B)에 대해 산성 증 (pH 6.8)으로 치료되었습니다. 재관류 24 시간 후 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide assay를 이용하여 세포 생존력을 평가하였고, 재관류 1 시간 후 TTC 분석을 통해 대장 선암 세포 생존능을 정량 하였다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 각 그룹에 대해 n = 6 - 8; * 일원 분산 분석에 의해 p &lt;0.05 및 ** p &lt;0.01; R, 재관류. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55931/55931fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt= &quot;그림 2&quot;class = &quot;xfigimg&quot;src = &quot;/ files / ftp_upload / 55931 / 55931fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 . APC는 MCAO에 의한 마우스 손상을 예방합니다. 동물에게 60 분간의 MCAO를 시행하고, 재관류 후 5, 50 또는 100 분에 5 분 동안 20 % CO2를 흡입하여 치료 하였다. 경색 량은 재관류 24 시간 후 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride 염색으로 정량화 하였다 (왼쪽 패널에 검은 점선으로 표시). 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 각 그룹에 대해 n = 8-10; * 일원 분산 분석에 의해 p &lt;0.05 및 ** p &lt;0.01; R, 재관류. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55931/55931fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

산성 후 조절은 뇌 허혈을 예방합니다. 여기서는 APC를 실행하는 두 가지 모델을 제시합니다. 이들은 시험 관내에서 산소 - 글루코스 부족 후에 산성 버퍼 corticostriatal 슬라이스를 전달함으로써 생체 내에서 중간 대뇌 동맥 폐색 후 20 % CO 2 흡입에 의해 각각 달성된다.

대뇌 허혈에 대한 산성 후행 조절의 신경 보호를 연구하기위한 실험 모델

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

experimental-models-to-study-neuroprotection-acidic-postconditioning

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K 조회수.  Zhejiang University.  산성 후 조절은 뇌 허혈을 예방합니다. 여기서는 APC를 실행하는 두 가지 모델을 제시합니다. 이들은 시험 관내에서 산소 - 글루코스 부족 후에 산성 버퍼 corticostriatal 슬라이스를 전달함으로써 생체 내에서 중간 대뇌 동맥 폐색 후 20 % CO 2 흡입에 의해 각각 달성된다. 

비디오: Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

뇌 - 기계 인터페이스의 폐쇄 루프 성능을 연구하기 위해 실험 플랫폼

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

연구

신경과학

Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
neuro-metabolic-vascular relationship. Development of new pO2 measurement modalities with simultaneous monitoring of pO2 in larger fields of view with higher 
spatial and/or temporal resolution will enable greater insight into the functioning of the normal brain and will also have significant impact on diagnosis 
and treatment of neurovascular diseases such as stroke, Alzheimer's disease, and head injury.
Optical imaging modalities have shown a great potential to provide high spatiotemporal resolution and quantitative imaging of pO2 based on hemoglobin absorption in visible and near infrared range of optical spectrum. However, multispectral measurement of cerebral blood oxygenation relies on photon migration through the highly scattering brain tissue. Estimation and modeling of tissue optical parameters, which may undergo dynamic changes during the experiment, is typically required for accurate estimation of blood oxygenation. On the other hand, estimation of the partial pressure of oxygen (pO2) based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence should not be significantly affected by the changes in the optical parameters of the tissue and provides an absolute measure of pO2. Experimental systems that utilize oxygen-sensitive dyes have been demonstrated in in vivo studies of the perfused tissue as well as for monitoring the oxygen content in tissue cultures, showing that phosphorescence quenching is a potent technology capable of accurate oxygen imaging in the physiological pO2 range. 
Here we demonstrate with two different imaging modalities how to perform measurement of pO2 in cortical vasculature based on phosphorescence lifetime imaging. In first demonstration we present wide field of view imaging of pO2 at the cortical surface of a rat. This imaging modality has relatively simple experimental setup based on a CCD camera and a pulsed green laser. An example of monitoring the cortical spreading depression based on phosphorescence lifetime of Oxyphor R3 dye was presented. In second demonstration we present a high resolution two-photon pO2 imaging in cortical micro vasculature of a mouse. The experimental setup includes a custom built 2-photon microscope with femtosecond laser, electro-optic modulator, and photon-counting photo multiplier tube. We present an example of imaging the pO2 heterogeneity in the cortical microvasculature including capillaries, using a novel PtP-C343 dye with enhanced 2-photon excitation cross section.
Click here to view the related article <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/Details.php?ID=1731">Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a>

We present an experimental procedure for measuring the partial pressure of oxygen (pO2) in cerebral vasculature based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence. Animal preparation and imaging procedures were outlined for both large field of view CCD-based imaging of pO2 in rats and 2-photon excitation based imaging of pO2 in mice.

인광의 산소에 의존 담금질을 바탕으로 대뇌 혈액 산소 측정

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
...

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

쥐 중간 대뇌 동맥의 폐색의 Endovascular 봉합사에 의해 초점 대뇌 국소 빈혈 모델

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

There are many unanswered questions about cerebral lateralization. In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are lateralized, whether there are any disadvantages associated with atypical patterns of cerebral lateralization, and whether cerebral lateralization develops with age. In the past, researchers interested in these questions tended to use handedness as a proxy measure for cerebral lateralization, but this is unsatisfactory because handedness is only a weak and indirect indicator of laterality of cognitive functions1. Other methods, such as fMRI, are expensive for large-scale studies, and not always feasible with children2.
Here we will describe the use of functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) as a cost-effective, non-invasive and reliable method for assessing cerebral lateralization. The procedure involves measuring blood flow in the middle cerebral artery via an ultrasound probe placed just in front of the ear. Our work builds on work by Rune Aaslid, who co-introduced TCD in 1982, and Stefan Knecht, Michael Deppe and their colleagues at the University of M&uuml;nster, who pioneered the use of simultaneous measurements of left- and right middle cerebral artery blood flow, and devised a method of correcting for heart beat activity. This made it possible to see a clear increase in left-sided blood flow during language generation, with lateralization agreeing well with that obtained using other methods3.
The middle cerebral artery has a very wide vascular territory (see Figure 1) and the method does not provide useful information about localization within a hemisphere. Our experience suggests it is particularly sensitive to tasks that involve explicit or implicit speech production. The 'gold standard' task is a word generation task (e.g. think of as many words as you can that begin with the letter 'B') 4, but this is not suitable for young children and others with limited literacy skills. Compared with other brain imaging methods, fTCD is relatively unaffected by movement artefacts from speaking, and so we are able to get a reliable result from tasks that involve describing pictures aloud5,6. Accordingly, we have developed a child-friendly task that involves looking at video-clips that tell a story, and then describing what was seen.

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound fTCD

Functional transcranial Doppler sonography (fTCD) is a simple and non-invasive ultrasound technique which can be used to assess the lateralization of cognitive functions, especially language, and is suitable for use with children.

기능 Transcranial 도플러 초음파를 사용하여 어린이의 대뇌 Lateralization 평가 (fTCD)

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

콜드 preconditioning에서 Neuroprotection 연구를위한 전략

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

대뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 기능의 평가

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia

MRI provides a sensitive and specific imaging tool to detect acute ischemic stroke by means of a reduced diffusion coefficient of brain water. In a rat model of ischemic stroke, differences in quantitative T1 and T2 MRI relaxation times (qT1 and qT2) between the ischemic lesion (delineated by low diffusion) and the contralateral non-ischemic hemisphere increase with time from stroke onset. The time dependency of MRI relaxation time differences is heuristically described by a linear function and thus provides a simple estimate of stroke onset time. Additionally, the volumes of abnormal qT1 and qT2 within the ischemic lesion increase linearly with time providing a complementary method for stroke timing. A (semi)automated computer routine based on the quantified diffusion coefficient is presented to delineate acute ischemic stroke tissue in rat ischemia. This routine also determines hemispheric differences in qT1 and qT2 relaxation times and the location and volume of abnormal qT1 and qT2 voxels within the lesion. Uncertainties associated with onset time estimates of qT1 and qT2 MRI data vary from &plusmn; 25 min to &plusmn; 47 min for the first 5 hours of stroke. The most accurate onset time estimates can be obtained by quantifying the volume of overlapping abnormal qT1 and qT2 lesion volumes, termed 'Voverlap' (&plusmn; 25 min) or by quantifying hemispheric differences in qT2 relaxation times only (&plusmn; 28 min). Overall, qT2 derived parameters outperform those from qT1. The current MRI protocol is tested in the hyperacute phase of a permanent focal ischemia model, which may not be applicable to transient focal brain ischemia.

A protocol for stroke onset time estimation in a rat model of stroke exploiting quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) parameters is described. The procedure exploits diffusion MRI for delineation of the acute stroke lesion and quantitative T1 and T2 (qT1 and qT2) relaxation times for timing of stroke.

영구적인 뇌 허 혈에서 뇌졸중 발병 시간 추정에 대 한 자기 공명 화상 진 찰 프로토콜

MRI provides a sensitive and specific imaging tool to detect acute ischemic stroke by means of a reduced diffusion coefficient of brain water. In a rat ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...