저자 인정 비용 작업 CM1406 (Epigenetic 화학 생물학). 이 간행물에 보고 된 연구 피에르 메 르 시 재단에 의해 지원 되었다.

1. 세포 배양
참고: 다음 단계는 표준 조직 문화 후드에서 수행 됩니다. 메 마른 기술 친숙으로 예상 된다.
<ol>
	<li>헬러 세포 10% 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 G 보충 MEM에 T75 셀 문화 플라스 크에서 80 %confluency 문화 (100 U/mL), 고 스 (100mg/mL). 참고: 셀 문화, 치료, 그리고 세포 단계 층 류, 5% CO2 메 마른 조건 하에서 습도 분위기에서 수행 하는 37 ° C에서 셀 인큐베이션 단계에서 수행 됩니다.</li>
	<li>DPBS의 5 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 발음 DPBS, 세포 분리 시 약의 1 mL을 추가. 셀을 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>MEM 문화 매체의 9 mL를 추가, 철저 하 게 셀 서 스 펜 션, resuspend 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>6 x 104 셀/ml MEM에 세포 현 탁 액의 밀도 조정 합니다.</li>
	<li>100 µ L 셀 서 스 펜 션의 컨트롤을 추가 하 고 (그림 1A) 살 균, 평면-바닥, 조직 문화 취급 96 잘 접시의 우물을 테스트.</li>
	<li>96 잘 접시 (그림 1A)의 빈 우물에 MEM 문화 매체의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>24 h 동안 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어. 참고: 24 시간 보육 생 HDAC 활동 HeLa 세포에 대 한 테스트에 적합 한 시간 이다. 알 수 없는 HDAC 활동으로 다른 세포 유형 제어 셀 timecourse 평가 할 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 세포 치료 테스트와 HDAC 기판
<ol>
	<li>96 잘 접시의 우물에서 매체 발음</li>
	<li>추가 테스트 화합물 x 2의 25 µ L (예를 들어, trichostatin, MS275, 및 tubastatin A) 웰 스를 테스트 하려면 메모리에. 제어 및 빈 우물에 MEM의 25 µ L를 추가 합니다. 참고: 테스트 화합물의 농도 이상 5 최종 테스트 농도 (1 농도 잘 당)의 범위를 제공 하기 위해 조정 될 것입니다. 복합 테스트에서 DMSO 최종 농도 0.5%를 넘지 말아야 한다 고에 공백 및 컨트롤을 포함 하 여 각 잘 동일 해야 합니다. 최종 부 화 볼륨 잘 당 50 µ L입니다. Trichostatin A 500에서 1.95에 이르기까지 5 농도에서 테스트 nM (희석 1:4). MS275 및 tubastatin A 8000에서 6.17에 이르기까지 5 농도에서 테스트 nM (1:6 희석). 원하는 최종 테스트 농도 복합 각 테스트에 대 한 복용량 응답 곡선을 작성 하 여 각 개별 사용자에 의해 결정 되어야 합니다.</li>
	<li>제어 및 테스트 웰을 기판 혼합물 (말, MOCPAC의 42 µ M 및 MEM에 BATCP의 42 µ M의 42 µ M)의 25 µ L를 추가 합니다. 빈 우물에 MEM의 25 µ L를 추가 합니다. 참고: 각 기판의 최종 농도 21 µ M. MOCPAC와 BATCP 각각 HDAC1와 HDAC6 활동 사이 구별 (그림 1B). 활동이 그 기판으로 관찰은, 말의 사용 다른 HDAC isoform에 대 한 활동의 식별 잠재적으로 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>습도 5%에서 8 h 동안 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어 CO2 배양 기. 참고:이 보육 시간 HeLa 세포에 적합 이며 생 HDAC 합성 기질 상호 작용을 수 있습니다. 다른 셀 라인 보육 시간 및 기질 농도 조정 필요할 수 있습니다.</li>
</ol>
3. 세포 세포의 용 해 및 UHPLC-ESI-MS/MS에 대 한 샘플 준비
주의: 샘플 준비 단계 높은 가연성 및 독성 섭취 또는 흡입에 의해 유기 화학 물질을 사용 합니다. 적절 한 개인 보호 장갑, 보호 안경 등을 착용 합니다.
<ol>
	<li>6 x RIPA 버퍼 (10 x RIPA 버퍼에서 희석) 96 잘 접시의 각 음에 protease 억제제와 보충의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 우물에 감기 이기의 160 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 참고:이 단계 전에-20 ° C에는 이기 유지.</li>
	<li>10 분-80 ° C 냉장고에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>접시를 냉장고에서 제거 하 고-살 균 원뿔 바닥 (V-아래) 96 잘 접시에 220 µ L의 각 콘텐츠를 전송. 5000 x g와 10 분 동안 4 ° C에서 격판덮개 원심 참고:이 단계는 단백질과 염 분 제거에서 목표로 합니다. 필요한 경우 솔루션은 원심 분리 전에 개별 원뿔 원심 분리기 튜브로 전송 하거나 96-글쎄, 0.65 μ m PVDF 필터 플레이트의 집합을 통해 필터링 수 있습니다. 침전의 성공적인 제거는 UHPLC 분석 전에 필요 합니다.</li>
	<li>UHPLC 시스템 호환 96 잘 접시에 상쾌한 (또는 여과 액)의 200 µ L를 전송 하 고 peelable, heat-sealing 호 일 접시 마감재를 사용 하 여 그것을 봉인. 참고: 제거는 supernatants 때 펠 릿 pipetting 하지 마십시오. UHPLC 분석 즉시 수행할 수 없는 경우는 플레이트 분석까지 24 h의 최대 4 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>
4. UHPLC/MS-MS 분석
<ol>
	<li>모바일 단계 시스템 (95% A:5 %B)으로 작성 하 여 UHPLC 시스템을 준비: A: H2O, HPLC 급 포함 된 0.1% 개미 산 (준비 1 L) B: 이기, HPLC 급, 0.1% 개미 산을 포함 (1 L 준비). 주의: 모바일 단계 높은 가연성 및 독성 섭취 또는 흡입에 의해 유기 화학 물질을 포함 합니다. 적절 한 개인 보호 장갑, 보호 안경 등을 착용 합니다.</li>
	<li>플레이트 홀더를 포함 하는 샘플 관리자에 96 잘 접시를 놓습니다. 표 1에 제공 된 UHPLC-ESI-MS/MS 조건에 따라 샘플을 실행 합니다. 참고: 모든 열 분석 96 잘 접시의 있어야 컨트롤 잘 한 빈 잘 (같이 접시 체계 그림 1A의). 컨트롤은 테스트 셀 라인에서 100% 효소 활동의 대표 공백 MS 소스 일관 된 백그라운드를 제공 하 고 있는지 여부를 확인 하는 동안. 주어진된 빈에서 발견 하는 특이 한 MS 봉우리 MS 감도 변화를 방지 하기 위해 조사 한다.</li>
</ol>
5. 데이터 분석
<ol>
	<li>적절 한 UHPLC 통합 소프트웨어와 각 기판 및 그것의 deacetylated 제품의 최대 영역을 통합 합니다. 참고: 자동 통합 매개 변수를 사용 하 여 다듬기 방법 (평균, 창 크기 3, 및 2, 예를 들면 매끄러운 수). 표 1에 제공 된 컬럼에 조건 사용 하 여, 차입 순서는 dMAL (5.8 분), dBATCP (6.0 분), dMOCPAC (6.2 분), 말 (7.6 분), MOCPAC (8.9 분), 그리고 BATCP (9.8 분), 그림 1C에서 같이.</li>
	<li>각 기질에 대 한 (deacetylated/acetylated) 각 크로마 (테스트 및 컨트롤 샘플)에서 피크 지역 비율을 계산 합니다.</li>
	<li>각 테스트 샘플의 백분율 HDAC 저해를 계산. 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55878/55878eq1.jpg"> 참고: HDAC1 저해 dMOCPAC/MOCPAC;의 피크 면적 비를 사용 하 여 계산 HDAC6 억제는 dBATCP/BATCP으로 계산 됩니다. 일반 HDAC 저해 표현 하 비율 dMAL/말을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

HDAC 저해 약물 발견, 암 치료21HDAC6-선택적 억제제에 현재 초점에서 뜨거운 주제입니다. HDAC 선택도 일반적으로 개별 HDAC isoforms21으로 억제 효능을 결정 하는 높은 처리량, 셀 무료 분석 실험의 시리즈에 의해 평가 됩니다. 그러나, 억제제의 선택도 확인 되어야 합니다 또한 살아있는 세포에서 히스톤과 같은 내 생 단백질 기판의 acetylation 상태를 평가 하 여 (에 대 한 클래스 I HDACs) 및 tubulin (HDAC6)에 대 한. 따라서, 세포 항 체 인식 (예를 들어, immunostaining, 서쪽 오 점, cytometry, 고 애 란)를 포함 분석 실험은 일반적으로 필요한 isoform의 양적 또는 반 양적 평가 달성 하기 위해 생활에 주어진된 화합물의 힘21세포. 그것은 드문 셀 무료 효소 분석 결과에서 선택적 되었다 화합물 비-선택적 세포 또는 조직17,22, 그리고 반대19부 것으로 밝혀졌습니다. 이 비 표준화 된 효소 소스 및 공동 요인의 부재에 차이 또는 생 화 확 적인 분석 실험21단백질 파트너에 의해 설명 될 수 있다.
여기에 설명 된 방법은 I (HDAC1) 및 클래스 IIb (HDAC6)는 생활에서 억제 효능 클래스의 직접 측정 하기 위한 수 있도록 신속, 항 체 없는 대체 세포 환경17입니다. 방법의 또 다른 장점은 쉽게 neuroblasts23, 소형화 및 다른 세포 기반 분석24에 대 한 이전 설명으로 자동화에 대 한 가능성 등 다른 세포 라인에 적응 될 수 있습니다. 질량 분석에 의해 특정 기판의 검출 비교 양적 결과 제공 하는 deacetylated 제품의 정확한 측정에 기여 한다. 이것은 살아있는 세포에서 특정 HDAC isoforms로 IC50 값을 결정 하는 데 사용할 수 있는 첫 번째 방법입니다. 비교의 문제로, HDAC 억제제 서쪽 오 점에 비 양적 선택적 프로필 선택 프로 파일 방법으로 얻은 라인을 여기에 설명 된17증명 있다. 이 방법은 새로운 클래스 선택적 HDAC 저 해제의 발견에 대 한 개발 되었습니다 경우에 질병의 과정을 통해 셀 모델 내에서 HDAC 활동 측정에 적용 수 있습니다. 이 관련 질병에 epigenetic 및 분자 메커니즘의 해명에 기여할 수 있는 고 약물 후보를 식별 수 잠재적으로. 이 메서드 HDAC1 및 HDAC6 HDAC isoforms로 추정, 보기 새로운 선택적 HDAC 기판의 개발은 좋습니다. 또한, MOCPAC 및 BATCP의 기질 특이성 단일 isoforms를 대상으로 하는 점에서 완전히 특징 되어야 한다. 실제로, 동안 MOCPAC는 HDAC1 전용 기판으로 분류 (클래스 I 클래스 II에), 그것 일반적인 클래스 I 이전 시연25(를 포함 하 여 HDAC3 isoform), 기판은 더 높습니다. 따라서, BATCP는 유명한 HDAC6 선택적 기판 (클래스 II 이상 종류 I HDACs), 다른 클래스 II HDACs, HDAC4, 등 쪽으로 그것의 구체적 특성화25더 가치가 있지만.
효소 활동 셀 라인에 따라 다릅니다, 그리고 번호, confluency, 및 부 화 시간을 셀 수 있습니다. 셀 라인 분석 결과에서 처음으로 사용 하는 경우 그것은 다른 시간 지점 UHPLC-MS (예를 들어, Michaelis-Menten 작의를 통해)에 의해 효소 활동을 분석 하에서 제어 셀에 기질 농도의 범위를 테스트 하는 것이 중요. 이 연구원은 가장 적합 한 보육 시간 및 기질 농도 선택할 수 있습니다. 두 가지 주요 매개 변수 의존이 선택: 1) 효소 반응 속도 론 및 2)은 기판 및 그들의 deacetylated 제품 검색. 효소 반응 속도 론 분석 때 초기 속도 값 (즉, 제품 대형 선형 범위 안에 있을 때) 평가 필수적 이다 효소 활동을 확립. 활동에 따르면 Km 아래 기판 농도 억제, 경쟁 및 무 경쟁 억제 물26의 경우 특히의 정확한 비율을 제공 하기 위해 선택 되어야 한다. 다른 한편으로, 선택한 기질 농도 기판 및 deacetylated 제품 (신호 대 잡음 비율 ≥20)17에 대 한 감지 하 고 정량 MS 신호를 제공 해야 합니다. 사용할 때 여러 개의 기판, 크로마 방법을 분석할 모든 봉우리의 분리를 확인 해야 합니다. 대체 크로마 시스템 분리 그라데이션 및 열 유형에서 변경 해야 합니다.

HDACs 효소 chromatin 구조 내에서 히스톤 deacetylate 수의 가족에 속한다. 그들은 또한 다른 단백질 기판은 cytosol에서 있고 다양 한 셀 구획에 있습니다. 18 HDAC isoforms의 총 세포 신호 뿐만 아니라 녹음 방송 요인 유전자 발현의 규칙을 포함 하 여 몇 가지 셀 메커니즘에 관련 된 고1,2,3,,45,,67수송 지금까지 확인 된. HDAC 촉매 억제제는 암 치료에 대 한 잠재적인 치료 약물으로 떠오르고 있다. 현재 FDA에 의해 승인 대부분 HDAC 억제제 T-세포 림프 종 및 다 발성의 치료에 대 한 되며 vorinostat (사), belinostat, panobinostat,89등 일반적인 HDAC 저 해제. 그러나, 부작용의 시리즈 팬-억제제, 연관 된 고 isoform 특정 작은 분자에 대 한 검색의 약 화학과 약물 발견에 뜨거운 주제입니다. 따라서, 클래스 I (HDAC1-3와 HDAC8) 선택적 억제제 romidepsin는 이미 승인 된 약10, HDAC6 특정 억제제는 현재 임상 시험, 다중 골 수 종11,12,13,,1415에 증가 치료 잠재력.
HDAC 특성 분석 실험 심사 억제제 (단일 isoform, 핵 추출 물, 또는 세포 lysate) 효소 소스와 HDAC 기판의 외피에 근거한 다. 기판은 일반적으로 N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (말)16등 쪼갤 fluorophore (예: coumarin), 결합 틸 리 진 잔류물을 포함 하는 작은 펩 티 드 순서. Isoform 특정 활동을 구분 하기 위해 각 isoform를 포함 하는 별도 셀 무료 분석 필요 하 고 살아있는 세포에서 진짜 isoform 활동을 반영 하지 않을 수도 있습니다. Isoform 특정 기판 벤 질 등 상업적으로 사용할 수 있습니다 (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 특정 기판)와 (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic 산 tert-부 틸 에스테 르 (BATCP, HDAC6 특정 기판) (그림 1B). 그러나, 말을 포함 하는 다중 기판 혼합물, MOCPAC, 및 BATCP 살아있는 세포에 게 주어진 것입니다 허용 하지 개별 deacetylated 제품의 탐지 fluorometric 측정에 의해 그들은 동일한 쪼갤 fluorophore를 품는.
여기 설명 하는 방법을 검색 및 각 기판 및 UHPLC-ESI-MS/MS 분석17다음 멀티 기판 분석 결과 사용 하 여 헬러 세포에 그것의 deacetylated 제품의 상대적 정량화 할 수 있습니다. HDAC 분석 결과 HDAC 억제 활동의 및 내 인 성 HDACs에 시험 화합물의 특이성의 직접 식별 수 있도록 HeLa 세포에 실시 됩니다. 동시에 평가 되는 HDAC1 및 HDAC6에 초점이 이다. 위해 단일 외피 분석 결과에서 이러한 효소 측정, 비 및 특정 HDAC 기판의 혼합물 96 잘 접시에 도금 처리와 치료 HeLa 세포에 추가 됩니다. 인큐베이션 단계 세포는 기질 및 그들의 각각 반응 제품을 구분 되 고 UHPLC MS 메서드 (그림 1C)을 사용 하 여 검출 하 lysed 됩니다. 말, MOCPAC, 및 BATCP 기판의 deacetylated 제품 이다 deacetylated 말 (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC), 그리고 deacetylated BATCP (dBATCP), 각각. 복용량 응답 곡선 활성 화합물으로 만들 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg"> 
그림 1: 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HDAC1 및 HDAC6 관련 억제제를 식별 하기 위해 셀 기반 HDAC 분석 결과 대 한 일반적인 구성표. 전형적인 96 잘 접시 포함 하는 치료 (시험 화합물)의 (A) 체계 및 치료 (제어) 헬러 세포 뿐 아니라 셀 무료 공백. (B) 기판 내 생 HDACs에 의해 deacetylated 혼합 (21 µ M 각)으로 추가의 화학 구조. (C) 추가 기판 (말, MOCPAC, 및 BATCP) 및 그들의 deacetylated 제품의 봉우리를 보여주는 전형적인 UHPLC-MS 크로마 (dMAL, dMOCPAC, 그리고 dBACTP, 각각). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>BATCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4061</td><td></td></tr><tr><td>MAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCP0168</td><td>Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC</td></tr><tr><td>MOCPAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2195</td><td></td></tr><tr><td>MS275</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EPS002</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td></td></tr><tr><td>Tubastatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0044</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid, LC/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>10596814</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, HPLC grade</td><td></td><td></td><td>distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O filtered through a Milli-Q purification system</td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation reagent TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, cell culture grade</td><td>Applichem</td><td>146463</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>10x RIPA buffer</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast protease inhibitor tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning</td><td>VWR</td><td>29442-058</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning</td><td>VWR</td><td>29442-404</td><td>used in the centrifugation step</td></tr><tr><td>96-well plate, conical bottom, Nunc</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>249944</td><td>compatible with the Acquity UHPLC system</td></tr><tr><td>T75 cell culture flasks Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Peelable heat sealing foil</td><td>Waters</td><td>186002789</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC system</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-413-323</td><td></td></tr><tr><td>Integration software: MassLynx V4.1</td><td>Waters</td><td></td><td>Catalog number not available</td></tr><tr><td>Combi thermo-sealer SP-0669/240</td><td>Waters</td><td></td><td>Catalog number not available</td></tr><tr><td>Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td><td>Waters</td><td></td><td>Catalog number not available</td></tr></tbody></table>

simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms

새로운 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제에 대 한 검색 증가 약물 발견에 대 한 관심입니다. Isoform 선택 romidepsin, 클래스의 승인부터 스포트 라이트에서 되었습니다 내가 HDAC 억제제 암 치료, 그리고 여러 발성에 대 한 HDAC6 전용 억제제의 임상 조사에 대 한. 현재 메서드는 HDAC1 및 HDAC6 셀에 테스트의 금지 활동을 결정 하는 데 사용 됩니다. Isoform 활동 초 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (MS UHPLC) 분석의 특정 기판 처리와 치료 HeLa 세포와 알을 품을 사용 하 여 측정 됩니다. 메서드는 환경 내에서 셀 셀 무료 생 화 확 적인 분석 실험 격리 isoforms에 달리 생 HDAC 활동 반영의 이점이 있다. 또한, 합성 기판의 정량화에 기반 하기 때문에 메서드는 생 acetylated 단백질의 항 체 인식이 필요 하지 않습니다. 그것은 쉽게 여러 셀 라인 및 자동화 된 프로세스에 적응입니다. 메서드는 이미 neuroblasts에서 HDAC6-선택적 화합물을 찾는 유용한 증명 했다. 대표 결과 표준 HDAC 억제제 trichostatin는 (일반적인), MS275 이전으로 여기에 표시 됩니다 (HDAC1 전용), 및 tubastatin (HDAC6-특정) 헬러 세포를 사용 하 여.

HDAC1에 대 한 비 선택 및 선택적 억제제를 식별 하는 방법의 응용 프로그램을 (종류 I)와 HDAC6 (클래스 IIb), HeLa 세포는 알려진된 표준 화합물으로 치료 했다: trichostatin A (비-선택적 HDAC1와 HDAC6 사이)18, MS275 (HDAC1-선택적 억제제)19및 tubastatin (HDAC6-선택적 억제제)20. 현재 방법 (그림 1)를 사용 하 여 IC50 값 수 수 직접 정한 살아있는 세포에 (봐서 MOCPAC deacetylation) HDAC1 및 HDAC6 (BATCP deacetylation 보고) (그림 2). Trichostatin A HDAC1와 HDAC6 강력한 하지만 비 선택적 억제제를 했다. Tubastatin A는 HDAC6에 대 한 명확 하 게 선택 하는 동안 다른 한편으로, MS275 HDAC1에 대 한 선택적 이었다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig2.jpg"> 
그림 2: IC50 복용량 응답 곡선 동시에 얻은 HDAC1 및 HDAC6의 3 개의 표준 HDAC 저 해제: 비 선택적인 trichostatin A, HDAC1 선택 MS275 및 HDAC6 선택 tubastatin A. 인접 한 테이블에서 제시 하는 IC50 값은 3 개의 독립적인 측정의 평균 ± SD. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55878/55878fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>사출 볼륨</td>
			<td>5 Μ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>열</td>
			<td>C18 (2.6 μ m, 100 m m x 3 m m 아이디)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>열 온도</td>
			<td>40 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>차입 유량</td>
			<td>0.8 mL/min (전형적인 압력 범위: 400-600 바)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>차입 그라데이션</td>
			<td>10 분에 5-45% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 분에서 45-98% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>세척 단계</td>
			<td>2 분 98% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>평형 단계</td>
			<td>4 분 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESI-MS/MS</td>
			<td>콘 전압 30 V; 모 세관 소스 전압, 3.0 k v; 모 세관 온도, 350 ° C; 원천의 온도, 120 ° C; 칼 집 가스-질소 (600 L/h); 충돌 가스 압력, 아르곤 3 x 10-3 mbar 설정</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>충돌 변수와 반응 채널 0.1의 드웰 타임으로 최적화 된 s, 0.01 interscan 지연 및 충돌 에너지의 s 20 eV에서 설정.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>질량을 가진 말 탐지 446 → 346 (말) 그리고 404 → 304 (dMAL)을 전환합니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>질량을 가진 MOCPAC 탐지 494 → 449 (MOCPAC)과 439 → 394 (dMOCPAC)을 전환합니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>질량을 가진 BATCP 탐지 500 → 400 (BATCP) 그리고 476 → 376 (dBATCP)을 전환합니다.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: UHPLC-ESI-MS/MS 조건.

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Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

현재 메서드 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HeLa 세포에서 히스톤 deacetylases (HDAC)의 isoform 특정 억제제를 식별 하는 역할. 이것은 생활에서 HDAC1 및 HDAC6 활동을 반영 하기 위해 개발 된 항 체 없는 메서드를 단일 isoform 셀 무료 분석 달리 셀 환경.

헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

simultaneous-measurement-hdac1-hdac6-activity-hela-cells-using-uhplc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.4K 조회수.  Universités des Geneva–Lausanne (EPGL). 현재 메서드 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HeLa 세포에서 히스톤 deacetylases (HDAC)의 isoform 특정 억제제를 식별 하는 역할. 이것은 생활에서 HDAC1 및 HDAC6 활동을 반영 하기 위해 개발 된 항 체 없는 메서드를 단일 isoform 셀 무료 분석 달리 셀 환경.

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Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 스퍼 질러 스 니 둘 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

연구

생화학

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

암 연구학

Histone Proteomic Analysis 및 Post-Translational Modification Characterization (히스톤 단백질체 분석 및 번역 후 변형 특성 분석)

Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as posttranslational modifications (PTMs). Identifying the position and nature of each PTM or pattern of PTMs in reference to external or genetic factors allows this information to be statistically correlated with biological responses such as DNA transcription, replication, or repair. In the present work, a high-throughput analytical protocol for the detection of histone PTMs from biological samples is described. The use of complementary liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) enables the separation and PTM assignment of the most biologically relevant modifications in a single analysis. The described approach takes advantage of recent developments in dependent data acquisition (DDA) using parallel accumulation in the mobility trap, followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. Histone PTMs are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

저자 스포트라이트: LC-TIMS-ToF MS/MS 및 PASEF를 통한 향상된 Histone PTM 이성질체 식별

An analytical workflow based on liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) for high confidence and highly reproducible "bottom-up" analysis of histone modifications and identification based on principal parameters (retention time [RT], collision cross section [CCS], and accurate mass-to-charge [m/z] ratio).

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as ...

화학

HAT1 효소 활성을 스크리닝하기 위한 클릭 기반 분석 개발

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

저자 스포트라이트: HAT1 Inhibitor Screening을 위한 Acetyl-Click Assay 개발

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

포유류의 링커 - 히스톤 Subtypes의 표현 분석

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

생물학

Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array of diverse posttranslational modifications (PTMs) that mostly occur in the amino termini of histone proteins (i.e., histone tail) and regulate the accessibility and functional state of the underlying DNA. Histone tails extend from the core of the nucleosome and are subject to the addition of acetyl groups by histone acetyltransferases (HATs) and the removal of acetyl groups by histone deacetylases (HDACs) during cellular growth and differentiation. Specific acetylation patterns on lysine (K) residues on histone tails determine a dynamic homeostasis between transcriptionally active or transcriptionally repressed chromatin by (1) influencing the core histone assembly and (2) recruiting synergistic or antagonistic chromatin-associated proteins to the transcription site. The fundamental regulatory mechanism of the complex nature of histone tail PTMs influences the majority of chromatin-templated processes and results in changes in cell maturation and differentiation in both normal and pathological development. The goal of the current report is to provide novices with an efficient method to purify core histone proteins from cells and brain tissue and to reliably quantify acetylation marks on histones H3 and H4.

The purpose of this article is to provide a comprehensive, systematic guide to the efficient purification of histones H3 and H4 and the quantification of acetylated histone residues.

H3 및 H4 히스톤 단백질 및 세포와 뇌 조직 Acetylated 히스톤 부호의 부 량의 정화

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

요약

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효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 스퍼 질러 스 니 둘 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

포유류의 링커 - 히스톤 Subtypes의 표현 분석

H3 및 H4 히스톤 단백질 및 세포와 뇌 조직 Acetylated 히스톤 부호의 부 량의 정화