우리는 CSIC confocal 현미경 검사 법;와 그녀의 기술 지원에 대 한 마리 디 Doménico를이 프로젝트에 주어진 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 그의 원고 교정;에 대 한 호세 레오나르도 Báez를 루치아노 코레아 비디오;의 창조에 그의 헌신을 비디오에 대 한 그녀의 목소리와 블루밍턴 초파리 재고 센터 제공 하는이 연구에 사용 하는 주식에 대 한 대출에 대 한 나탈리 아 Rosano 하. 이사벨 게레로 의해 단일 클로 널 항-Ptc 개발 Apa1에서는 발달 연구 Hybridoma 은행 (DSHB)는 NICHD의 후원을 얻은 고 아이오와의 대학, 생물학 학과, 52242 아이오와 시, IA에 의해 유지.

주 1
1. 수집 및 경작 번데기입니다.
<ol>
	<li>Puparium 대형 (APF) 또는 교양된 튜브에서 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 prepupae 후 0 h를 제거 하 고 거의 완전 한 개발 기간에 새로운 튜브에 넣어 (2.1 및 2.2 참조). 
	참고: 파리의 건강 한 인구 표준 자란 프로토콜을 사용 하 여 유지 되어야 합니다. 3 또는 4 일 후 달걀 누워 있다, 성인 개인의 최적의 개발 있도록 튜브에서 제거할 수 있습니다. 그들은 세 번째 탈피 애벌레 pupation 시작 될 때까지 일정 한 온도에서 유지 관리 됩니다. 애벌레/번데기 전환 0 h APF를 간주 하는 prepupa의 형성에 의해 표시 됩니다. prepupa 앞쪽 spiracles 튀어나온 모양 둥근 된 직사각형을 움직이지 흰 애벌레입니다.</li>
</ol>
주 2
2입니다. 양도, 해 부 및 고정입니다.
<ol>
	<li>칠하기 붓에 번데기 (2 h 개발 시간이 되기 전에 완료) 전송 더블 양면 테이프와 현미경 슬라이드를 준수. 등 쪽 측 및 두 부와 행 끝 같은 방향으로 향하게 하는 형태로 pupae를 놓습니다.</li>
	<li>일정 한 온도를 현미경 슬라이드를 반환 하 고 (즉, 24-30 h APF) 적절 한 개발 시간을 완료 하는 데 번데기를 허용. 
	참고: 이중 양면 테이프와 현미경 슬라이드 번데기 케이스 (아래 참조)를 제거 하는 일시적인 절 개 플랫폼 될 것입니다. (유리병) 밖에 서 현미경 슬라이드에 시간 경과 집게와 쉽게 깨뜨릴 만들기 번데기 경우 건조에 도움이 됩니다.</li>
	<li>operculum 집게를 사용 하 여 번데기 케이스에서 제거 합니다.</li>
	<li>(비디오에서와 같이) 집게 경우 휴식 그것의 꼬리 끝에는 번데기의 측면을 따라 라인을 만들기. 적절 한 조명 분명 번데기 날개의 바로 위에 경첩 공간 만들기 번데기의 내부 형태를 검출 하기 위하여 가능 하다. 이 공간 번데기를 손상 없이 여 수행 하는 가이드 역할을 합니다.</li>
	<li>케이스, 열린된 국경에 의해 그들을 데리 고 이중 면 테이프 그들을 막을 것 이다 반대 측에 그들의 부분을 제거 합니다. 해 부의 끝에 번데기는 거의 "누드", 케이스의 단지 작은 조각을 후부 팁을 덮고 있을 것 이다 있을 것 이다. 참고: 위 꼬리 끝에는 작은 양의 경우의 목적은 이중 양면 테이프와 함께 슬라이드에 사건에서 부드러운 릴리스 되도록. 이 작업 뒤에 이유는 때문에 너무 많이 제거 하면 경우의 수는 크게 번데기 손상 위험. 다른 한편으로 너무 작고, 제거 하면 번데기 쉽게 오지 않을 경우 무료.</li>
	<li>아래로 밀어 (겸 자)와 케이스의 나머지. 이 운동은 머리와 흉부 준수 하 고 다음 단계에서 전송 우선 위치에 번데기의 앞쪽 끝을 올릴 것 이다.</li>
	<li>더블 양면 테이프와 새 슬라이드 하 고 번데기 또는 pupae 행에 반전. 번데기의 파손을 방지 하기 위해 stereomicroscope의 도움으로 움직임을 관찰 하 여이 방법을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>약간 pupae 테이프에 충실 하 고 부드럽게 슬라이드의 경우 나머지에서 번데기를 제거 하려면 활강을 누릅니다. 현미경 슬라이드 반전: 번데기 수준 그들의 머리의 등 쪽에 붙어 있을 것입니다 / 가슴 지역.</li>
	<li>4 %paraformaldehyde 모든 벌 거 벗은 pupae를 커버 하 고 10 분을 기다립니다. 우리의 경험에는 정착 제와 시간이 경과 표 피 회사, 덜 끈 적 하 고 취급 하 게 쉬운 그것을 만들기의 일관성을 변경 수 있습니다. 
	참고: Ribonucleic 산 (RNA) 추출을 수행 하려면 RNase와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 대 한 대체 paraformaldehyde 물 무료 하 고 만드는 각 돌출부의 힌지 지점 근처 (가 위 만으로도) 컷 번데기 날개를 제거 합니다. Guanidinium 안산 및 페 놀 시 약의 1 mL microcentrifuge 튜브에 번데기 날개를 전송 집게를 사용 하 여. 50-80 날개의 총 수집 후 RNA 추출10,11수행까지-80 ° C에서 microcentrifuge 튜브를 저장 합니다.</li>
	<li>작은 절 개를 경첩 지역에서 날개의 또는 근처를 확인 합니다. 정착 액 날개 상피에 도달 하실 수 있습니다. 날개에는 피 펫 (p200) 플러시 통을 사용 하 여. 홍 조 대체 하는 경우는 오염 된 흥분 시키는 새로운. 홍 조, 후 5 분 동안 정착 액에 날개를 유지. 
	참고: 이 책략 오염 직물의 대다수를 멀리 맑게 하는 데 도움이, 비록 일부 hemocytes와 지방 방울 남아 있을 수 있다 날개의 등 쪽과 복 부 상피 층 사이 덫 ( 그림 1A참조).</li>
	<li>(비디오에서와 같이) 표 피 테두리에서 집게로 눈물 구멍을 확대 하 고 표 피 sac에서 날개 상피의 릴리스를 사용. 일단 날개 조직 발표, 고정 30 분 완료 paraformaldehyde 솔루션에 둡니다.</li>
	<li>것을 PBST 4 던 플라스틱 접시 가득 고정된 날개를 전송 (Triton X-100 0.05%). 4 ° c.에 게 하룻밤</li>
</ol>
3 일
3. 1 차적인 항 체 외피입니다.
<ol>
	<li>PBST에서 번데기 날개 잠복기 조직 permeabilize (Triton X-100 0.2%) 부드러운 액체 중간 움직임을 촉진 하기 위하여 락 플랫폼을 사용 하 여 15 분. 
	참고: 샘플을 설치까지 단계 락 플랫폼을 사용 하 여 수행 한다.</li>
	<li>PBSTA를 사용 하 여 샘플을 차단 (BSA 3%, Triton X-100 0.1%) 1 시간에 대 한.</li>
	<li>동일한 버퍼를 사용 하 여 1 차적인 항 체 (마우스 항-Ptc, 1: 100)를 희석 하 여 4 ° c.에 하룻밤 번데기 날개를 품 어</li>
</ol>
4 일
4. 이차 항 체 외피입니다.
<ol>
	<li>워시 샘플 4 x 10 분 각 PBST와 (Triton X-100 0.05%)</li>
	<li>이차 항 체 (예, 반대로 마우스에 형광 색소 활용 된)와 함께 품 어 PBSTA에 적절 한 농도를 희석 (BSA 3%, Triton X-100 0.1%) 2 시간에 대 한 어둠 속에서 실내 온도에. 
	참고: 적절 한 경우 조직 counterstain를 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 phalloidin을 사용 합니다. 이차 항 체의 신호의 중복을 방지 하기 위해 형광 방출 파장을 고려와 함께이 프로브를 추가 합니다.</li>
	<li>워시 샘플 4 x 10 분 각 PBST와 (Triton X-100 0.05%)</li>
</ol>
5입니다. 장착
<ol>
	<li>마치 그들은 사각형의 꼭지점 현미경 슬라이드에 투명 한 매니큐어의 4 점 들을 배치 하 여 샘플 슬라이드를 준비 합니다.</li></ol>포인트는 coverslips 나머지 것입니다 있을 것입니다 그들은 조직을 분쇄 방지 하는 데 도움.
	<li>미디어 (글리세롤/트리 스-HCl 80%)의 모서리 (점)을 건드리지 않고 매니큐어로 만든 점 들의 사각형의 중심에 장착의 장소 30 µ L. 노란 자른된 팁과 피 펫을가지고, 일부 설치 미디어를 로드 하 고 여러 번데기 날개에 그립니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드에 미디어를 마운트의 도트에 번데기 날개를 전송. 팁의 도움으로 설치 미디어를 확산 하 고 부동에서 그들을 방지 하기 위해 번데기 날개를 싱크 합니다. 커버 유리에 배치 되는 날개 평면 유지 하는 경우 조직의 형태를 유지 됩니다. 커버 유리를 배치 하기 전에 공기 방울을 제거 합니다.</li>
	<li>기포의 생성을 방지 하려는 샘플에 coverslip 낮은. 이 움직임은 겸의 도움으로 할 수 있습니다.</li>

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 비디오에서 설명 하는 해 부의 방법은 다양 한 기법에 대 한 다른 개발 단계에서 초파리 번데기 날개의 높은 품질의 샘플을 준비 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 면역 형광 검사, PCR 분석 실험, cDNA 합성 생체 외에서 개발 날개). 이 방법의 관점에서 관련 된 과학자 24-30 h APF를 사용 했습니다. 그러나 젊은 이상 번데기의 해 부에 필수적인 단계 내에서 아무런 장애물이 있어야 한다. 변화는 작은 무대 번데기를 수용 하 여야 할 수 있습니다.
프로토콜 한 번데기 또는 여러 pupae 동시에 해 부를 수행 수 있습니다. 쉽게 해 부 날개의 많은 수를 도달 하는 절차를 가속 수 있습니다. 이 경우 동시에 4-5 pupae의 행을 제거 하는 옵션이입니다. 함께 번데기를 제거 하거나 불가능, 계속 동일한 슬라이드에 개별적으로 제거할 수 있습니다 (III 비디오의 섹션을 참조 하십시오: "여러 pupae 해 부"). 에서 제거 하려면 알몸 번데기 열린된 경우, 후부 끝은 충분히 작은 중요 하다. 그것은 완전히; 경우 제거할 수 전송 더 빨리 만들 것 이라고, 비록 전체 케이스의 제거 도전 그리고 번데기 손상의 큰 위험이 있다.
경험을 고려 하는 중요 한 책략은 (규정 개발 시간을 완료 하는 마지막 2 h) 지시 번데기 인큐베이터 안에 있지만 유리병 밖에 서 현미경 슬라이드에 연결 된. 시간이 경과 경우 휴식을 쉽게 건조에 도움이 됩니다. 전체 날개 표면에 항 체에 대 한 액세스를 부여 함으로써 날개 상피를 포함 하는 표 피를 벗기다 immunohistochemistry, 대 한 해 부 동안 또 다른 중요 한 단계가입니다. 이 단계는 몇 분 (적어도 힌지 지점에서 절 개 후 5 분) 동안 고정 후 이루어져야 한다는 정착 제는 조직 안정화 때문에 표 피 일관성을 변경, 쉽게 껍질.
모든 immunohistochemistry 단계를 수행 하는 동안 날개 (락 플랫폼) 지속적인 운동에는 반드시.입니다 운동 교환 및 세척 및 외피는 솔루션의 침투를 향상 시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 부드럽게이 깨지기 쉬운 구조 (즉, 그것은 충분 한 플랫폼의 진동 약간 액체 매체 포함 된 이동의 형태에서 원치 않는 왜곡의 발생을 방지 하는 그들을 수행 하는 것이 중요 하다 샘플)입니다.
이 절차에서는 번데기 윙 절 개에 대 한 이미 게시 된 방법에 대 한 대체 및 보완 접근 합니다.

초파리 날개 날개 imaginal 디스크에서 개발 된다. 이러한 날개 디스크의 원시 배아 상피에서 invaginate는 20-30 imaginal 셀의 작은 그룹으로 배아 개발 하는 동안 옆으로 배치 됩니다. 유 충 탈피 세 번째 단계로 성장 하는 동안 유사 분열에서에서 발생 합니다 imaginal 셀에 특정 특성의 숫자 (약 50000 셀)을 제기 하 고 날개를 형성 디스크1,2,3, 4. 셀 확산, 그들은 패션 관 상피, 자동 접이식 소형 나선 결과. Pupation, 동안 디스크 상피 형태 2 층 날개 밖으로 망원경 그리고 경도 정 맥 시작 그들 사이 격차는 날개 발달5,6동안 두 번 발생 합니다.
항상 혈관의 배치는 동일한 패턴; 쉽게 모든 변경 내에서 혈관 형성을 식별 하는 기능 돌연변이 매우 표시 (예: 누락 되거나 추가 정 맥, 정 맥의 위치, 등등에서 변화.) 합니다. 흥미롭게도, 표현 형 변이 일반적으로 신호 경로 날개 개발와 관련 된 알려진 또는 소설 구성에 돌연변이의 증거. 경로 위치를 결정 하 고 정 맥 및 intervein 영토를 유지 하는 역할을 수행 중 이다 Hedgehog (Hh) 통로6,,78.
모델 시스템으로 번데기 날개의 중요성을 감안할 때, 그것은 함께 작동 하도록 좋은 품질 샘플을 얻기 위해 중요 한 됩니다. 과거에는, 날개 초파리 해 부 프로토콜 게시 과학자 하지 실행할 수 있는 샘플을 달성 하기 위해 적절 한 가이드를 주었을 합니다. 연구원의 지도 없이 하나 명확 하 게 과정을 시각화 수 없습니다. 이러한 대체 해 접근 번데기 2, 조직 주위에서 날개 분리 분할 이며 반복적으로 파편을 제거 하기 위하여 세척. 이런이 종류의 자유로운 날개를 두고 접근 주장의 오염 하지만 이전 경험 때문에 프로세스는 느린 고 연약한 날개9의 구조를 손상의 더 높은 기회가 있다.
여기에 설명 된 절차를 특정 단백질 또는 사본 immunodetection 프로토콜 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 실험을 사용 하 여 적합 한 번데기 날개 샘플 받는 신속 하 고 효율적인 방법을 찾을 수 수요에 의해 개발 되었다. 이 표현과 패치 (Ptc 또는 Hh 통로의 정식 수용 체)의 지역화를 설명 하기 위해 번데기 날개 샘플을 성공적으로 수행 완료 관련 세부 정보를 포함 하는 프로토콜을 제공에서 발견 되 절차입니다.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with cool light illumination</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plastic dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 or p200 pipette</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC treated water</td><td>MO.BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol&lt;br/&gt; (1/600 working dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (fly stock)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

초파리 melanogaster 의 날개 개발 조직 수준에서 morphogenesis 공부에 대 한 이상적인 모델입니다. 이러한 부속 라는 날개 imaginal 디스크 배아 발달 동안에 형성 하는 세포의 그룹에서 개발. 애벌레 단계에서 imaginal 디스크 성장, 세포의 수를 증가 하 고 monolayered 상피 구조를 형성. 번데기의 경우, 내부 imaginal 디스크 밖으로 새싹 되는 날개의 앞 여백 선 따라 bilayers에 접어. 이 과정 동안, 경도 primodia 정 맥 정 맥 셀 날개의 장래 등 쪽과 복 부 표면에 시작 됩니다. 번데기 단계에서 각 표면의 정 맥 세포의 줄무늬 꽉 튜브;를 생성 하기 위해 의사 소통 동시에 간 정 맥 그들의 형성을 시작합니다.
적절 한 분자 마커의 도움으로 개발 하는 동안 날개를 구성 하는 주요 요소를 식별 가능 하다. 이러한 이유로 정확 하 게이 구조에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍요로 움과 날개의 개발 프로세스에 관련 된 지역화를 공부 하 고 중요 합니다.
절차는 여기 조작 번데기 날개, 날개를 해 부하는 번데기 단계에서 하는 방법에 자세한 지침을 제공에 초점을 맞추고 설명 합니다. 번데기 조직의 해 부 3 탈피 애벌레에 있는 그들의 대조 물 보다 수행 하기 위해 더 어렵습니다. 이 때문에이 이렇게 신속 하 고 효율적인 고품질 샘플을 얻기 위해, 개발 되었다. Immunostain 및 마운트 하는 방법의 세부 사항은 단백질 또는 세포 구성 요소, 시각화 수 있도록 이러한 날개 샘플 프로토콜에서 제공 됩니다. 작은 전문 그것 시간의 짧은 금액에 8-10 고품질 번데기 날개를 수집 가능 하다.

프로토콜에는 날개의 익숙한 형태를 유지 하는 번데기 날개 샘플을 얻기 위해 간단한 방법을 제공 합니다. 이 준비에서 2 차원 또는 3 차원 분포 및 날개의 분화 중 단백질의 농축 조사로 예상 될 수 있는 이미지의 더미를 얻을 수 있다. 유사한 프로토콜 수집 보완 deoxyribonucleic acid (cDNA), PCR 반응에 사용 된 서식 파일을 합성 하는 데 필요한 큰 번데기 날개 샘플 (관련 된 50-80 번데기 날개)를 사용할 수 있습니다 (2.9에 참고 참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55854/55854fig1.jpg"> 
그림 1 :에서 hedgehog 통로 유전자 초파리 번데기 날개 
(A) 패치, Hedgehog 통로의 정식 수용 체에서 24-30 h APF 가시화 했다 마우스 안티-를 사용 하 여 Ptc 핵 했다 counterstained DAPI와 반면 걸 필 라 멘 트 그린 형광 phalloidin를 사용 하 여 시각화 됩니다. 말라 배포 지역화 날개 정 맥 및 패치 식과의 관계에 도움이 됩니다. 동시에 phalloidin 얼룩 일부 hemocytes 및 조직의 오염으로 지방 방울 (큰 원)의 존재를 보여준다. 20 배 확대, 앞쪽입니다. 바, 100 µ m (B) 규모 Amplicons 걸 을 (레인 1, 280 혈압) 및 ptc (레인 2, 236 bp) 메신저 RNA (mRNA) 날개 샘플 비슷한 해 부 프로토콜에 의해 생성 된 cDNA synthetized를 사용 하 여 얻은 했다. Mw로, 분자량입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55854/55854fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

8.0K 조회수.  Laboratorio de Biología del Desarrollo. 정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.

비디오: A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

연구

유전학

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

신경과학

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

발생학

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

초파리 날개 디스크에서 이미징 Dpp 릴리스

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

생물학

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

초파리 번데기 내에서 염증 성 세포 역학의 장기 Vivo에서 추적

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

면역학 및 감염병학

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Drosophila Pupal Notum 해부, 고정 및 시각화

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

초파리 유충 상상 디스크 해부: 상피 발달을 관찰하는 방법

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...