무엇보다도이 프로젝트에 참여한 어머니 들께 진심으로 감사드립니다. 다음으로, 우리는 샘플링 절차, 마취과 의사, 간호사 마취 전문의 및 외과 간호사를 돕고 촉진 한 모든 인원을 인정합니다. 이 프로젝트는 남유럽 노르웨이 지역 보건 당국과 노르웨이의 여성 건강, 오슬로 대학 자문단 및 오슬로 대학 병원이 제공하는 지역 기금으로 기금을 마련하지 않고는 불가능했을 것입니다.

이 연구는 오슬로 대학 병원의 데이터 보호 관리 및 노르웨이 남부 의료 보건 연구 윤리위원회 (2419/2011)의 승인을 받았습니다. 모든 참가자는 포함시 서면 동의서에 서명했습니다. 1. 준비 사항 참고 : 절차 일정은 그림 1에 요약되어 있습니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" /> 그림 1 : 4- 용기 시료 채취 절차에 관련된 타이밍과 인원을 설명하는 순서도. 하나의 색상은 한 사람을 나타냅니다. 방법에 대한 자세한 설명은 프로토콜에 나와 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 직원 <ol><li&gt; 초음파 측정을 수행하는 고도로 숙련 된 태아 의학 전문가, 수술을 담당하는 산부인과 의사, 산과 의사 중 한 명과 샘플을 채취하는 간호사 두 명, 혈액 가스 분석을 담당하는 조교 1 명, 연속적으로 그리고 수집 직후 다른 샘플. 참고 :보다 고급 수집 태반 조직의 경우, 추가 사람이 필요합니다. </li></ol></li><li> 장비 <ol><li> 장비, 얼음 콜드 1 M 인산염 완충 식염수 (PBS) 50 ML, 차가운 RNA 안정 솔루션 25 ML과 최적의 절단 온도 화합물 (OCT) 0.5 ML의 5 ML을 준비합니다. vacutainers 및 튜브를 표시합니다. 장비의 임시 목록을 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 모성 특성 <ol><li> 모성 임상 및 비 임상 특징을 포함하여 기록하고 관련 질문과 저를 반복하십시오.인도시 체중을 포함한 유지 관리비. 제왕 절개 전에 절식 기간을 기록하고 수술 중 저혈압 증상을 기록하십시오. 참고 : 세계 임신 협동 조합 (COLAB)의 최신 간행물에보고 된 최소한의 산모 임상 데이터 세트를 포함하십시오. 이 기사는 또한 연구 집단을 선정 할 때 매우 중요한 몇 가지 측면을 포함하고 있으므로 연구를 계획하는 동안 다루어야합니다 18 . </li><li> 민족, 나이 및 체질량 지수 (BMI)를 포함한 부계 특징을 기록하는 것을 고려하십시오. </li></ol> 3. 초음파 <ol><li> 단식 상태의 여성과 함께 배달 당일 도플러 초음파 검사를 수행하십시오. 대동맥과 대정맥의 압박을 피하기 위해 태아의 정지 상태에서 여성을 반 앙복 자세로 검사하고 관심 부위와 약간 반대 방향으로 기울입니다. 에서 출력 모니터링디스플레이상의 기계적 및 열적 인덱스에 의한 강도. </li><li> 탯줄 정맥 <ol><li> 태아 복부의 시상 또는 사시 절제로 제대 정맥을 시각화하십시오. 눈에 보이는 가지 이전에 복부 제대 정맥의 직선 부분에서 내부 혈관 직경을 측정합니다. 정규 B 모드를 사용하고 혈관 직경을 측정하기 위해 수직 인 오손 각도에서 혈관을 가시화하고 박동 직경 변화의 영향을 최소화하기 위해 이후의 측정을위한 몇 가지 최적의 프레임을 유지합니다. <ol><li> 측정을 5 ~ 10 배 (19)를 반복합니다. </li></ol></li><li> 동일한 사이트에서 도플러 초음파를 사용하고 시간 평균 최대 속도 (TAMX)를 측정하기 위해 가능한 한 낮은 주입 각도 (항상 &lt;30 °)를 얻기 위해 프로브를 조정하십시오. 3 - 5 초 (비 맥동 흐름)의 속도를 구하십시오. </li></ol></li><li> 자궁 동맥 <ol><li> 도플러 사용자궁 동맥이 내 장골 동맥에서 분지 된 직후에 외 골반 동맥을 가로 지르는 동안 자궁 동맥을 시각화하는 초음파입니다. 이 부위에서 프로브를 조정하여 낮은 발병 각도 (항상 &lt;30 °)를 얻고 TAMX를 측정하십시오. 3 개의 심장주기의 평균 속도로 속도를 구하십시오. </li><li> 동일한 위치에서 TAMX가 측정되는 것과 같은 위치에서 수직 각도를 얻지는 않을 것이므로 직경 측정을위한 위치에 가깝게 직경 측정을위한 정확한 각도를 얻기 위해 용기를 원위리로 따라 가십시오. 컬러 도플러 초음파로 평가 한 바에 따라이 부위 이전에 눈에 보이는 혈관이 분지되면 직경 측정을 제외하십시오. <ol><li> 정규 B 모드를 사용하고 혈관 직경을 측정하기 위해 수직 인 오손 각도에서 혈관을 가시화하고 박동 직경 변화의 영향을 최소화하기 위해 이후의 측정을위한 몇 가지 최적의 프레임을 유지합니다. </li><li> 측정을 5 ~ 10 배 (19)를 반복합니다. </li></ol></<html> li&gt; </ol></li><li> 태반의 위치를 ​​기록하십시오. </li></ol> 4. 4 혈관 혈액 샘플링 참고 : 절차 일정은 그림 1에 나와 있으며 샘플 개요는 그림 2에 나와 있습니다. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" /> 그림 2 : 태반 혈관 및 표본 추출 사이트의 개략도. 4 혈관 샘플링 방법에서 혈액 샘플은 자궁 정맥, 요골 동맥 (자궁 동맥의 대용 물) 및 제대 동맥 및 정맥에서 가져옵니다. 자궁 동맥과 제대 정맥의 혈류는 초음파로 측정됩니다. 태반의 조직 샘플을 수집합니다. 삽화 : Øystein H. Horgmo, 오슬로 대학.5847fig2large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <ol><li> 안전 절차 <ol><li> 작업장의 모든 인원에게 장갑, 수술 용 양복, 마스크 및 모자를 착용하십시오. </li><li> 외과 의사 및 연구 인력에게 외과 수술 용 복장, 마스크, 모자, 가운 및 이중 장갑을 착용하십시오. 안경은 옵션입니다. </li><li> 혈액 샘플을 장갑으로 취급하는 직원을 제공하십시오. </li><li> 태반 샘플을 장갑과 외과 용 마스크로 다루는 요원을 제공하십시오. 균질화에는 후드 사용이 필요합니다. </li></ol></li><li> 수술실에서의 준비 <ol><li> 브리핑을하고 수술 시작 전 샘플링을 돕는 모든 요원에게 장비를 건네주십시오. </li><li> 필요한 말초 동맥 및 정맥 접근을 도와 줄 마취과 의사이자 마취과 간호사와 상담하십시오.샘플링 전에 액체를 정맥 내 투여하지 마십시오. </li><li> 요골 동맥을 조력하는 사람에게 주사 바늘없는 세 개의 주사기 (10 mL)를 전 대퇴 정맥 샘플과 보조 주사기 (20 mL와 10 mL 중 한 개)와 혈액 가스 주사기 (헤파린과 함께) 한 사람에게 준다. </li><li> 수술 필드에 2 개의 멸균 주사기 (20 mL), 5 개의 멸균 주사기 (10 mL), 3 개의 &quot;나비 바늘&quot;및 2 개의 혈액 가스 주사기를 준비하십시오. </li></ol></li><li> 혈관에 접근. <ol><li> 제왕 절개 전에 표준 절차를 따라 말초 정맥 주사 (iv) 접근을 보장하십시오. 참고 : 전두엽 정맥은이 부위에서 샘플을 추출하기 쉽기 때문에 바람직합니다. </li><li> 초음파 또는 촉진에 의해 손목에서 요골 동맥을 국소화하십시오. 피하 리도카인 진통제 0.5 mL에 따라 요골 동맥에 동맥을 삽입한다. 삽입이 3 회 실패한 경우이 사이트에서 샘플링을 포기합니다.여자가 삽입 중에 통증을 느낀다. 참고 : 표준 절차에 따라 제왕 절개 수술 절차를 수행하십시오. 샘플링 절차에 필요한 조정 만 아래에 밑줄이 그어져 있습니다. </li></ol></li><li> 모성 혈액 샘플 참고 : 자궁 절개 전에 세 모체 혈액 샘플 (자궁 정맥, 요골 동맥 및 전두 정맥)을 동시에 얻습니다. <ol><li> 자궁 정맥 들어, 복강을 열고 복벽을 들어 올리고 자궁 앞쪽에 자궁 정맥의 주요 가지를 드러내는 견인기를 사용합니다. 태반과 같은면의 자궁 정맥 분지에서 혈액을 채취하거나 태반이 자궁 정중선에 위치하면 가장 두드러진 정맥을 사용하십시오. <ol><li> 자궁 정맥의 혈액 가스 주사기에 버터 플라이 바늘을 약 30도 각도로 삽입하고 부드러운 흡입을 피하여 혈액을 채취합니다.용혈. 나비 바늘의 iv 위치를 조심스럽게 고정한 채로 채워진 혈액 가스 주사기를 20 mL와 10 mL 주사기로 연속적으로 교체하십시오. 참고 : 최적의 접근은 선택한 자궁 정맥의 반대쪽에 서있을 때 가장 잘 보장됩니다. </li></ol></li><li> 요골 동맥의 경우, 동맥 내에서 흡인을하십시오. 첫 번째 5 mL를 버리고 혈액 가스 분석을 위해 헤파린 주사기에서 3 mL를 흡입 한 다음 두 개의 주사기 (20 + 10 mL)에서 3 mL를 흡입합니다. </li><li> 대퇴 정맥을 위해서는 정맥 카테터에서 천천히 흡인하십시오. 첫 번째 5 mL를 버리고 세 개의 주사기 (10 mL)로 30 mL를 흡입하십시오. </li><li> 복부 폐쇄를 시작하기 전에 자궁 정맥의 샘플링 위치를 최종 검사하십시오. </li></ol></li><li> 태아 혈액 샘플 <ol><li> 아이가 태어 났을 때 즉시 제대를 고정 시키거나 태반을 옮기지 않고 제대 동맥으로부터 혈액을 배출하십시오. 기지 시작혈액 가스 분석을위한 주사기를 사용하고 가능한 경우 3 개의 10 mL 주사기를 따르십시오. </li><li> 동맥 표본이 확보되면 제대 정맥 (혈액 가스 및 20 + 10mL 주사기)에서 표본 추출하기 전에 코드를 클램프하고 조산사에게 아이를 넘겨줍니다. 참고 : 자발적으로 분리하지 않은 경우 출산 후 몇 초 내에 모든 제대 시료를 수집하고 태반 을 제자리에 놓습니다. </li><li> 후기 코드 고정에 관한 노르웨이의 권장 사항을 따르십시오. 고민이 된 어린이의 경우 즉시 코드를 조이고 자르십시오. 조산사 및 신생아 전문의에게 아이를 넘겨주십시오. </li></ol></li><li> 혈액 샘플 취급 <ol><li> 나머지 혈액 샘플을 준비하면서 혈액 가스 주사기를 얼음에 담아 혈액 가스 분석기에서 5 분 이내에 분석하십시오. </li><li> 혈액 샘플을 즉시 vacutainers로 옮기고 얼음 위에 올려 놓기 전에 1-2 분 동안 로커에 플라스마 튜브를 놓습니다. 혈청 튜브를 노동에 맡기십시오.30 분 동안 정착하기위한 벤치. 참고 : 5 개의 사이트 모두에서 양질의 품질을 유지하기 위해 동시에 샘플을 준비해야하기 때문에 이것은주의가 필요한 절차에서 중요한 단계입니다. </li><li> 가능한 한 빨리 플라스마 샘플을 원심 분리기에 넣고 30 분 이내에 6 ° C, 2,500 xg에서 20 분간 원심 분리하십시오. </li><li> 30 분 후, 2,500 x g에서 10 분간 실온에서 혈청 샘플을 원심 분리한다. </li><li> 분주는 혈장없는 혈장을 보장하기 위해 펠렛 위에 뜨는 0.5 ML을 떠나, 2 ML cryo 튜브에 신중하게 뜨는. </li><li> 샘플을 -80 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 5. 태반 조직의 수집 <ol><li> 태반이 납품 된 후 가능한 한 빨리 얼음으로 냉각 된 절개 트레이에 내려 놓습니다. 가장 긴 직경과 직경을 90도까지 사진 으로 찍고 측정하십시오. </li><li> 태반 무게를 잰다. </li><li> 무게, 두 직경, 모든 g를 기록하십시오.로스 병리학, 탯줄에 혈관 수 및 배달에서 태반을 얼음 위에 놓았을 때까지의 시간 간격. 참고 : 임상 적으로 표시된 경우 병리 검사에 태반을 보냅니다. </li><li> 산모 표면이 위로 향한 태반을 놓고 솔직한 병리학 영역을 피하면서 태반의 각 사분면에 무작위로 위치한 4 - 5 개의 샘플링 사이트를 확인합니다. 가위를 사용하여 탈모기를 제거하여 산모 표면에서 3 - 5mm 떨어진 곳을 잘라냅니다. 각 사이트에서 1 ~ 2cm 3 조각의 융모 조직을 수집합니다. </li><li> 콜드 1M PBS 50 ML에서 부드럽게 수집 된 조직을 씻으십시오. 각 샘플링 사이트와 분액에서 여러 조각으로 나눕니다. 참고 : 태반 조각의 크기는 계획된 분석에 따라 달라집니다. </li><li> 0.1 - 0.5 cm 3 티슈 샘플의 분취 량을 5 개의 냉동 튜브에 첨가하고 액체 질소로 급속 냉동하십시오. </li><li> RNA 안정화 용액 25 mL와 함께 0.1 - 0.2 cm 3 의 작은 조각을 튜브에 첨가한다. 4시에 쇼핑6, 24 시간 동안 RNA 안정화 용액을 폐기하고 그것을 대체하십시오. 얼다. </li><li> OCT 0.5 mL가 달린 5 개의 cryo tube에 0.5 cm 3의 조각을 넣고, OCT로 위로 올려 놓고 혼합하고 동결시킨다. </li><li> 분석 할 때까지 시료를 -80 ° C에 보관하십시오. 참고 : Burton et al. 계획된 분석에 따라 태반 샘플링의 실용적인 측면에 대한 훌륭한 개요를 제공합니다. 20 microvillous 및 기초 막 분리에 대한 나머지 조직을 제조하고, 진공 흡착 방식에 의해 탈락 조직을 수집하기 위해 고려한다. 21 , 22 </li></ol> 6. 신생아의 특성 <ol><li> Apgar- 점수 (1, 5 및 10 분), 성별, 체중, 길이, 재태 연령 및 신생아 집중 치료실 (입원 기간 및 결과)에 대한 입원을 포함하여 신생아 특성을 기록하십시오. </li><li> 인체 측정, 공기 치환에 의한 신생아 신체 조성 측정 고려또는 X-ray 흡광도 측정법으로 측정 할 수 있습니다. 23 , 24 </li></ol> 7. 계산 <ol><li> 방사형 및 자궁 동맥에서 유사한 혈액 조성을 가정하고 자궁 평활근 정 농도 차이를 계산하십시오. 자궁 동정맥 농도 차이 = C A - C V 정맥 - 동맥 농도 차이 = C v - C a 여기서 C는 첨자가있는 농도 : A, 요골 동맥; V, 자궁 정맥; v 배꼽 정맥과 배꼽 동맥. </li><li> 체적 유량, mL / min (Q)을 계산하시오. <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" /> 여기서 D는 혈관 직경 (cm)이고, TAMX는 시간 평균 최대 속도이고, h는 공간 혈액 속도 프로파일의 계수입니다. 제대 정맥의 계수로 0.5를 사용하고자궁 동맥 (25), (26) 0.6. </li><li> Fick의 원리에 따라 태반 섭취량과 출산량을 계산하십시오 : 자궁 입구 섭취 = ( C A - C V ) x Qm 태아 흡수 = (C의 V - C가) x Q f 아래 첨자 : m, 모성 및 f, 태아. </li></ol>

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<html> 태반 4 혈관 샘플링 방법은 세 가지 주요 목적과 관련이 있습니다. 첫째, 우리의 포도당과 아미노산 연구에 의해 입증 된 것처럼 특정 물질이 어떻게 모체 측의 태반에 흡수되어 제대혈과 태아로 옮겨지는지를 연구하는데 사용될 수 있습니다. 둘째,이 방법은 프로게스테론 결과에 의해 입증 된 것처럼, 태반에 의해 생성되어 산모 또는 태아 순환계로 방출되는 물질을 연구하는 데 매우 관련이 있습니다. 셋째, 빠른 성장과 조직 개조 과정 에서 생체 내 태아 가 어떻게 폐기물을 제거하는지 연구하는 것이 유용 할 수 있습니다. 4-vessel 방법의 중요 단계 및 물류 문제 태반 4 혈관 표본 추출은 정상적인 생리 임신 8 , 10 , 11 에서 생체 내 다량 영양소의 태반 전이를 결정하는데 사용되어왔다 .ss = &quot;xref&quot;&gt; 12, 그러나 연구 대상이 제한되어 있습니다. 4 용기 샘플링의 제한된 사용은 아마도 절차의 까다로운 물류 때문일 것입니다. 태아 의학, 산부인과 및 마취과 부서의 환자, 연구원 및 직원 간의 성공적인 조정은이 방법을 사용하는 데 필수적입니다. 우리는 주요 수사관 중 몇 명이 산과 의사이며 임상 적 절차와 핵심 인력을 아는 것이 큰 이점이라고 생각합니다. 따라서 연구 절차가 매일의 임상 실습과 함께 시행되었습니다. 절차의 모든 단계를 조정하고 확보함으로써, 우리는 200 개 이상의 산모 / 신생아 쌍으로부터 샘플을 얻었습니다. 또한 샘플링 절차를 성공적으로 수행하는 데 결정적인 기술적 과제가 있기 때문에 샘플링 절차를 거의 손에 쥐지 않아야하며 너무 많은 샘플러로 인해 불필요한 데이터 변형 소스가 생길 수 있습니다. 결과우리는 모든 초음파 검사가 동일한 초음파 검사기를 사용하여 같은 검사관에 의해 수행되어야한다고 권고합니다. 선박 벽의 해상도가 중요하기 때문에 장비를 신중하게 선택해야합니다. 세 번째 삼 분기의 자궁 동맥은 특히 기술적으로 측정하기가 어렵습니다. 자궁 크기와 내용으로 인해 직경 측정에 사용되는 수직 주입 각도와 정확한 동일 사이트에서 유속 측정을위한 낮은 주입 각도를 모두 얻지 못하기 때문입니다. 또한 성공적인 혈액 샘플링을 위해서는 자궁 정맥의 적절한 샘플링 위치를 식별하고 부드러운 흡인이 필요합니다. 배꼽 측면에서 태아 적혈구의 취약성은 흡인력에 특별한주의가 필요합니다. 유아에게 전달 지연 또는 경미한 스트레스가 제대 동맥의 조기 수축과 연관되어 우리 동맥 시료 양이 감소하는 것은 우리의 경험입니다. <strong&gt; 4- 용기 방법의 윤리적 문제 &quot;태반 4 혈관 샘플링&quot;방법은 침습적이고 까다로운 절차입니다. 따라서 불필요한 시료 채취 절차를 피하기 위해 연구 질문에 따라 포함 및 제외 기준을 정의해야합니다. 제왕 절개를위한 적응증이 연구 프로젝트 참여에 영향을 미치지 않도록 전달 방식에 대한 결정이 내려지면 환자에게만 접근해야합니다. 절차가 운영 극장에서 약간의 추가 시간을 필요로하지만, 샘플링으로 인한 불편 함과 방해를 제한하기 위해 더 많은 직원이 필요합니다. 우리는 동맥 라인의 삽입이 덜 침습적이며 동맥과 정맥에서 동시에 샘플링을 보장하므로 자궁 동맥의 프록시로 요골 동맥을 사용했습니다. 일부 그룹에서는 동맥혈을 사용하는데, 이는 덜 침습적 인 절차입니다 13 . 그러나, apa동맥류와 관련하여 국소 혈종의 발병 1 건에서 손의 일시적인 감각 이상을 겪었을 때, 우리는 4 곳 중 어디에서든지 샘플링 중에 부작용을 경험하지 않았다. 특히 우리는 천자 된 자궁 정맥에서 출혈을 관찰하지 못했습니다. 4 용기 법의 방법 론적 / 분석적 이슈 태반 4 혈관 연구의 결과 해석에있어 몇 가지 방법론적인 문제를 다루는 것이 중요합니다. 첫째, 태반에 의해 흡수되거나 방출되는 물질의 질량을 계산하는 것이 목표라면, 혈액 통과량을 고려하는 것이 중요합니다. 자궁 정맥은 태반을 배수 할뿐만 아니라 자궁 근을 배수하고 다양한 정도의 자궁 혈관계가 난소 및 질 혈관계와 함께 문 합한다는 것을 명심해야합니다. 다음으로, 태반을 가로 지르는 물의 교환이 집중에 영향을 미칠 수 있다고 생각하는 것이 중요합니다배급량이 측정되고, 이에 따라 계산 된 동정 농도 차이에 영향을 미친다. 이상적으로 이것은 모체 - 태아 쌍 각각에서 잃어 버리거나 얻은 물의 농도 차이를 조정함으로써 가장 잘 해결됩니다. 이는 태반이나 자궁에 의해 흡수되거나 방출되지 않는 물질을 측정함으로써 얻을 수 있습니다. 헤모글로빈 농도 또는 적혈구의 계산 된 백분율 (헤마토크릿)은 물 교환에 대한 보정 요인으로 작용할 수 있습니다. 또한, 태반의 산모 측에서 화합물의 흡수 또는 방출을 해석 할 때, 비교를 위해 다른 조직에서 동정맥의 차이를 얻는 것이 중요 할 수있다. 따라서 우리는 태반에 대한 동정맥의 차이를 팔뚝의 모세 혈관과 비교함으로써 태반의 특정 특징을 규명하기 위해 전두 정맥으로부터 혈액 샘플을 포함시켰다. 우리는이 비교가 특히 sFlt-1 및 태반 성장 fa의 태반 분비를 시험 할 때 흥미 롭다는 것을 발견했다전신의 ctor 내피 세포는 상기 화합물 (14)의 잠재적 인 소스가 될 수 있기 때문이다. 연구 질문에 따라 태반의 효율, 즉 (mmol / L) / kg 또는 (mmol / min) / kg 태반의 양을 계산하기 위해 동정맥의 차이를 태반의 무게와 관련시키는 것이 중요 할 수 있습니다. 4 용기 법의 한계와 강점 태반 생리학은 질 분만의 스트레스보다 제왕 절개의 영향을 덜 받지만,이 방법에는 몇 가지 한계가 있습니다. 대부분의 경우 임신 중 합병증 (예 : 자간전증, 당뇨병, 비만 및 중등도 태아 거식증)의 경우 질 분만을 권장합니다. 이는 임신을 제한하고 편향시킬 수 있습니다. 방법의 모든 단계를 최적화하는 경우에도 혈액 샘플링 절차 및 초음파 볼륨의 기술적 인 어려움으로 인해 각 환자에서 완전한 측정 및 샘플을 얻기가 어렵습니다.유량 측정 ( 그림 3 ). 또한, 초음파 측정은 가능한 한 수술 시간에 가깝게 수행되지만, 척추 마취와 혈액 채취 전에 본질적으로 수행됩니다. 이로부터 산모의 심장 출력 (CO)이 변할 수 있고 태아 (심지어 태아 - 태반) 혈류에도 영향을 줄 수 있습니다. 척추 마취로 인한 CO의 가능한 변화는 현재 연구에서 사용 된 phenylephrine에 의해 보상 될 수 있습니다. 우리 참여자의 하위 집합 (n = 23)의 예비 데이터는 척수 마취 이전 및 샘플링 시점 (미공개 데이터)에서 CO에 유의 한 변화를 나타내지 않았다. 인간과 대조적으로 4 혈관 샘플링 방법을 사용하면 시간 변수를 도입하고 혈액 내용을 조작 할 가능성이 제한됩니다 ( 5 , 29 , 30) . 이러한 고려 사항들로부터, 4 용기<html> 샘플링 방법은 본질적으로 횡단면이며 대부분 관측되며, 얻어진 데이터는 그에 따라 분석되어야한다. 반면에 4 혈관 샘플링 방법은 생체 내에서 인간 태반 생리학 및 병태 생리학을 연구 할 수있는 유일한 가능성을 제공하며, 모든 상호 작용 인자 가 생체 외에서 재생산 될 수없는 상황입니다. 그것은 동물 또는 다른 실험적 연구에서 나온 가설을 시험 할 수있는 훌륭한 기회를 제공합니다. 마찬가지로, 그것은 시험 관내 및 동물 연구에서 기계적 으로 시험 될 필요가있는 새로운 가설을 생성 할 수있다. 4-vessel 방법의 잠재적 응용 병리학 적 임신에서 산모와 태아의 동정맥혈 농도 차이는 지금까지 별도로 연구되어 왔고 기존의 가설 중 일부를 생체 내에서 시험 할 수 있었다 15 , 16 ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 31. 4 혈관 표본 채취 방법은 병리학 적 임신에서 별도의 개체가 아닌 모체, 태반 및 태아 단위를 함께 연구 할 수있는 매력적인 기회를 제공하며 모계와 태아 간의 상호 작용 범위 내에서 새로운 질문과 새로운 질문에 새로운 시각을 제시 할 수 있습니다. 4 혈관 표본 채취 방법은 표본의 추가 분석에 따라 정상 및 병리학 임신 모두에서 다양한 범위의 연구 문제에 적용될 수 있습니다. Vacutainers의 선택, 혈액의 양, 태반의 범위 및 기타 조직 샘플은 연구 질문에 따라 결정되어야합니다. Burton et al. 최근에 태반 조직의 양질 샘플을 확보하고 다량의 샘플을 필요로하는 특정 퍼즐을 해결하기 위해 다른 바이오 뱅크 병합을 허용하는 절차를 설명하는 우수한 논문을 발표했습니다 20 . 4 혈관 샘플은 모세 혈관에 exosomes의 특정 릴리스를 연구하기 위해 분석 수 있습니다알 순환, 약물, 대사 물질 및 독소의 전달. 큰 규모의 오믹 (metabolomics, proteomics 및 lipidomics) 분석은 태반에 의해 분비되는 모체 혈장의 물질 및 대사 산물을 식별 할 수 있습니다. 따라서 4 혈관 샘플링 방법의 수립은 모체 순환에서 태반 유도 인자를 확인하고 태반 기능의 바이오 마커를 고발 할 수있다. 산모 태아 영양 모세포의 태아와 마주 친 미생물과 태아가 마주하고있는 기저 세포막을 분리하는 기술과 함께, 물질 전달은 관련 전달 단백질 21 의 활성과 위치와 함께 연구 될 수있다. 또한 4 개의 혈관에서 영양염과 미량 영양소의 수준을 분석하고 태반 32 의 영양소와 에너지 감지 시스템의 측정에 영양물 전달을 관련시킴으로써 생체 내에서 영양염 전달 을 조절하는 메커니즘이 밝혀 질 수 있습니다 32 </sup&gt;. 안정한 동위 원소의 사용과 4 용기 시료 채취의 결합은 아미노산 전달 33에서 입증 된 것처럼보다 역동적이고 기계 론적 인 정보를 제공하는 강력한 접근법이 될 수 있습니다. 전달하기 전에 포도당 주입은 또 다른 가능한 접근법입니다. 태반 전이는 BMI, 포도당 및 혈장 지질 프로필과 같은 산모의 대사 변수와 출생 체중 및 신체 조성과 같은 태아 결과와 관련이있을 수 있습니다 18 . 함께, 이러한 접근법은 아마도 태아의 통합 역할을 나타낼 것이며, 모성과 태아의 조건과 필요 사이의 상호 작용의 중심에 위치한다.

미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 따르면, 태반은 인체 1 , 2 , 3 에서 가장 잘 이해되지 않는 기관입니다. 진행중인 임신에 비 윤리적 위험을 가하지 않으면 서 생체 내 에서 인간 태반 에 접근하여 연구하기가 어렵습니다. 그러므로 인간의 태반 기능에 대한 연구는 주로 시험 관내 및 생체 외 모델에 기반을두고있다. 태반 수송과 대사에 대한 이전 의 생체 내 연구의 대부분은 동물 4 , 5 , 6 에서 수행되었다. 그러나 태반의 구조와 기능은 종간에 상당히 다르기 때문에 인간에서 동물로 결과를 외삽하는 것은 신중해야한다. 인간 생체 내 (in vivo) 연구 에서 태아와 태아의 흡수 및 정상 생리학모든 조건을 가지고 있으며 , 화합물 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 의 통합 전이를 연구 한 사람은 없다. 이러한 기초 연구는 인간 태반에 대한 생체 내 연구가 가능하며 여러 목적을 달성 할 수 있음을 보여줍니다. 첫째, 현재 체외 , 체외 및 동물 연구 에서 유래 한 태반 기능의 현재 개념을 인간 환경에서 시험 할 수 있으므로 인간 태반에 대한 새롭고보다 구체적인 통찰력을 얻을 수 있습니다. 둘째, 비정상 태아 성장, 자간전증, 모성 당뇨병, 대사 증후군 및 기타 모체 대사 장애와 관련된 기능 장애 태반의 특성이 더 잘 특성화 될 수 있습니다. 셋째, 인간 생체 내 연구는 진단을 개발할 수있는 기회를 제공한다.틱 기능과 예측 도구. 이 배경에서 우리 는 생체 내 인간의 태반 기능을 조사하기 위해 생리 학적 데이터의 종합적인 수집을 목표로 삼았습니다 . 계획된 제왕 절개 동안, 우리는 자궁 정맥에 대한 복강 내 접근을 이용하여 태반의 모성 및 태아 측 (4 혈관 샘플링 방법)에서 들어오고 나가는 혈관으로부터 혈액 샘플을 수집합니다. 이 샘플은 영양소 및 기타 물질 (14)의 쌍 동정맥 농도 차이를 계산하는 데 사용됩니다. 또한 초음파를 이용하여 태반 양측의 체적 유량을 측정합니다. 따라서, 모든 화합물의 태반 및 태아 섭취를 정량화 할 수있다. 또한, 태반에 의해 방출되는 물질을 산모 및 태아 순환계 15 , 16 , 17 로 결정하는 것이 가능합니다. 결합 할 때엄마와 아이의 임상 적 매개 변수와 태반 및 기타 관련 조직의 분석을 통해이 방법은 동일한 모체 - 태아 쌍 에서 생체 내 태반 기능의 여러 측면을 통합 할 수있는 흥미 진진한 잠재력을 가지고있다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Maternal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impedance scale</td><td>Tanita</td><td></td><td>or similar</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ultrasound measurements&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512 ultrasound machine</td><td>Acuson</td><td></td><td>equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Blood samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arerial cannula</td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>or similar</td></tr><tr><td>20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>or similar. 3 needed.</td></tr><tr><td>10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>or similar. 9 needed.</td></tr><tr><td>5 cc 6% Luer Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>or similar. 2 needed.</td></tr><tr><td>Arterial blood gas syringe&amp;nbsp;</td><td>Radiometer Medical</td><td></td><td>or similar. 4 needed.</td></tr><tr><td>Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td><td>(intended for single use).3 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL EDTA&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>or similar. Label with sample site. 10 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 3 mL&amp;nbsp; 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed.</td></tr><tr><td>Marked trays to transport the syringes</td><td></td><td></td><td>to transport the blood samples in the operation theatre</td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td>for gentle mixing of the samples</td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Placenta samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal ruler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>or similar. Dilute 10 M to&amp;nbsp; 1 M before use</td></tr><tr><td>RNA stabilization solution</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&amp;nbsp;</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>vwr</td><td>361603E</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>or similar. Label with &quot;RNA later&quot;, sample site and ID. 2 needed.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fetal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Measuring tape</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the 4-vessel sampling approach to integrative studies of human placental physiology in vivo

인간 태반은 여전히 utero에서 연구를 위해 매우 접근하기가 어렵습니다. 따라서 생체 내에서 인간 태반 생리학 에 대한 현재의 이해는 태반 해부학, 혈역학 및 임신 기간에있어서 종간의 다양성은 매우 높지만 동물 실험에 기반하고있다. 인간 태반 연구의 대다수는 생체 외 관류 연구 또는 시험관 내 영양막 연구입니다. 시험 관내 연구 및 동물 모델은 필수적이지만, 생체 내 인간 태반 에 대한 그러한 연구 결과의 외삽은 불확실하다. 우리 는 생체 내 에서 인간 태반 생리를 연구하고, 그 방법의 상세한 프로토콜을 제시하고자했다. 계획된 제왕 절개 도중에 자궁 절개 직전에 자궁 내 정맥에 대한 복강 내 접근을 이용하여 우리는 태반의 산모와 태아 측에서 들어오고 나가는 혈관으로부터 혈액 샘플을 채집합니다. 사기를 결합 할 때혈류량 측정을 통한 혈액 샘플의 중심 측정을 통해 태반 및 태아의 흡수 및 모든 화합물 방출을 정량화 할 수 있습니다. 또한, 동일한 모체 - 태아 쌍으로부터의 태반 조직 샘플은 운반체 밀도 및 활성 및 생체 내 태반 기능의 다른 측면의 측정을 제공 할 수있다. 이러한 4 혈관 샘플링 방법의 통합적 사용을 통해 우리는 정상 및 병리학 임신 모두에서 생체 내 태반 영양 전달 및 대사의 현재 개념을 시험 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 태반에 의해 분비되는 물질을 모체 순환으로 확인하는 것을 가능하게하는데, 이는 태반 기능 장애의 바이오 마커 검색에 중요한 공헌을 할 수 있습니다.

4 혈관 샘플링 방법은 임상 실험에 적용 가능하며 우리는 209 명의 어머니 / 유아 쌍으로부터 혈액 샘플을 성공적으로 얻었습니다. 이 중 128 회에 우리는 또한 체적 유량을 측정했습니다. 70 마리의 모체 - 태아 쌍 ( 그림 3 )에서 모체와 태아 혈관 모두의 완벽한 4 혈관 표본 추출과 양질의 혈류 측정이 이루어졌습니다. 또한, 우리는 지금까지 30 명의 자간전증 환자로부터 혈액 및 태반 샘플을 수집했습니다. 우리는 이전에 방법 14 , 15 , 16 두 응용 프로그램을 보여주는 vasoactive 요인의 placental 릴리스뿐만 아니라, 인간의 태반이 양분 전송에 대한 기사를 게시했습니다. 태반 전이를 연구하기 위해 4 혈관 법을 사용하는 방법의 예 중요한 동맥이있다.태반 양쪽에서 포도당의 생체 내 uteroplacental 및 태아의 섭취를 증명하는 포도당의 차이 ( 표 1 ). 글루코스의 태반 이동은 모체 - 태아 포도당 구배에 의존하고, 따라서 모체 포도당 수준에 의존한다. 그러나, 우리는 이전에이 기울기 및 따라서 포도당 전달이 태아 인슐린 수치와 포도당 소비에 의해 유의하게 영향을 받는다는 것을 증명했습니다. 이것은이 방법은 중요한 산모 - 태아 상호 작용 (14)을 설명하는 방법의 예입니다. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 용기 </td><td> 글루코스 농도 / L </td><td> p- 값 * </td></tr><tr><td> 방사상 동맥 </td><td> 4.49 [4.22, 4.84] </td><td></td></tr><tr><td> 자궁 정맥 </td><td> 4.23 [3.94, 4.53] </td><td></td></tr><tr><td> 탯줄 정맥 </td><td>3.78 [3.52, 4.06] </td><td></td></tr><tr><td> 탯줄 동맥 </td><td> 3.24 [2.95, 3.56] </td><td></td></tr><tr><td> 쌍 차이 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 방사상 동맥 - 자궁 정맥 </td><td> 0.29 [0.13, 0.41] </td><td> &lt;0.001 </td></tr><tr><td> 탯줄 동맥 - 배꼽 정맥 </td><td> 0.54 [0.29, 0.76] </td><td> &lt;0.001 </td></tr><tr><td> 요골 동맥 - 제대 동맥 </td><td> 1.25 [1.03, 1.51] </td><td> &lt;0.001 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 중간 값 [Q1, Q3] 포도당의 농도와 동정맥의 차이 * Wilcoxon 서명 순위 테스트 제대 순환에서 태아 포도당 섭취 (태반으로의 방출)는 태아의 포도당 섭취뿐만 아니라모체 - 태아 변화가 있지만 태반 혈류가 5 . 마찬가지로, 태반 무게 또는 출생 체중의 함수로서 태아 포도당 섭취량을 연구하는 것도 적절할 수 있습니다. n = 128에서 우리는 196.2 [158.3, 232.2] mL / min의 중간 배양액 [Q1, Q3] 총 배꼽 정맥 흐름을 발견하였고, 제대 순환에서 태반 포도당 섭취량의 중앙값을 계산 하였다 [Q1, Q3]. 0.10 [0.05, 0.15] mmol / min. 출생 체중 정상화시 0.03 [0.02, 0.04] (mmol / min) / kg입니다. 태반은 태반 1 kg 당 0.16 [0.10, 0.26] (mmol / min)을 방출합니다. 태반 섭취를 연구하기 위해 4 혈관 법을 사용하는 방법의 예 동물 연구는 글루탐산 중요한 두 아미노산 태반 산 및 태아 간 상호에, 다른 대사 경로 (27)로 연료 산화임을 시사한다. 태반 4 혈관 샘플링 방법을 사용하여 우리는( 표 2 ), 인간에서의 glutamic acid의 태아 태반 및 제대 동정의 차이. 우리는 배꼽 순환에서 글루탐산의 태반 흡수 (태아 방출)를 발견했습니다. 우리는 모체 순환에서 글루탐산을 태반으로 섭취하는 것을 발견했다. 이 두 태아의 태반 섭취는 양배추 태반이 영양소의 태반 신진 대사가 태반 전이의 조절의 일부임을 인간이 생체 내 에서 증명할 수있는 방법의 한 예입니다. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 용기 </td><td> 글루탐산 μmol / L </td><td> p- 값 * </td></tr><tr><td> 방사상 동맥 </td><td> 61.5 [51.0, 77.7] </td><td></td></tr><tr><td> 자궁 정맥 </td><td> 51.0 [36.3, 65.0] </td><td></td></tr><tr><td> 탯줄 정맥 </td><td> 39.3 [24.7, 52.8] </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 탯줄 동맥 </td><td> 44.7 [33.1, 59.3] </td><td></td></tr><tr><td> 쌍 차이 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 요골 동맥 - 자궁 정맥 </td><td> 10.4 [1.6, 21.2] </td><td> &lt;0.001 </td></tr><tr><td> 탯줄 동맥 - 제 정맥 </td><td> -8.7 [-16.0, 0.2] </td><td> &lt;0.001 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 글루타민산의 농도 [Q1, Q3] 농도와 동정맥의 차이 * Wilcoxon 서명 순위 테스트 태아 방출을 연구하기 위해 4 혈관 법을 사용하는 방법의 예 태반이 프로게스테론을 분비하고 태반의 산모 측에서 우리의 4- 혈관 법을 검증하기 위해 우리는 테드에서 프로게스테론의 생체 내 방출을 측정했다rm 28 . 우리는 모체 혈액 순환에 프로게스테론의 유의 한 태반 방출을 발견했다 ( 표 3 ). 관찰 된 동정맥의 차이는 태반에 의해 방출 된 물질을 검출하기 위해 태반 4 용기 샘플링 방법이 어떻게 사용될 수 있는지를 보여 주며, 병적 임신을 연구 할 때 매우 관련이있다. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 용기 </td><td> 프로게스테론 nmol / L </td><td> p- 값 * </td></tr><tr><td> 방사상 동맥 </td><td> 678 [514, 971] </td><td></td></tr><tr><td> 자궁 정맥 </td><td> 1852 [1059, 2786] </td><td></td></tr><tr><td> 쌍 차이 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 요골 동맥 - 자궁 정맥 </td><td> -1187 [-1855, -404] </td><td> p &lt;0.001 </td></tr></tbody></table>표 3 : 프로게스테론의 자궁 내 동정맥 내 농도와 자궁 내 동정맥 혈류량의 중앙값 [Q1, Q3] * Wilcoxon 서명 순위 테스트 <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig3v2.jpg" /> 그림 3 : 포함 된 참가자와 잃어버린 참가자의 흐름도 및 그림. A. 참여자가 포함되었음을 보여 주며, 참가자가 주로 제왕 절개 전에 출산하기 시작했거나 연구 수행에 필요한 인력 부족으로 인해 손실되었음을 보여줍니다. B. 정상 임신 완전한 -4- 혈관 혈액 샘플을 162 (91 %)을 얻었다 (청색) (: 블랙 불완전 모체 혈액 : 회색 불완전한 태아 혈액 샘플)을 179 개 여성. 물류 제약으로 인해 51 명 (28 %)의 참가자가 초음파 측정에 포함되지 않았습니다. 12 명 중초음파 검사를받은 8 명 (72 %)에서 태반 측 태아 측의 혈류 측정을 모든 참가자 (밝은 녹색)에서 얻었으나 산모와 태아 모두에서 완전한 혈류 측정은 77 명 (60 %)에서 얻어졌다. (짙은 녹색). 삽화 : Øystein H. Horgmo, 오슬로 대학. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55847/55847fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

우리는 장기간 생체 내 생체 태반 생리를 연구하기위한 상세한 방법을 제시합니다. 이 방법은 태아의 모체 및 태아 측에 유입 및 유출 혈관으로부터의 혈액 샘플링을 부피 혈류 및 태반 조직 샘플링의 초음파 측정치와 결합시킨다.

인간 태반 생리학의 통합 연구에 대한 4 혈관 샘플링 접근법<em&gt; In Vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

10.5K 조회수.  Oslo University Hospital.  우리는 장기간 생체 내 생체 태반 생리를 연구하기위한 상세한 방법을 제시합니다. 이 방법은 태아의 모체 및 태아 측에 유입 및 유출 혈관으로부터의 혈액 샘플링을 부피 혈류 및 태반 조직 샘플링의 초음파 측정치와 결합시킨다. 

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Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

연구

발생학

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

생물학

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

생체공학

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

설치류 태 반의 전 생체 관류

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

면역학 및 감염병학

Improving ex vivo Placental Explant Culture using a Flow-Based Approach(흐름 기반 접근법을 사용한 생체 외 태반 이식 배양 개선)

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

저자 스포트라이트: Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues(태반 조직에서 단일 세포 시퀀싱 및 공간 조직학을 통한 연구 발전) 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

인간 태반 생리학의 통합 연구에 대한 4 혈관 샘플링 접근법

요약

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태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

설치류 태 반의 전 생체 관류

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

Ex Vivo (체외 주행) 태반 이식 유동 배양 - 자궁의 동적 조건 모방

Ex Vivo (체외 주행) 태반 이식 유동 배양 - 자궁의 동적 조건 모방

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