우리는 워크샵과 신경 생리학 연구소의 동물 시설에서 제공하는 지원을 인정합니다. 이 작업은 Walter und Marga Boll- Stiftung, Köln Fortune 및 Deutsche Stiftung für Herzforschung에 의해 지원되었습니다.

동물 취급은 지역 동물 복지위원회의 지침과 유럽 의회의 2010 / 63 / EU 지침에 부합해야합니다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, 글루코오스 10, HEPES 5, 2,3- 부탄 디온 모노 옥심 (BDM) 30. pH를 7.4로 조절하여 Ca 2+ (mM 조성)없이 Tyrode 용액을 준비한다. 4 ℃에서 NaOH로 처리 하였다. </li><li> NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, 글루코스 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0.9를 사용하여 Tyrode 용액을 준비한다. 4 ° C에서 NaOH로 pH를 7.4로 조절한다. </li><li> 4 % 저 용융 아가로 오스 준비 : Ca 2+가 없는 15 mL Tyrode 용액에 0.6 g 저 용융 아가로 오스를 넣으십시오. agarose가 녹을 때까지 10-15 초 동안 750W에서 전자 레인지에서 2 번 혼합물을 가열한다. 용액을 37 ° C의 일정 온도로 유지하십시오.# 176; C를 연속적으로 저어 준다. </li><li> 37 ℃에서 혈청없는 Dulbecco &#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)을 carbogen (5 % CO2, 95 % O2)로 버블 링하십시오. </li></ol> 2. 마이크로톰을 준비하십시오. <ol><li> 마이크로톰을 켜십시오. </li><li> 외부 마이크로톰 챔버를 얼음으로 채 웁니다. </li><li> 내부 마이크로톰 챔버를 Ca 2+가 없는 얼음 차가운 Tyrode 용액으로 채우고 100 % O 2 로 계속해서 용액에 산소를 공급하십시오. </li><li> Microtome의 블레이드 홀더에 스틸 블레이드를 놓습니다. </li></ol> 3. 마우스 심장 격리 <ol><li> 피하에 2,500 U 헤파린 주입. 15 분간 기다리십시오. </li><li> 자궁 경관 탈구로 동물을 희생. </li><li> 흉골 절개로 가슴을 엽니 다. </li><li> 조심스럽게 작은 가위와 집게 # 5를 사용하여 심낭을 절개하십시오. </li><li> 상행 대동맥에 캐뉼라를 삽입하고 관상 동맥을 얼음으로 차가운 Tyrode &#39;s로 관류시킵니다용액을 남은 혈액이 제거 될 때까지 제거한다. </li><li> 부드럽게 포셉과 가위로 심장을 절제하고 차가운 Tyrode의 용액을 Ca 2+ 없이 흘려 보내십시오. </li><li> 메스와 가위로 심방과 심방을 분리하십시오. </li></ol> 4. 4 % 저 융점 아가로 오스에 심실 내장 <ol><li> 정점이있는 심실을 아가로 오스 몰드 ( 그림 1 )에 위쪽으로 향하게하십시오. 좌심실의 금형 중앙에 핀을 놓습니다. </li><li> 심장이 완전히 덮일 때까지 37 ° C에서 4 % 저 용융 아가로 오스로 곰팡이를 채 웁니다. </li><li> 금형을 얼음에 담그면 아가로 오스가 빨리 경화되어 뜨는 것을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 메스와 함께 금형에서 심실이 들어있는 아가로 오스 블록을 제거합니다. </li><li> 블록을 거꾸로 뒤집고 심실을 채우고 아가로 오스 블록의 뒷면에있는 간격을 채우십시오.s는 20G 바늘이 달린 주사기를 사용하여 4 % 저 용융 아가로 오스가있는 털갈이의 핀으로 남겨 두었습니다. </li><li> 메스로 아가로 오스 블록을 자르면 블록의 평평한 바닥과 심장 정점의 직립 위치를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 5. 심실 조직 절개 <ol><li> cyanoacrylate 접착제 한 방울로 microtome의 표본 홀더에 블록을 고정하십시오. 심장 정점을 위로 향하게하십시오. </li><li> 표본 홀더를 칼슘 2가 없는 얼음처럼 차가운 Tyrode로 채워진 마이크로톰의 내부 표본 챔버에 놓습니다. Tyrode의 솔루션으로 아가로 오스 블록을 완전히 덮으십시오. </li><li> 추가 응용 프로그램 (날카로운 전극 녹음 150-200 μm의)에 따라 150-400 μm의 두께로 짧은 축 슬라이스를 준비하고 블레이드의 진동 주파수를 60-70 Hz로 유지하고 가능한 한 천천히 블레이드를 앞으로 이동시킵니다 . </li><li> 작은 브러시를 사용하여 슬라이스에서 남아있는 아가로 오스를 조심스럽게 제거하십시오. </li><li> 부드럽게 전송0.9 % 칼슘 2 + 100 % O 2 와 함께 Tyrode의 솔루션에 파스퇴르 피펫으로 슬라이스 슬라이스 절차에서 회복하기 위해 얼음에 최소한 30 분 동안 그들을 저장합니다. </li><li> 그 후 37 ℃에서 DMEM으로 30 분간 슬라이스를 유지하고 카보 겐이 폭기되어 BDM을 더 잘 사용하기 전에 씻어 낸다. </li></ol> 6. 샤프 전극 준비 준비 <ol><li> 예열의 경우 녹음이 시작되기 30 분 전 모든 전기 장치를 켜십시오. </li><li> 거꾸로 현미경에 배치 가열 플레이트에 3cm 세포 배양 접시를 넣어. </li><li> 접시에 맞춤형 링 전극 ( 그림 2 )을 놓고 전치 증폭기와 자극 전극의 접지선을 연결하십시오. </li><li> 관류 시스템의 유연한 튜브를 접시에 연결하십시오. </li><li> carbogen으로 폭기 DMEM와 재관류 시스템의 저수지를 입력하십시오. </li><li> 관류 펌프를 켜고 관류를 설정하십시오2 ~ 3 mL / min. </li><li> 유량 히터와 가열 플레이트를 조절하여 37 접시에 DMEM의 온도를 조정합니다. </li></ol> 7. 활동 잠재 녹음 <ol><li> DMEM 가득 접시에 심실 슬라이스를 놓습니다. </li><li> 거꾸로 된 현미경으로 조직의 구조적 무결성과 생존력 (수축 기능에 기반)을 확인하십시오. </li><li> 기록 용 유리 전극을 3M KCL로 채 웁니다. </li><li> DMEM으로 자극 전극을 채 웁니다. </li><li> 녹음 전극과 자극 전극을 전극 홀더에 놓습니다. </li><li> 슬라이스에 자극 전극을 조심스럽게 넣고 전기 자극기를 켭니다. 1-2 Hz의 자극 주파수로 시작하십시오. </li><li> micromanipulator와 함께 기록 전극을 의도 된 기록 위치로 이동시킵니다. </li><li> 팁이 조직에 닿을 때까지 녹음 전극을 천천히 내립니다. </li><li> 짧은 직사각형 전기 펄스를기록 전극은 세포막을 관통한다. </li><li> 안정된 신호가 확보 될 때까지 기록 전극의 위치를 ​​조심스럽게 바꾸십시오. </li><li> 활동 잠재력의 기록을 시작하십시오. </li></ol>

<ol>
	<li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro.">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+tissue+slices+as+a+tool+to+predict+metabolism+of+novel+drugs.">Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiopulmonary+toxicity+of+peat+wildfire+particulate+matter+and+the+predictive+utility+of+precision+cut+lung+slices.">Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices.</a> Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).</li><li>Nembo, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+chronotropic+effects+of+Erythrina+senegalensis+DC+(Fabaceae)+aqueous+extract+on+mouse+heart+slice+and+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+slices+from+adult+mammalian+hearts+as+a+model+for+pharmacological+drug+testing.">Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).</li><li>Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recordings+on+rat+cardiac+muscle+slices.">Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices.</a> Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).</li><li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation.">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).</li><li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+heart+slices.+A+robust+model+to+study+ventricular+isometric+contractions.">Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions.</a> Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts--a+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies.">Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+maturation+and+integration+of+murine+fetal+cardiomyocytes+after+transplantation.">Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation.</a> Circ. Res. 101, 484-492 (2007).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+electrophysiological+maturation+and+integration+of+transplanted+cardiomyocytes.">Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+persistence+and+electrical+integration+of+transplanted+fetal+cardiomyocytes+from+different+developmental+stages.">Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages.</a> Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li><li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2,3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes.">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+2,3-butanedione+monoxime+(BDM)+on+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes.">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li><li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development.">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li><li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage:+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li></ol>

저자는 선언 할 것이 없다.

심실 슬라이스는 조직 구조와 같은 생체 내에서 보존되고 심장의 모든 부위에 측정 기술을 직접 액세스 할 수있는 전기 생리 학적, 약리학 적 및 기계적 연구를 가능하게합니다. 생리 작용 잠재 성질은 배아, 신생아 및 성인 조각 9 , 10 , 11 에서 입증되었습니다. 슬라이싱 절차에 의해 직접적으로 손상된 표면층을 제외한 슬라이스의 활력은 활력 염색으로 확인되었습니다 9 . 날카로운 유리 전극을 사용하는 조각 내에서의 활동 전위 기록은 여기에 설명 된 이식 된 심근 세포의 통합 및 성숙을 조사하거나 심장 활성 화합물을 첨가 한 후 약리학 연구에 사용할 수 있습니다. 개별 셀에서 1 시간 이상 지속되는 장기간 녹음이 가능합니다. 이 녹음 시간은 테스트하기에 충분합니다.순차적 재관류 및 세척에 의한 하나의 세포에 대한 상이한 약리학 적 화합물의 영향. 중요한 준비 단계 슬라이스의 품질을 최적화하려면 허혈성 조직 손상을 피해야합니다. 따라서 Tyrode의 해결책으로 심장의 원위치 관류, 빠른 심장 절제술 및 얼음 냉증 산소가 공급 된 Tyrode 용액에서의 즉각적인 보존이 중요합니다. 2,3-butanedione monoxime을 사용하여 박동하는 심장을 고정화하면 허혈에 대한 감수성이 더욱 감소 할 수 있으며 저 용융 아가로 오스에 고체를 묻히는 데 필요합니다. 저 용융 아가로 오스에 끼워 넣는 것은 확산을 제한하여 조직 공급을 방해하지만 슬라이스하기 전에 부드러운 심장 조직을 안정화시키는 데 필수적입니다. 시편 블록 내의 작은 구멍, 예를 들어 아가로 오스 또는 잔류 기포가 완전히 채워지지 않은 심실이 조직 안정화를 방해 할 수 있습니다. 불안정한 심근 조직은 충분한 resis를 제공하지 못함심한 조직 손상과 손상을 유발하는 진동 날에 맞 춥니 다. 명확한 컷을 보장하고 조직 손상을 최소화하려면 블레이드를 날카롭게해야합니다 ( 예 : 3 회 이상 재사용하지 않음). 표본 블록을 통과하는 블레이드의 전방 이동은 가능한 한 느려야합니다. 둔한 블레이드 또는 과속이 내장 된 심실이 있거나 조직을 열등하게합니다. 신뢰할 수 있고 재현성있는 결과를 보장하기 위해 슬라이스의 품질은 현미경으로 확인할 수있는 조직의 구조적 무결성 및 최대 10 Hz의 생리 학적 타격 주파수에서 전기 자극에 대한 반응을 포함한 특정 기준을 충족해야합니다. 추가 적용에 따라 슬라이스를 150-400 μm의 두께로 절단 할 수 있습니다. 얇은 조각은 조직 코어의 저산소 상태를 예방하고 형광 현미경으로 이식 된 세포를보다 쉽게 ​​검출 할 수있을뿐만 아니라기록 전극 ( 15)의 경우,보다 두꺼운 슬라이스가 조직 구조의보다 양호한 무결성 및 조직의보다 높은 안정성을 제공 할 수 있으며, 이것은 힘 측정 ( 10) 및 기록 후 추가의 조직 학적 처리에 유리할 것이다. 이온 채널 및 Ca 2+ 처리 단백질 16 , 17 에 대한 높은 BDM 농도의 잠재적 영향을 방지하기 위해 BDM 유리 DMEM에서 슬라이스를 30 분 이상 배양하여 BDM washout을 사용하기 전에 추가로 사용하는 것이 좋습니다. 놀랍게도, BDM 세척 후 조직의 수축 및 후속 운동은 날카로운 전극 기록을 방해하지 않습니다. 제한 사항 일반적인 세포 배양 모델과는 달리 슬라이스는 보존 된 전기적 및 기계적 세포와 세포 연결, 세포 외 기질과 심근의 분포를 포함한 손상되지 않은 조직 구조를 제공합니다Tes 및 비 - myocytes 6 . 그러나 인공 조직에 의해 공급되고 준비 과정에서 손상 될 수 있으므로 심장 조직 슬라이스는 생체 내 상황과 정확하게 일치하지 않습니다. Trypan blue 염색 및 활성 카스파 제 -3 및 PARP p85 단편의 면역 조직학 평가 결과, 표층에있는 것들을 제외하고 배아 슬라이스 내의 세포는 9 개의 슬라이스 후 생존 가능함이 밝혀졌다. 전도 시스템은 심실 슬라이스에 보존되지 않으며, 여기 확산은 플랫 슬라이스에서 3 차원이 아닌 2 차원입니다. 배아 심장에서 조각은 문화에 최대 2 주 동안 자발적인 박동을 보여줍니다 9 . 성인 조각의 자연 수축이 발생할 수도 있으며, 전도 시스템의 세포에 의해 유도되는지 또는 세포 손상 및 Ca 2+를 나타내는 지 여부는 불분명하다18 세 . 향후 응용 프로그램 날카로운 전극과 미세 전극 배열을 이용한 전기 생리 학적 연구 이외에도, 약리학 적 실험을 통해 약물의 활동 잠재력과 자극 확산에 미치는 영향을 분석 할 수 있으며, 발달 연구 19 또는 위에 제시된 이식 된 심근 세포 15 의 특성, 신생아의 심실 조각 성인 조각에도 적용 할 수있는 힘 수축 측정에 하트가 사용되었습니다. (I) 세포 간 커플 링을 연구하기 위해 gap junction permeable dyes를 주사하거나 내피 세포를 연구하는 등 (II) 주입 된 줄기 세포 유래 cardiomyocytes의 구조적 통합을 평가하는 것과 같은 재배 된 슬라이스의 장기 현미경 연구 코로나의 혈관 기능조각 내에서 선박. 결론적으로, 심실 슬라이스는 일반적인 세포 배양 모델의 한계를 극복하는 데 도움이되는 생체 내 구조 와 같은 보존 된 가치있는 다세포 조직 모델이며 다양한 약리학 적, 생리 학적 발달 및 세포 치료 연구에 적용 할 수 있습니다.

얇은 조직 조각은 Yaman과 Mcllwain이 1966 년에 뇌 조각의 전기적 활동이 시험 관내에서 유지 된다는 것을 보여주기 때문에 기초 과학에서 자주 사용되었습니다 1 . 그 이후로 뇌 2 , 간 3 , 폐 4 및 심근 조직 5 , 6 , 7의 조각에 대해 전기 생리 학적 및 약리학 적 연구가 수행되었습니다. 신생아 쥐의 심실 조각에서 첫 번째 패치 - 클램프 녹음은 1990 년 8 월 에 기술되었지만,이 기술은 오랫동안 망각에 빠졌다. 10 년이 지난 후에, 우리 그룹은 쥐 배아 9 , 신생아 10 및 성인 11 심장 조각을 준비하는 새로운 방법을 확립했습니다. 이러한 생존 가능한 조직 절편은 급성 실험 (성인 슬라이스몇 시간 동안 배양 할 수 있음) 또는 단기 배양 실험 (배아 및 신생아 슬라이스를 며칠 동안 재배 할 수 있음). 전기 생리학적인 특성과 날카로운 전극 활동 전위 및 미세 전극 배열 녹음 11 에 의해 평가 된 동질적인 자극 확산과 같은 생체 내 슬라이스가 표시 됩니다 . &quot;2 차원&quot;형태로 인해 심전도의 모든 영역에 녹음 전극을 직접 액세스 할 수 있기 때문에 전기 생리 학적 연구를위한 흥미로운 도구가되며 Langendorff- 관류 심장 전체에 비해 새로운 실험 옵션이 제공됩니다. 베라파밀 (L-type Ca 2+ -channel blocker), 리도카인 (Na + 채널 차단제), 4- 아미노 피리딘 (비 선택적 전압 의존성 K + 채널 차단제) 및 리노피딘 (KCNQ K)과 같은 이온 채널 차단제에 대한 상기 약물의 약물 반응은, + 채널 차단기) 9 , 11 </sup&gt;는 해리 된 심근 세포에 대한 공지 된 효과에 상응 하였다. 등척성 힘 측정은 양의 힘 주파수 관계를 나타내었고 손상되지 않은 수축 기능을 강력하게 제안 하였다. 이러한 결과는 쥐 뇌실 절편이 생리 및 약리 연구를위한 시험 관내 조직 모델로서 적합 함을 입증했다. 또한, 심전도 기록과 결합 된 수축 심실의 심실 슬라이스는 전기 및 기계적 통합뿐만 아니라 이식 된 태아 12 , 13 , 14 및 줄기 세포에서 파생 된 15 개의 심근 세포의 성숙을 특성화하는 데 매우 유용한 도구임이 입증되었습니다. 요약하면, 심실 슬라이스는 귀중하고 잘 확립 된 다세포 조직 모델이며 해리 된 심근 세포와 Langendorff- 관류 된 심장을 보완하는 것으로 간주되어야합니다심장 혈관 연구에서 심장 내 모든 부위에 예리한 전극 기록과 같은 측정 기술의 직접 액세스뿐만 아니라 생체 내 조직 구조 (해리 된 세포와 대조적으로)를 제공한다는 큰 이점이 있습니다 (전체 심장 조제와는 대조적으로).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>Microtome with vibrating blade.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blades</td><td>Campden Instruments, Loughborough, England</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Fine brush, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; size 6 (4/32&quot;)</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Preparation table</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>Molt for embedding ventricles in agarose</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4`` Needles</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2`` Needles</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small scissor</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen gas (medical grade O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbogen gas (95 % O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-melt Agarose</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplifier</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low magnification Micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>High magnification, three-axis micromanipulator</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic perfusion pump</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2-channel temperature controller</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Square pulse stimulator</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

murine short axis ventricular heart slices for electrophysiological studies

Murine 심근 세포는 심장 생리학 및 새로운 치료 전략에 대한 시험 관내 연구에 광범위하게 사용되었습니다. 그러나, 해리 된 심근 세포의 다세포 제제는 심장의 기계적 및 전기 생리 학적 성질에 영향을 미치는 심근 세포, 비 - 근세포 및 세포 외 기질의 생체 내 구조의 복합체 를 대표하지 못한다. 여기서 우리 는 생체 내 조직 구조와 같은 보존 된 생쥐 심근의 실용적 심실 슬라이스를 준비하고 전기 생리 학적 기록에 대한 적합성을 입증하는 기술을 설명합니다. 심장 절제 후 심실을 심방에서 분리하고 2,3-butanedione monoxime이 포함 된 Ca 2+가 없는 용액으로 관류하고 4 % 저 용융 아가로 오스 블록에 묻힌다. 블록을 진동 날이있는 마이크로톰 위에 놓고 150-400 μm 두께의 조직 절편을 준비하여 진동을 유지합니다. fre블레이드를 가능한 한 천천히 앞으로 움직이게합니다. 조각의 두께는 추가 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 슬라이스는 0.9 mM Ca 2+ 및 2,3- 부탄 다이옥신 모노 옥심 (BDM)을 함유 한 차가운 타이로드 용액에 30 분 동안 저장한다. 그 후, 슬라이스를 37 ℃의 DMEM으로 옮겨 30 분간 BDM을 세척한다. 조각은 수축 기능을 분석하거나 이식 된 줄기 세포 유래 심근 세포와 숙주 조직의 상호 작용을 조사하기 위해 힘 측정을 위해 날카로운 전극 또는 미세 전극 배열을 이용한 전기 생리 학적 연구에 사용할 수 있습니다. 날카로운 전극 녹음을 위해, 슬라이스는 거꾸로 현미경의 가열 판에 3cm 세포 배양 접시에 배치됩니다. 슬라이스는 단 극성 전극으로 자극되고 슬라이스 내의 심근 세포의 세포 내 활동 전위는 날카로운 유리 전극으로 기록됩니다.

심근 경색은 심근 세포의 사실상 비가 역적 손실을 초래합니다. 줄기 세포 유래의 심근 세포를 외인성 심장 재생에 사용하는 세포 대체 요법이 유망한 치료법이다. 이식 된 세포의 전기적 통합과 성숙은 세포 대체 요법의 안전성과 효율성을 위해 매우 중요합니다. 통합 및 성숙을 평가하기 위해 우리는 성숙한 생쥐의 건강한 심장에 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 발현하는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCM, 0.5 x 106 iPSCM / 10 μL 2 회 주사)에서 유래 한 심근 세포를 이식했다. (Peinkofer et al. 방법에 대한 자세한 설명은 15 )을 참조하십시오. 이식 6 일 후에, 수혜자 심장의 심실 조각을 기술 된 프로토콜을 사용하여 준비 하였다. 대표적인 녹음은그림 3. 이식 된 iPSCM이 포함 된 슬라이스를 37 ° C에서 DMEM에 넣고 숙주 조직에 위치한 단극 전극 ( 그림 3A , 왼쪽)으로 국소 적으로 자극했습니다. 세포 내 활동 전위는 eGFP 양성 이식 된 iPSCM 및 슬라이스 내의 인접한 숙주 조직에서 3M KCl로 채워진 날카로운 유리 미세 전극으로 기록 하였다 ( 도 3A , 우측). 수용자의 심장에 이식 된 iPSCM의 지속성 및 전기적 통합을 입증 할 수 있습니다. iPSCM은 이식 된 심근 세포에서 세포 내로 기록 된 자극성 인공물과 활동 전위의 시간 상호 의존성이 존재한다면 전기적으로 통합 된 것으로 간주되었다 ( 그림 3B ). 전기적 통합의 품질은 전기적 활성화의 지연, 즉 자극과 시작 사이의 지연에 의해 정량화 될 수있다운동 전위 상승, 전도 차단이없는 최대 자극 주파수, 즉 모든 자극 후 1 : 1 세대의 활동 전위를 유도하는 최대 자극 빈도. 이 대표적인 실험에서 이식 된 iPSCM은 약 5Hz의 전도 블록이없는 최대 자극 주파수 ( 그림 3B , 오른쪽)에 표시된 바와 같이 전기적으로 통합되었지만 커플 링의 품질은 호스트 조직 내에서보다 길게 자극 인공물과 활동 전위 상향 조절 사이의 지연 (숙주 조직 : 8 ms, iPSCM : 20 ms). 숙주 심근 세포의 활동 전위는 84 mV 진폭, -74 mV 최대 확장기 잠재력, 50 % 재분극시 11 ms 지속 시간, 90 % 재분극시 108 ms 지속 시간 및 114 V / s 상승 스트로크를 보였다. 자극 주파수를 1에서 5 Hz로 증가 시키면 활동 전위가 감소합니다.90 % 재분극시 이온 (86 ms). 이식 된 iPSCM은 활동 전위 특성에 상당한 차이를 보였다. 숙주 세포와 비교하여 진폭은 더 작았으며 (53mV), 최대 이완기 잠재력은 마이너스 (-54mV), 50 % 재 극성 증가 기간 (14ms), 90 % 재분극 기간이 더 짧음 (90ms) 및 상향 행정 속도 느린 (57 V / s). 자극 주파수가 1에서 5 Hz로 증가하면 90 % 재분극 (67 ms)에서 활동 전위 지속 시간이 감소합니다. 결론적으로, 이식 6 일 후의 대표적인 예에서, 분석 된 iPSCM은 미성숙 한 심근 세포의 전형적인 특징을 나타냈다. 이 일화 적 발견은 통계적으로 충분한 수의 세포 및 조제 물에서의 측정과 일치하며, 이는 15 세 이전에보고 된 것이다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig1.jpg" /> 그림 1 : </&gt; 아가로 오스에 심지를 삽입하기위한 맞춤형 금형. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig2.jpg" /> 그림 2 : 샤프 전극 레코딩을위한 맞춤형 링 전극 (접지). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig3.jpg" /> 그림 3 : 이식 된 iPSCM의 전기적 통합 . ( A ) eGFP 양성 iPSCM을 포함하는 심실 심장 절편 (왼쪽) (오른쪽). SE :자극 전극. 빨간색 점은 녹음 위치를 표시합니다. ( B ) 건강한 숙주 조직 (상부 궤적) 및 이식 된 iPSCM (하부 궤적)에서의 활동 잠재력 기록. 슬라이스는 약 2Hz (좌측 트레이스) 및 5Hz (우측 트레이스)에서 숙주 조직에 위치한 자극 전극으로 국소 적으로 자극되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다.

전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

murine-short-axis-ventricular-heart-slices-for-electrophysiological

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.3K 조회수.  University of Cologne.  여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다. 

비디오: Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

연구

신경과학

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

생체공학

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

생리적 조건하에서 돼지 하트 를 자르고 배양

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

의학

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried out in large animals. Considering the complex anatomy of the heart, interspecies differences, and the types of compensatory and pathological reactions, consistent protocols are challenging to implement. The utilization of multiple dissection protocols is usually adapted to suit the prosector's experience, and personal preference continues to be a source of experimental and interobserver variability. Here, the aim is to present the main anatomical features and landmarks, dissection protocols, and histological sampling standards of the heart in some commonly used species (including dogs, pigs, ruminants, and cats) as models of cardiovascular diseases.
Two standard gross examination protocols are presented here. First, the inflow-outflow method, which follows the physiological blood flow direction through the heart and large vessels (frequently used in dogs, ruminants, and pigs), and second, the four-chamber dissection technique (exemplified in cats). Both techniques can be adapted to any species in certain experimental circumstances. The sampling protocols include all the areas of interest (sinoatrial node, ventricles, interventricular septum, atria, valves, and aorta), and if properly carried out, improve both the reproducibility and reliability of experimental studies.

Due to the complex anatomy, a consistently reproducible dissection and harvesting protocol for cardiac samples can be challenging to implement. This manuscript presents the key elements of some standard cardiac dissection protocols, highlighting both the gross examination approaches and the sampling sites commonly used for histopathologic examination.

심혈관 질환에 대한 대형 동물 모델에서 심장의 해부 기술 및 조직 학적 샘플링

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, an ex vivo way to cultivate myocardial slices obtained from human heart samples was demonstrated, while approaching in vivo condition of myocardial contraction. These samples originate mostly from heart transplantations or left-ventricular assist device placements. Using a vibratome and a specially developed cultivation system, 300 &#181;m thick slices are placed between a fixed and a spring wire, allowing for stable and reproducible cultivation for several weeks. During cultivation, the slices are continuously stimulated according to individual settings. Contractions can be displayed and recorded in real-time, and pharmacological agents can be readily applied. User-defined stimulation protocols can be scheduled and performed to assess vital contraction parameters like post-pause-potentiation, stimulation threshold, force-frequency relation, and refractory period. Furthermore, the system enables a variable pre- and afterload setting for a more physiological cultivation.
Here, we present a step-by-step guide on how to generate a successful long-term cultivation of human left ventricular myocardial slices, using a commercial biomimetic cultivation solution.

We present a protocol for ex vivo cultivation of human ventricular myocardial tissue. It allows for detailed analysis of contraction force and kinetics, as well as the application of pre- and afterload to mimic the in vivo physiological environment more closely.

장기 재배를 위한 인간 심근 조직의 제조

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

생물학

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Generation of Porcine Ventricular Slices: A Vibratome-based Technique to Prepare Ultra-thin Slices of Pig Heart Tissue

Source: Ou, Q. et. al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60913">Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based procedure to generate viable, ultra-thin sections of pig heart. The prepared tissue slices can be cultured and used as model systems for pharmacological testing.

돼지 심실 절편의 생성: 돼지 심장 조직의 초박형 절편을 준비하기 위한 비브라톰 기반 기술

Source: Ou, Q. et. al., Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates a vibratome-based ...