이 작업은 ICELA Academia-2010 (ICREA Academia-2010)의 Catalina de Recerca / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 및 PIE14 / 00034) ), FC에 대한 Wenenschap en Technologie (SBO-140028)의 이그 제 큐 티브 (AGENTCHAP VOR Innovatie) 기술 연구소 (SBM-140028) 또한 X, M, VF-D. 및 FC는 &quot;Neuropharmacology and Pain&quot; . 이 작품은 CAPES (브라질)에서 FC까지 &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot;

모든 동물 실험 절차는 Laboratory Animals 11 의 관리 및 사용 안내서에 설명되어있는 유럽 공동체 (European Community ) 에 따라 동물 실험 및 동물 관리위원회 (CEEA)에서 승인 한 바 있습니다.이 지침은 86 / 609 / CCE, FELASA 및 ARRIVE 지침. 따라서 마우스는 음식과 물을 자유롭게 접할 수있는 표준 케이지에 보관하고 표준 표준 조건 (오전 7시 30 분, 온도 22 ° C, 습도 66 %에서 시작하여 12 시간 어둡거나 밝은 주기로 유지)하에 보관합니다. 1. 불연속 Sucrose Gradient를 사용하여 마우스 뇌 시냅 토좀을 얻는 방법 참고 :이 방법은 이전에보고되었습니다 10 . <ol><li> 신선한 격리 완충액 (IB), pH 7.4를 준비하십시오. 2 M 수 크로스; 1 M 수 크로스 /0.1 mM CaCl2; 및 0.1 mM CaCl2 ( 표 1 참조). 얼음 위에서 용액을 차게하십시오. </li><li> 사자궁 경부 탈구로 5 마리 생쥐를 구부린다. 각 동물의 뇌를 잘리고 빠르게 제거하십시오. 관심의 뇌 영역 (즉, 해마, 0.25-0.35 g의 신선한 조직)을 해독하고 1 ML의 IB와 함께 얼음에 5 ML 포터 - Elvehjem 유리 튜브에 넣으십시오. </li><li> 샘플 온난을 막기 위해 얼음 조에서 우선적으로 균질화 교반기 (분당 700-900 회전 10 스트로크)를 사용하여 조직을 균질화합니다. </li><li> 4 2 ML 자당과 0.1 MM CaCl 2 2.5 ML의 6 ML을 포함하는 15 ML 튜브에 균질 조직 (1 ML)를 놓습니다 ° C. 튜브를 뒤집어서 천천히 혼합하십시오. 주 : 칼슘의 첨가는 세포 소기관 간의 접착 상호 작용을 유지하고 다른 &quot;밀도&quot;의 구조를 보존하는 데 필수적입니다. </li><li> 12 ML 원심 분리기 튜브에 솔루션을 놓고 천천히 sucrose 그라디언트를 형성하는 각 튜브의 상단에 1 M 자당 / 0.1 MM CaCl 2 2.5 ML을 추가합니다. 참고 : 위치에 레이블을 붙이십시오.영구 마커를 사용하여 원심 분리 관의 기울기 인터페이스. </li><li> 원심 분리기 튜브를 해당 철강 지지대와 닫힌 뚜껑과 함께 IB 용액으로 칭량 및 평형을 취합니다. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 100,000 x g 및 4 ° C에서 3 시간 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 모든 강철 지지대로 로터를 완전히 채 웁니다 (필요한 경우 비어 있음). </li><li> myelin이 포함 된 상단 레이어를 삭제합니다. 파스퇴르 피펫으로 synaptosome 분수에 해당하는 1.25-M과 1-M sucrose interphase 사이의 흰 고리를 수집하십시오. </li><li> 원심 분리 관에서 IB를 사용하여 9 배로 시냅 토좀을 희석하십시오. </li><li> 원심 분리기 튜브를 해당 철강 지지대와 닫힌 뚜껑과 함께 IB 용액으로 칭량하고 평형을 유지하십시오. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 15,000 x g 및 4 ° C에서 30 분간 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 상등액을 버리고 resuspend th펠릿에 1.1 mL의 IB 용액을 첨가 하였다. 이 시냅 토좀 용액 100 μL를 모으고 11,000 x g 및 4 º C에서 5 분간 원심 분리하십시오. </li><li> synaptosomal 펠렛을 5 % sodium dodecyl sulfate (SDS)에 재현 탁하고이 샘플을 -20 ° C에 보관하십시오. 참고 :이 샘플은 추가 Western-blot 분석을위한 총 synaptosome 분율에 해당합니다. 남아있는 시냅 토좀 분획 (~ 1 mL)은 사용 전까지 -20 ℃에서 동결되거나 후속 시냅스 분획을 위해 처리 될 수 있습니다. synaptosomes 또는 정제 된 시냅스는 총 해마 부피의 1 ~ 2 %를 나타낸다. </li></ol> 2. 전 -, 사후 - 및 외 연접 - 격리 <ol><li> 신선한 용해 버퍼 (pH 6.0) 2x를 준비하십시오. 1x 가용화 완충액, pH 6.0; 가용화 완충액, pH 8.0; 및 0.1 mM CaCl2 ( 표 1 참조). 얼음 위에서 용액을 차게하십시오. 참고 :이 용액의 pH는 반드시 정확해야합니다좋은 subsines 분별을 달성하기 위해 조정. </li><li> 천천히 1 ML 재 합성 synaptosomal 분수 (단계 1.12 참조) 0.1 MM CaCl 2 5 ML로 천 희석하십시오. </li><li> ice-cold 2x 가용화 완충액 (pH 6.0)과 동일한 부피 (5 mL)를 넣고 빙상의 비이커에서 높은 교반하에 얼음 위에서 50 분 동안 배양한다. 참고 : pH 6.0의 Triton X-100의 1 %가 모든 세포막 단백질을 용해 시키지만 시냅스 접촉 또는 접합부 ( 예 : 전 및 시냅스 후 구조)에서 단백질을 보존합니다 4 . </li><li> 원심 분리 관에 넣으십시오. 0.1 mM CaCl2와 2 배 가용화 완충 용액 (pH 6.0)을 동등한 부피의 스틸 지지체와 닫힌 뚜껑과 함께 무게를 달고 평형을 이룬다. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 40,000 x g 및 4 ° C에서 30 분간 튜브를 원심 분리하십시오. 생성 된 상등액은 세포 외 분획을 나타내며,펠릿은 시냅스 접합부 ( 즉, 시냅스 후 분획)에 상응한다. </li><li> 4,000 x 4 및 4 ºC에서 원심 분리 된 15 mL 10K 필터 튜브를 사용하여 비회원 분획이 들어있는 상등액을 최종 200 μL 부피로 농축합니다. </li><li> -20 ℃에서 미리 냉각 (-20 ℃) ​​한 아세톤 5 방울 (1 mL)을 사용하여 결과로 농축 된 엑시 신 시냅스 분획 (200 μL)을 침전시킨다. </li><li> 다음 날, 18,000 x g 과 -15 ° C에서 30 분간 외 발성 분열물을 원심 분리한다. 원심 분리 후, 아세톤 상등액을 버리고 펠렛을 건조시켜 아세톤 흔적을 제거한다. </li><li> 마지막으로 5 % SDS의 200 μL와 extrasynaptic 단백질을 포함하는 펠렛을 resuspend. 필요한 경우 펠릿을 초음파 처리하십시오. </li><li> 그것을 방해하지 않고 조심스럽게 사전 및 postsynaptic 분수를 포함하는 펠렛을 1x 용해 버퍼, 산도 6.0 2 ML로 씻으십시오. 버퍼를 폐기하십시오. </li><li> Resuspend유리 파스퇴르 (Pasteur) 피펫을 사용하여 1x 가용화 완충액 (pH 8.0) 10 mL로 펠렛 화 하였다. 참고 : pH 8.0의 Triton X-100의 1 %가 시냅스 전문화를 용해하지만 불용성 시냅스 후 밀도 4를 유지 합니다. </li><li> 얼음에 비커에서 높은 교반하에 얼음에 50 분 동안 현탁액을 품어. </li><li> 원심 분리 관에 넣으십시오. 해당 튜브 지지대와 닫힌 뚜껑 안에 1x 가용화 완충 용액 (pH 8.0)으로 튜브의 무게를 달고 평형을 이룬다. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 40,000 x g 및 4 ° C에서 30 분간 튜브를 원심 분리하십시오. 결과 상층 액은 시냅스 전 분획에 상응하고 펠렛은 시냅스 후 분획에 상응한다. </li><li> 단계 2.6-2.9에서 설명한대로 presynaptic 분수를 포함하는 뜨는을 처리합니다. </li><li> 5 % SDS의 200 μL와 postsynaptic 분수를 포함하는 펠렛을 Resuspend. 펠렛을 초음파 처리하세요.f가 필요합니다. </li></ol> 3. 멤브레인 분별을 검증하기 위해 immunoblot으로 시료를 분석하십시오 <ol><li> bicinchoninic 산성 단백질 분석을 사용하여 각 분획 ( 즉, 총, 여분, 사전 및 시냅스 후 분수)에서 단백질의 양을 결정합니다. </li><li> 각 분획에서 20 μg의 단백질을 취해 SDS- 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 시료 완충액 중 50 μL의 최종 부피로 희석한다. 100 ℃에서 5 분간 끓입니다. </li><li> 환원 조건에서 4 % 농축 젤로 SDS-PAGE 전기 영동 10 %로 단백질을 분리하십시오. 염료가 낮은 젤에 들어갈 때까지 80V의 정전압으로 전기 영동 한 다음 전압을 120V로 증가시킵니다. </li><li> 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기고 IB 블로킹 용액으로 45 분간 실온에서 연속적으로 흔들어 블로킹합니다. </li><li> 표시된 기본 항체 ( 즉, 안티 SNAP - 25,항 -PSD-95, 항 - 시냅토 피신 또는 항 -GPR37)를 연속적으로 흔들어 주면서 IB 차단 용액으로 희석시켰다. </li><li> IB 세척 용액으로 멤브레인을 3 번 세척 (각각 10 분)하여 결합되지 않은 1 차 항체를 제거합니다. </li><li> 표시된 2 차 항체와 함께 상온에서 어두운 조건에서 90 분 동안 지속적으로 흔들어주세요. </li><li> IB 세척 용액으로 멤브레인을 3 번 세척 (각각 10 분)하여 결합되지 않은 2 차 항체를 제거합니다. </li><li> 멤브레인을 화학 발광 기질과 함께 배양하십시오 (어두운 조건에서 혼합액을 준비하고 제조사가 제공 한 용액 A와 B의 1 : 1 비율을 따르십시오). </li><li> 화학 발광 검출 장치에서 막을 분석하십시오. </li></ol>

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. 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A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

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여기에 제시된 프로토콜은 뇌 영역 내의 특정 단백질의 부갑상선 분포 연구에 대한 강력한 생화학 도구를 구성합니다. 그러나 여기서 강조해야 할 기술에 내재 된 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, 주요 제한 사항 중 하나는 모든 subsynaptic 분수의 immunoblot 분석을 수행하기 위해 합리적인 금액의 단백질을 정화하는 데 필요한 조직의 상대적으로 큰 금액입니다. 이 문제는 시냅스 ( 즉, 시냅 토좀)가 총 해마 부피의 1-2 %만을 차지한다는 사실과 관련이 있습니다. 실제로, 분열을 성공적으로 수행하려면 1 ~ 1.5 g의 신선한 조직 ( 즉, 해마)이 필요합니다. 그렇지 않으면 수확량이 너무 낮아서 연구중인 단백질의 정체뿐만 아니라 위치를 평가할 수 없다. 반대로, 과량의 뇌 조직이 사용되면, 분리 절차 w최적이 아닐세. 최적의 반구 분화를 보장하기 위해 용액의 pH를 조심스럽게 조절하는 것도 중요합니다. 결과적으로, 뇌막 분획이 수행 될 때마다, 모든 추가 연구 전에 각 분획의 효율을 검증하는 것이 필수적이다. 중요하게도, 다음 프로토콜은 그것의 차별 구조와 분포 때문에 억제 시냅스의 하위 시냅스 분열에 적합하지 않을 것입니다. 그러나 이러한 모든 단점은 의심의 여지없이 시냅스 연구를위한 보편적 인 방법론이 될이 실험 절차의 엄청난 유용성을 숨기지 않습니다.

시냅스 전달은 시냅스의 물리적 무결성에 달려 있는데, 이것은 포스터 (Foster)와 셔링턴 (Sherrington)에 의해 1897 년에 상상 된 개념이다. 따라서 정상 신경계와 병리학 적 상태 모두에서 중요한 신경 전달 요소 ( 예 : 이온 채널, 수용체 등 )의 분포를 이해하는 것이 시냅스 기능을 해명하는 데 필수적입니다. 전자 현미경 (EM)은 프로토 타입 중추 신경계 (CNS) 시냅스의 현재의 미세 구조 개념에 엄청난 공헌을했습니다. 이러한 방식으로 EM은 사전 및 후기 시냅스 밀도의 차이를 정교하게 정의했으며, 이는 일정한 거리 (~ 25 nm)의 틈으로 구분됩니다. 흥미롭게도, postsynaptic 장치는 소위 postsynaptic 밀도, 또는 PSD 2 라는 자사의 원형 막 아래 상대적으로 지속적인, 전자 밀도 농축을 보여줍니다. 반대로, presynaptic 장치에서, noticeabl불연속 cytomatrix 네트워크는 원형 막 바로 아래에 배치되어 있으며, 이것은 시냅스 소포를 원형 막 멤브레인 활성 영역 3에 정렬 및 도킹하는 데 필수적입니다. 따라서 EM은 구조적으로 보존 된 CNS 시냅스 내에서 단백질 분포를 조사하기위한 황금 실험 접근법을 구성합니다. 그러나 전자 현미경 사진에서 제공하는 정보는 정적입니다. 사실, 축적 된 증거는 생체 내 시냅스가 극도로 역동적이어서 지속적인 시냅스 전달에서 극적인 구조 변화를 경험한다는 것을 보여줍니다. 또한, 시냅스의 형태와 구성은 다양한 CNS 지역에서 발달, 성숙, 노화 및 신경 병리학 적 상태의 발달에 따라 변할 수있다. 전반적으로 생리 조건에서 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 데 초점을 맞춘 프로토콜은 시냅스 기능에 대한보다 포괄적 인 연구를위한 유용한 도구입니다. 등에 의해 처음으로 기술 된이 막 분획 화 방법은, (2001) 4 는 사전 및 사후의 시냅스 장치 내에서 발생하는 접착 상호 작용을 약화시키는 pH 변화에 기초한다. 첫째, pH 6.0에서 약한 세제를 사용하여 사전 및 사후 시냅스 장치를 보유하고 가용화되어 시냅스 접촉에서 추출 할 수있는 비회원 막 영역에서 유지되는 접착 접합을 식별 할 수 있습니다. 결과적으로, 중성 세제의 존재하에 pH를 6.0에서 8.0으로 올리는 것은 접합체 접합부의 강도를 약화시켜 접합 전 활성 영역이 접합 후 밀도에 단단히 결합되도록합니다. 따라서, presynaptic 구획은 너무윤활유는 후자 농도에서 분리 될 수 있는데, 이는 사용 된 세제의 농도가 그 가용화를 촉진시키지 않기 때문에 대부분 보존된다. 흥미롭게도, 분할 효율은 결국 90 % 이상으로, 다른 subsynaptic 마커에 의해 확인할 수 있습니다 : i ) synaptosomal 관련 단백질 25 (SNAP - 25), presynaptic 활성 영역에서; ii ) synaptophysin, extrasynaptic 분수에서 ( 즉, 활성 영역 외부 및 microsomes 포함); 그리고 ⅲ ) postsynaptic density 단백질 95 (PSD-95). 특히,이 뇌막 분화 방법은 성공적으로 사용되었습니다. 따라서, 알파 - 아미노 -3- 하이드 록시 -5- 메틸 -4- 이속 사졸 프로피온산 (AMPA) 수용체 5 , 아데노신 A1 수용체 (A1R) 6 및 아데노신 A1 수용체와 같은 상이한 수용체의 부갑상선의 국소화를 정확하게 결정할 수 있었다. ,아데노신 A 2A 수용체 (A 2A R) 7 , 아데노신 트리 포스페이트 (ATP) P2 수용체 8 , 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 서브 유닛 9 및 파킨슨 병 관련 수용체 GPR37 10 . 그러나, 여러 가지 제한 사항은 특정 연결 단백질의 시냅스 분포의 적절한 평가를 방해 할 수 있습니다. 따라서이 과정에서 우리는 전체 프로토콜을 완전하게 기술 할뿐만 아니라, 필요한 많은 양의 조직, 낮은 단백질 수율 및 단백질의 효율을 검증하기위한 필수 요구 사항과 같은 고려해야 할 중요한 포인트를 강조합니다. 명확한 실험을하기 전에 각 분리.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sucrose</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,211,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">CaCl2</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">2,112,211,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,313,961,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Protease inhibitor cocktail Set III</td>
			<td style="width:249px;">Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">535140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,236,541,209</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">SDS</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Glycerol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,311,651,604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">D0632</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tween 20</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">NaCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,216,591,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,314,941,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:249px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">4873</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,781,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Basic 20 pH</td>
			<td style="width:249px;">Crison, Alella, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:128px;">Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;">344059</td>
			<td style="width:167px;">Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td>
			<td style="width:249px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">UFC901008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Centrifuge 5430R</td>
			<td style="width:249px;">Eppendorf, Hamburgo, Germany</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sonifier 250</td>
			<td style="width:249px;">Branson, Danbury, Connecticut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:249px;">GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td style="width:160px;">612-1702</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Compact Balance EK-610</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:249px;">Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">GR 200 Precision Balance</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-GPR37</td>
			<td style="width:249px;">Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td>
			<td style="width:249px;">Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:30000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

시냅스 단백질의 구성과 기능을 평가하는 것은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 그러나 동적 인 단백질 - 단백질 상호 작용과 인산화 반응에 의해 조절되기 때문에 시냅스에서 발생하는 신경 전달을 평가하는 것은 쉽지 않습니다. 따라서, 어떤 방법이 시냅스 전달을 연구하는데 사용될 때, 주요 목표는 이러한 일시적인 생리 학적 변형을 보존하는 것이다. 여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다. 즉, 프로토콜은 presynaptic, postsynaptic, 그리고 extrasynaptic 구획에서 단백질 농축을 수행하는 생화학 방법론을 설명합니다. 첫째, synaptosomes, 또는 시냅스 터미널, 불연속 자당 그라디언트를 통해 모든 시냅스 구획을 포함하는 뉴런에서 얻은 것입니다. 참고로,이 초기 시냅스 막 준비의 품질은 c의복. 결과적으로, 다른 subsynaptic 구획의 분리는 차별적 인 pH 조건에서 순한 세제를 사용하여 가벼운 solubilization과 달성됩니다. 이것은 그래디언트 및 등 원심 원심 분리에 의한 분리를 허용합니다. 마지막으로, 다른 subsynaptic 구획 ( 즉, 사전, 사후 및 extrasynaptic 막 분수)에서 단백질 농축은 잘 특성화 된 시냅스 단백질 마커 ( 즉, SNAP - 25, PSD - 95, 그리고 synaptophysin을 사용하여 immunoblot 분석의 수단으로 유효성 검사, 각각의 신경 세포 단백질의 시냅스 분포를 직접 평가할 수있다.

설명 된 방법론은 일반적으로 신경 단백질의 subsynaptic 분석과 일반적으로 시냅스 수용체 5 , 6 , 7 , 8 , 9 의 분리 및 생화학 적 특성 결정에 사용되었습니다. 흥미롭게도, 여기에 표시된 대표 결과는 고아 G 단백질 - 결합 수용체 즉, 파킨슨 병 관련 수용체 GPR37 10 의 하위 시냅스 hippocampal 분포 분석을위한이 실험 절차의 유용성을 보여줍니다. GPR37은 엔도 텔린이나 관련 펩티드에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌지만 원래 엔도 텔린과 봄베 신 수용체에 대한 동족체 검색을 통해 확인되었다. 그 자리에서, GPR37은 헤드 활성제 p에 의해 활성화 될 것으로 제안되었다euptide 14 , 15 , 16 그리고 더 최근에 neuropeptides prosaposin과 prosaptide 17 에 의해 보편적으로 받아 들여지고있다. GPR37은 파킨슨 병과의 연계로 인해 가장 많은 주목을 받았습니다. 따라서 정상 및 병리학 조건 하에서이 흥미로운 수용기의 신경 생리학을 아는 데 상당한 관심이 있습니다. 따라서, GPR37의 subsynaptic 지방화를 밝혀 내면 뇌 기능을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이를 위해, 해마는 8 주령에 C57BL / 6J (WT) 및 GPR37-KO 마우스로부터 먼저 분리 하였다. 그런 다음 extra-pre-post-postsynaptic fraction을 membrane fractionation protocol을 사용하여 정제 하였다 (절차의 개략적 개요는 그림 1 참조). 이어서, 이들 시냅스 구획의 순도는각각의 시냅스 마커의 분리 : i ) 시냅스 밖의 소포 마커 (synaptophysin); ii ) presynaptic active zone marker (SNAP-25); 및 iii ) 시냅스 후 밀도 마커 (PSD95). 따라서, extra-pre-post-postsynaptic 분수 내 synaptophysin, SNAP-25 및 PSD95의 농축 물을 이들 단백질에 대한 특이 항체를 사용하는 면역 블롯으로 분석 하였다 ( 그림 2 ). 따라서, 테스트 한 각 시냅스 마커 ( 그림 3 )에 대해 적어도 90 %의 분별 효율이 발견되었는데, 앞에서 설명한 것과 유사합니다 6 . 흥미롭게도 presynaptic (20 ± 4 %) 및 postsynaptic (36 ± 2 %) 분획 ( 그림 3 )과 비교했을 때 GPR37 면역 반응은 extrasynaptic fraction에서 더 풍부했다 (n = 3, P &lt;0.001). 또한, 우리의 데이터는, presynaptic 활성 존에 존재하는 동안, GPR37은 주로postsynaptic 밀도 (N = 3, P &lt;0.05) ( 그림 3 ) calaled. 전반적으로, 뇌막 분화 프로토콜은 마우스 해마에서 GPR37의 subsynaptic 분포의 평가를 허용하므로,이 고아 수용체의 미래 조작에 대한 중요한 정보를 제공합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55661/55661fig1.jpg" /> 그림 1 : 막 분획 프로토콜의 개략적 인 흐름도. 모든 실험 절차는 왼쪽 열에 설명되어 있으며 샘플 수집은 오른쪽 열에 표시되어 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55661/55661fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55661/55661fig2.jpg" /> 그림2 : 마우스 해마에서 GPR37의 Subsynaptic 분포. WT 및 GPR37-KO 생쥐의 해마 시냅스 분획에서 GPR37 면역 반응뿐만 아니라 Synaptophysin, SNAP-25 및 PSD-95를 엑스트라, 프리 및 시냅스 후 특이 적 시냅스 마커로 보여주는 대표 면역 블롯. Hippocampal synaptosome (Syn)은 extrasynicic (Extra) 및 presynaptic (Pre) 활성 구역과 postsynaptic density (post) 분획으로 분류되었다. 토끼 anti-synaptophysin (1 : 3,000), 마우스 anti-SNAP-25 (1 : 3,000), rabbit anti-PSD95 (1 : 3,000) 및 rabbit anti-synaptophysin (1 : 3,000)을 사용하여 면역 블롯 (20μg 단백질 / 레인) -GPR37 (1㎍ / mL) 항체. 일차 결합 항체는 HRP- 접합 된 염소 항 - 토끼 (1/30,000) 또는 토끼 항 - 마우스 (1 : 30,000) 항체를 사용하여 검출 하였다. 이 데이터는 허가를 받아 참조 번호 10 에서 추출됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55661/55661fig2large.jpg" target="_blank">h를 클릭하십시오.</a>이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55661/55661fig3.jpg" /> 그림 3 : hippocampal extra, pre, postsynaptic fraction에서의 GPR37 농축의 상대적 정량. 도 2에 도시 된 바와 같이, 엑시 튜빙 (엑스트라; 황색 컬럼), 시냅스 (프리, 그린 컬럼) 및 시냅스 후 (포스트, 레드 컬럼) 분획에 상응하는 면역 블로킹 된 막상의 면역 반응 밴드의 강도를 농도 측정 스캐닝으로 측정 하였다. 밀도는 비 포화 대역으로부터 정량화 하였다. 가장 농축 된 분획에서 Synaptophysin, SNAP-25, PSD95 및 GPR37의 양을 사용하여 값을 표준화 (상대 밀도 스캐닝의 %, RDS)하고 세 번의 독립적 인 실험 10 의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 별표는 의미있는 데이터를 나타냅니다 : * p &lt;0.05, *** p &lt;0.001 (Bonferroni의 post hoc 검정과 함께 1-way ANOVA). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55661/55661fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K 조회수.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat.  여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다. 

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

네이티브 오토플루임션을 기반으로 sFLIM에 의한 식물 섹션의 형광 프로브와 리그닌 간의 상호 작용 측정

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...