저자는 기능 분석에 대한 지원이 눈 절제 기술, 테일러 Birkholz 완성을 위해 미셸 Deochand 감사의 말씀을, 펠티어 플레이트에 대한 자세한 내용은 안티 아레스 항체 마이클 레빈, 그리고 준지 Morokuma. 이 작품은 WSB에 웨스턴 미시간 대학에서 SFSA 교부금에 의해 지원되었다.

1. 동물 문화와 처리 참고 :이 프로토콜은 Schmidtea의 MEDITERRANEA, 일반적으로 재생 연구에 사용되는 시퀀스 게놈 (16), (17)와 이배체 플라나리아 종을 사용합니다. 그러나, 분석은 Girardia의 tigrina 및 Girardia의 dorotocephala (이 상업적으로 사용할 수있는)와 같은 다른 종과 동등하게 성공적이다. <ol><li> 초순수 (또는 여과 탈) 물에 0.5 g / L의 바다 염으로 만든 &quot;웜 물&quot;웜을 유지한다. 웜 물을 유지하기 위해 멸균 폴리 프로필렌 또는 유리 용기를 사용합니다. 참조 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">보충 파일 1</a> 웜 물 준비에 대한 자세한 내용을. 참고 : 비누와 같은 용기 (또는 기타 소모품) 청소 비누를 사용하지 마십시오 벌레에 독성; 대신 70 % 에탄올로 닦아 자연 건조 할 수 있습니다. &lt;OL&gt; <li> 오염으로부터 보호하기 위해 planaria와 함께 작업하는 동안 장갑을 착용 할 것. 참고 : 웜은 비누, 표백제, 샴푸, 컨디셔너, 핸드 로션을 포함한 환경 독소와 화학 물질에 매우 민감하다. </li></ol></li><li> 뚜껑 프로필렌 식품 용기 하우스 콜로니 ~ 20 ℃ (실온)에서의 공기 교환을 위해 부분적으로 열려. 페트리 접시에 보관하거나 실험 웜 (100mm의 접시 당 20 개 벌레) 또는 비 처리 된 조직 배양 플레이트 (12- 웰 플레이트 웰 당 1 개 웜). 스트레스를 줄일 어둠 속에서 모두 식민지와 실험을 계속합니다. 참고 : 식민지가 웜 물 리터 당 최대 500 ~ 1,000 이상의 웜이 있어야합니다. 공기 흐름이 이러한 요리로 설계되어 있기 때문에 실험을 위해, 완전히 자리에 뚜껑을 둡니다. </li><li> , 전송 피펫에서 퓌레를 삭제 컨테이너에 걸쳐 음식의 방울을 배치하여 퓌레 유기 쇠고기 또는 닭고기 간장과 일주일에 한 번이 아닌 실험 벌레 피드. 에서 음식을 소비하는 웜 2 시간 허용용기를 청소하기 전에 어두운 (단계 1.4 참조). 장기 (개월)에 대한 C °, 매장 단기 (주)에 대한 -20 ° C에서 퓌레 또는 -80 사용하기 전에; (박테리아가 꽃과 벌레에 문제를 야기 할 수 있습니다로) 다시 사용하기 위해 퓌레를 재 냉동하지 않습니다. 참고 : 간 더 호르몬이나 항생제를 포함되어야 바람직 이전에 냉동 수 없습니다. 원심 분리기로 이전 냉동 퓨레 (또는 이전에 공급)은 공기를 제거하고 유동에서 음식을 방지 할 수있다. 식품 용기의 바닥에 침몰한다. 퓌레 1 ㎖는 500-1,000 웜 충분하다. </li><li> 식민지와 실험을 모두 신선한 웜 물을 일주일에 한 번 교환. 콜로니 용기도 표백 종이 타월로 닦여한다 (점액 잔류 물을 제거하기 위해 포획 폐기물) (공급하고 다시 2 일 후 2 시간 후에) 공급 웜 회 주 웜 배고파 또는 일주일 번. 바이오 필름을 유지하기 위해, 컨테이너의 80 % 이상을 닦지 마십시오. </li><li> 용기 (또는 수술 세투 사이에 벌레를 이동P) 반송 피펫을 사용. 용기 표면에 부착 된 무료 웜에, 표면에서 분리 웜 뒤에 /를 통해 물을 분출. 피펫의 바닥 인치 (얇은) ​​부분에서 벌레를 유지하는 동안 그런 다음, 피펫에 벌레를 빨아. <ol><li> 그들을 빨아 전에 웜 소량의 물과 Backload 피펫. </li><li> 피펫으로 터치하여 부드러운 바디 웜을 찢어 방지하기 위해, 오히려 웜 자체보다, 웜 주위에 물을 이동하려고합니다. </li><li> 웜을 전송하거나 물을 교체하지 않는 한 덮여 실험적인 요리를 유지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 준비 <ol><li> 이전 실험에 벌레에게 최소 1 주일 공급 중지합니다. <ol><li> ≥1 주 동안 공급과 길이가 적어도 5-7mm입니다하지 된 웜을 선택합니다. 웜 물이 가득 페트리 접시 2/3로 웜을 전송하고, 접시 아래 통치자를 밀어 웜의 길이를 확인합니다. 승 측정ORMS는 동안 완전히 확장 및 이동. 참고 : 다음 면역 및 현장 하이브리드 분석에 큰 벌레 (8-10mm)를 수행하는 작업을 쉽게 할 때 작은 (5~7mm) 웜이 더 잘 작동하는 동안 - 특히 브레이션 학습. </li><li> 웜, 전체 손상되지 않은, 최근 재생하지 있는지 확인합니다. 참고 : 일반 웜에 비해 재생성 벌레는 머리와 / 또는 꼬리 지역에서 훨씬 가볍고 (또는) 안료를해야합니다. </li><li> 웜에 RNAi의 또는 약물 치료를 수행하는 경우,이 시점에서 그렇게. 벌레는 처리 (RNAi를위한 등)의 일부로서 공급 된 경우, 2.2 단계로 진행하기 전에 7 일 이상 지난 후에 공급 기다린다. </li></ol></li><li> 70 % 에탄올로 작업 공간 및 해부 현미경 기반을 청소하고 완전히 건조 할 수 있습니다. 범위의 좌측에있는 선택 벌레의 접시를 놓습니다. 범위의 오른쪽 16분의 5 인치 인슐린 바늘 1과 # 5 포셉 한 쌍의 31 G 배치ml 주사기, 깨끗한 전송 피펫. <ol><li> 악기가 벤치를 (오염 물질을 소개 할 수있는)에 접촉 유지되어 있는지 확인합니다. 깨끗한 포셉, 바늘과 피펫을 유지하기 위해 (예 : 젓가락 받침대로) 단단한 항목을 사용합니다. 또한, 신선한 브라운 (표백) 종이 타월 위에 자리 악기. 주 :이 오른 손잡이 개인과 관련된 이러한 후속 지침이 기록됩니다. 왼손잡이 개인은 좌 / 우 방향을 반대로한다. </li></ol></li><li> 다음 작업 공간에 보풀이없는 조직 와이프의 상자, 신선한 웜 물 소스, 그리고 (벤치 위에서 보호) 몇 가지 추가 전송 피펫을 배치합니다. 분배의 편의를 위해 플라스틱 세척 병에 넣어 웜 물. 또한, 절제된 동물을 수집하는 범위의 오른쪽에 표지 된 12 웰 플레이트 (또는 100mm 배양 접시)를 배치했다. </li><li> 주문품 펠티어 플레이트를 이용하여 웜을 고정하는 경우, t의 우울증에 펠티에 판 위치그는 해부 현미경의베이스와 펠티어 플레이트의 작업 표면이 충분히 냉각 될 때까지 DC 전원의 출력을 조정합니다 (일반적으로 5 ~ V) .Alternatively, ½ 물을 가득 100mm 배양 접시를 작성하여 냉각 판을 적어도 24 시간 동안 동결. 뚜껑을 폐기하고 해부의베이스에 100mm 접시의 바닥에 배치 한 다음 얼음 (도 1a)의 표면에 직접 거꾸로 60mm 페트리 접시에 뚜껑을 배치했다. <ol><li> 물이 100mm 접시에 냉동 후, 얼음의 &quot;화산&quot;판의 중심에 나타날 수 있습니다. 이 경우, 표면에서 어떤 부정을 제거하기 위해, 얼음 평면을 긁어 면도날을 사용합니다. 참고 : 수술 중 얼음이 녹아 훨씬 더 어려운 절제를 만드는 것입니다. 사전에 여러 얼음 요리를 준비하고, 즉시 60mm 접시의 뚜껑을 떠 시작으로 분석하는 동안 사람을 용해하기위한 냉동 사람을 대체합니다. </li></ol></li><li> 준비합니다수술면. 파라핀 플라스틱 필름의 5cm X 10cm 조각 컷 (4cm 2 경우 페트리 접시 콜드 플레이트를 사용) 및 고정 장치의 중앙에 배치. 보풀이없는 조직을 접어 사각형 약 2cm 2로 닦아 필름 위에 놓습니다. 백색 여과지의 1.5 cm (2)의 일부를 잘라 와이프의 위에 배치. 그림 1B-1E를 참조하십시오. <ol><li> 접힌 상태에서 장갑을 낀 손가락으로 장소에 닦아 가볍게 그것이 접힌 상태를 유지하도록 닦아 저해 할 웜 물을 사용합니다. (가) 평면 닦아 롤 전송 피펫의 측면을 사용합니다. 참고 : 차가운 온도는 움직이는 벌레를 유지하는 데 도움이됩니다. 작업 &quot;건조&quot;도 고정에 도움이됩니다. 티슈는 웜 (치명적이다)이 완전히 건조 될 수없는 수술 중에 습기 웜 유지 여과지를 통해 물을 빨아들이도록 작용 와이프. </li></ol></li></ol> 3. 수술 절제 <ol><li> 에 배치하는 전송 피펫을 사용하여여과지 상 E 웜 등쪽까지. 에 광원을 켜고 빛이 웜에 집중되도록 구즈넥을 지시. 눈 (전체 웜이보기에있을 필요가 없습니다) 명확하게 볼 수 있도록 해부 범위 초점 및 배율을 조정; 5 배 확대는 좋은 출발점이 될 것입니다. 헤드 (현미경의 전방) 연구자 향해 지적되도록 오른쪽으로 각진 30-40 도의 파라핀 필름을 회전시켜 방향을 웜. <ol><li> 초과 웜의 움직임을 방지하기 위해 밝은 빛의 사용을 피하십시오. 플라나리아는 부정 phototaxis를 표시하고 밝은 빛을 회피하려고 시도합니다. </li><li> 이 웜 (인두 볼 개방으로) 위로 향하게 복부 측에 위치하는 경우, 부드럽게 (눈에 보이는) 웜 등쪽을 재배치 나이프의 무딘면을 사용한다. 동물을 재배치 할 때 부드러운 조직을 통해 찢어 가능성을 최소화하기 위해 포셉의 날카로운 팁 동물에 접근하지 마십시오. </li><li&gt; 눈의 초점이 명확하게되도록 현미경의 초점을 조정합니다. 또한 눈과 주변의 머리 조직 모두가보기에 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 이 (엄지와 검지 손가락 사이) 펜 것처럼 오른손에 신선한 바늘 / 주사기를 잡습니다. 펠티어 플레이트 (또는 페트리 접시 냉각 판)에 대한 좌측 엄지 손가락을 꽉 및 주사기의 저부 쉬게되는 지점에서 (도 2a)로 왼쪽 엄지 손가락을 사용한다. 현미경을 통해 봐, 바늘의 베벨을 볼 수 있는지 확인합니다. 참고 : 바늘은 매우 날카로운입니다. 를 취급 할 때주의하십시오. 라텍스 또는 니트릴 장갑을 착용하는 것은 몇 가지 보호 기능을 제공 할 수 있습니다. <ol><li> 절차 전반에 걸쳐 지속적으로 바늘 / 주사기를 유지하는 데 도움과 악수를 피하기 위해 왼쪽 엄지 손가락을 사용합니다. </li><li> 수술 표면 안정된를 유지하기 위해 왼쪽 엄지와 (수술 표면에 검지 손가락으로) 왼쪽 검지 손가락으로 약 40 °의 각도를 확인합니다. </li></ol></li><li> 와(스푼처럼) 위로 향하게 바늘의 베벨 눈 (도 2B)에 직각으로 니들의 위치. 부드럽게 오른쪽에서 왼쪽으로 떠서, 눈의 광학 컵 (백색 착색 영역) 위에있는 조직의 얇은 층을 관통하는 바늘의 끝을 사용한다. 아주 조심스럽게 바닥에 구멍 또는 광학 컵의 경계를 파괴 않도록주의하면서, 광학 컵 내에있는 모든 착색 된 조직을 제거합니다. <ol><li> 웜이 절차를 수행하는 동안 어느 시점에서&gt; 1-2 분 동안 필터 종이 된 경우, 웜을 재수하는 웜의 물 한 방울을 추가합니다. 참고 : 탈수 리핑 부상 웜의 감수성을 증가시킬 것이다. </li></ol></li><li> 반복 검은 색소 조직 (색소 세포)의 모든 때까지 단계 3.3뿐만 아니라, 광학 컵 (광 수용체 세포의 수상 돌기)의 흰색 조직의 모든 등이 제거된다. 주의 깊게 조직 닦아에게로 닦아 바늘의 끝 부분에 붙어 절제 조직을 제거합니다. 이중 눈 abla하는 경우능을 원하는 시점에서 상기 제 눈 브레이션된다. 참고 : 부상을 방지하려면, 바늘은 다음 닦아 멀리 엄지 손가락과 집게 손가락에서 통해 바늘을 끌어 다른 손을 사용하여 엄지 손가락과 집게 손가락 개최 닦아 깨끗한 티슈로 바늘을 잡고 세척 할 수 있습니다. 대안으로, 니들은 웨트 티슈 와이프의 표면에 와이 핑과 청결을 조사 할 수있다. </li><li> 완료되면, 신선한 웜 물을 포함하는 라벨이 접시에 벌레를 이동하는 전송 피펫을 사용합니다. 그룹 데이터를 분석하면, 하나의 100mm 배양 접시에 20 개 벌레까지 놓습니다. 시간이 지남에 따라 같은 개인의 재생을 추적하는 경우, 12 웰 플레이트의 각 웰에 1 개 웜을 배치합니다. 모든 벌레가 전송되면, 요리 / 우물에서 모든 웜 물을 제거하고 더 신선한 웜 물로 대체하여 벌레를 씻어. <ol><li> 필터로부터 웜을 제거하고, 웜 소량의 물로 피펫 backload 웜에 물을 방출. 이 t 올리한다여과지 오프 그는 웜은 즉시 전송 피펫에 흡입된다. </li></ol></li><li> 빛으로부터 보호 ~ 20 ℃ (실온)에서의 실험을 부화 회생 방법을 따른다. 주 : 웜 일정한 온도를 유지하는 온도 조절 배양기에 저장 될 수 있지만, 이것은 반드시 필요한 것은 아니다. 대부분의 실내 온도는 재생하는 웜의 기능에 영향을 미치지 않습니다 +5 ° C를 만 다릅니다. </li><li> 원한다면, 면역 용 웜 (도 3-4 참조) 및 / 또는 계내 혼성화는 유전자 발현 분석하여 고정한다. 다른 정착 방법은 면역 플라나리아 18, 19, 20 및 계내 혼성화 (21, 22), (23 개)의 프로토콜에 존재한다. </li><li> 실험이 체결되어, sacrifiCE는 접시에서 웜 물을 제거하고 70 % 에탄올로 대체하여 웜을 살고 있습니다. 용균 및 칙칙한 우회전 웜 검사 3-5 분 동안 인큐베이션 웜. </li><li> 한 번 희생 일반 폐기물의 처리하지 않은 벌레를 놓습니다. 환경, 특히 외래종에 살아있는 벌레를 도입하지 마십시오. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이것은 눈 박리 방법은 뇌 조직을 제외하고, 안구 조직에 주로 절단을 제한함으로써 (예컨대 펀치 구멍 등) 현재의 방법을 개선한다. 기술자 경험이 있지만 양심적 학부 학생들에게 microsurgeries 경험에서 연습으로,이 기술은, 대부분의 개인에 의해 수행 될 수있다. 이 기법은 이전에 면역하거나 눈 마커 (들) (4, 5), (13) 계내</em...

플라나리아는 성체 줄기 세포 매개 재생 연구를위한 강력한 모델 생물이다. 이 비 기생 담수 편형 동물은 중추 신경계와 뇌의 1을 포함한 모든없는 조직을 재생하는 능력을 가지고있다. (계내 혼성화, 면역 조직 화학, RNA 간섭 (RNAi의) 및 transcriptomics, 이러한 시퀀스 게놈 등)까지 거슬러 과거 10-15 년간 플라나리아 필드 1700 2, 기술적 진보로서 전공이 과거 모델 생물을 업데이트 한 . 특히, 플라나리아는 최근 눈 연구 3에 대한 새로운 모델로 인기를 얻고있다. 플라나리아는 두 조직 유형, 광 수용체 신경 세포와 색소 세포의 전형 눈을 가지고; 이는 눈 줄기 세포 인구의 특성을 활성화하고 동일한 유전자의 많은 척추 동물의 눈 드를 조절 것을 보여 주었다velopment은 플라나리아 4, 5에 보존되어있다. 시신경 컵 등쪽에 위치하고 있으며 광 수용체 뉴런의 흰색, 착색 수상 돌기 및 반 달 검은 색소 세포 구성하고, 눈은 광학 chiasm 통해 뇌에 분포되어있다. 재생 공정 6을 해명하기위한 모델 것에 더하여, 플라나리아 눈 시각기구 (7)의 진화 연구에 적합하고, 행동 반응은 광 (8)과 동작 (9)의 신경 기초 (플라나리아 마이너스 phototaxis 표시). 플라나리아 안구 재생성은 크게 두 가지 상황에서 연구되었다 : 재생 헤드의 일부가 잘린 (4), (10) 아래, 바로 눈 조직의 적출 (11)는 다음과 같이 12 </&gt; SUP. 이 단순하고 간단 그대로 눈의 재생에 대부분의 플라나리아 연구는 잘린 방법을 사용했다. 일부 연구는 단지 눈 (잘린 부분) (15) 뒤에 절단을 수행하고 있지만 현재까지 가장 흔한 플라나리아 눈 절단 방법은, 미세 유리 모세관 튜브 (13), (14)와 펀치 구멍을 통해왔다. 그러나, 이러한 방법의 모든 잠재적 결과의 해석을 복잡하게, (뇌, 내장, 그리고 nephridia 등) 만 눈이 아닌 다른 많은 조직의 손실을 포함한다. 여기에 제시된 눈 박리 프로토콜 눈에 더 구체적인 데이터의 결과 (특히 뇌 제외) 안구 조직에 절제를 제한한다. 또한, 공급 시작 7-14 일이 소요될 참수 웜 달리 눈 절제 웜 performe 될 (RNAi의 음식을 통해 제공되는)의 RNAi 실험을 가능하게 박리 (12)의 24 시간 이내에 사료 것d를 동시에. 눈 절제가 성공적으로 잘린 것보다 수행 할 기술적으로 어렵게하지만, 눈 절제술을 포함하는 현재의 연구는 그 절차에 대한 자세한 지침을 포함하지 않았습니다. 이 비디오 문서의 목적은 지속적으로 기본 뇌 조직을 방해하고 가능한 한 적은 수의 다른 조직을 제거하지 않고 플라나리아 광학 컵을 제거하기 위해 연구자 수 있도록하는 것입니다. 이 방법은 단일 및 이중 눈 제거에 사용 및 조사의 넓은 범위에 적용 할 수 있습니다. 가장 재생 분석처럼 눈 박리 잘 약리 유전 (RNAi의) 스크린뿐만 아니라 행동 연구 모두의 조합에 적합하다. 여기에서는, 웜의 취급 방법을 기술 플라나리아 콜로니를 유지하고, 눈 박리 법 자체.

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean sea salts</td><td>Spectrum Brands&amp;nbsp;</td><td>SS15-10</td><td>&quot;10 Gallon&quot; box&amp;nbsp; (net weight 3 lbs)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4.5 x 8.5 in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman #2 filter paper</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Circles, 125 mm diameter, white</td></tr><tr><td>Easy Touch Insulin syringe (with needle)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&amp;nbsp;U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&amp;nbsp; forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, straight tip , 11 cm</td></tr><tr><td>Transfer pipettes&amp;nbsp;</td><td>Samco Scientific&amp;nbsp;</td><td>225</td><td>Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile</td></tr><tr><td>Parafilm M paraffin film</td><td>Brand&amp;nbsp;</td><td>701606</td><td>&amp;nbsp;4 in x 125 ft roll</td></tr><tr><td>12-well untreated tissue culture plate</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand</td></tr><tr><td>Plastic food containers (for colony)&amp;nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Large rectangle</td><td>2.25 qt (2.12 L), 10&quot; x 6 -3/4 &quot; x 3 -3/16&quot;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Girardia tigrina&lt;/em&gt;)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>Sold as &quot;Brown&quot; Planaria; most often they are &lt;em&gt;G. tigrina&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia tigrina&lt;/em&gt;), but sometimes are &lt;em&gt;G. dorotocephala&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia dorotocephala&lt;/em&gt;); either will work.</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Schmidtea mediterranea&lt;/em&gt;)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>&lt;em&gt;S. mediterranea&lt;/em&gt; are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.</td></tr><tr><td>Brown paper towels&amp;nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8&quot; 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED</td></tr><tr><td>Wash bottle (for worm water), optional</td><td>VWR</td><td>16650-275</td><td>Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL</td></tr><tr><td>Anti-synapsin antibody, optional</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3C11</td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>Anti-arrestin antibody, optional</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&amp;nbsp; polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Custom Peltier plate, optional</td><td>Williams Machine, Foxboro, MA&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:&amp;nbsp; Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;).&amp;nbsp; The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is&amp;nbsp; &quot;anchored&quot; to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a &quot;foot&quot; that fits into the opening of your microscope&#039;s base plate.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DC power source (for Peltier plate), optional</td><td>B &amp;amp; K Precision</td><td>1665</td><td>Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.</td></tr><tr><td>Other common supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blade&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope with gooseneck lighting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chopstick rests, optional</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surgical ablation assay for studying eye regeneration in planarians

성체 줄기 세포 및 재생 메커니즘의 연구에서, 플라나리아 편형 동물은 생체 내 모델 시스템의 주식입니다. 이것은 그들의 풍부한 만능 줄기 세포 인구와 대부분의 동물에 대한 재앙이 될 것입니다 부상 후 모든 세포와 조직 유형을 재생하는 능력에 상당 부분 기인한다. 최근, 플라나리아는 눈 재생의 모델로 인기를 얻고있다. (두 조직 유형으로 구성 : 색소 세포 감광체) 전체에 눈을 재생하는 능력이 재생 시각 ​​시스템을 조절 메커니즘의 절개 허용한다. 눈 박리는 재생 만 크게 눈 조직에 한정된다 가장 중요한있는 눈 특정 경로 및 메커니즘을 조사하는 (예 잘린 또는 펀치 구멍 등의) 다른 기술에 비해 몇 가지 장점이있다. 이 비디오 문서의 목적은 확실하게 뇌를 방해하거나 주변 조직없이 플라나리아 광학 컵을 제거하는 방법을 설명하는 것입니다.웜 확립 콜로니의 유지 보수 처리도 설명된다. 이 기술은 수술 콜드 플레이트에 고정화 플라나리아의 광학 컵을 특종 31 G, 16분의 5 인치 인슐린 바늘을 이용한다. 이 방법은 다양한 애플리케이션을 가능하게 1 ~ 2 주 이내에 재생 눈으로, 단일 및 이중 눈 절제를 포함한다. 특히,이 절제 기술은 쉽게 재생 메커니즘과 진화, 눈 줄기 세포와 그 유지 보수 및 phototaxic 행동 반응과 신경 학적 기초의 더 나은 이해를위한 약물 및 유전자 (RNA 간섭) 화면과 결합 될 수있다.

처음 1 ~ 2 시간 후 수술을 위해, 동물은 그대로 웜 (그러나 그들은 여전히 ​​이동합니다)에 비해 움직임을 감소 발생할 수 있습니다. 원하는 경우, 웜 (RNAi의 공급을 위해, 예를 들어) 수술 24 시간 이내에 먹을 것이다. 시간이 지남에 따라 같은 개인의 눈의 재생을 다음과 같은 경우 모두 수술 전에 (그대로)과 1 시간 후 절제 (고전력 증폭기)에서 각 웜의 사진을해야합니다....

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Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

이 프로토콜은 지속적으로 주변 조직을 방해하지 않고 플라나리아의 눈 (광학 컵)을 절제하는 방법을 보여줍니다. 어느 하나의 인슐린 바늘 및 주사기를 사용 또는 양쪽 눈은 눈의 재생, 영상 재생의 진화, 및 광 - 유도 행동 신경 기초 규제기구에 조사를 용이하게 절제 할 수있다.

수술 절제 분석 플라나리아에 아이 재생을 유학을위한

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K 조회수.  Western Michigan University.  이 프로토콜은 지속적으로 주변 조직을 방해하지 않고 플라나리아의 눈 (광학 컵)을 절제하는 방법을 보여줍니다. 어느 하나의 인슐린 바늘 및 주사기를 사용 또는 양쪽 눈은 눈의 재생, 영상 재생의 진화, 및 광 - 유도 행동 신경 기초 규제기구에 조사를 용이하게 절제 할 수있다. 

비디오: Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

화학 절단 및 Planarian Schmidtea 지중해 에 인 두의 재생

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

연구

발생학

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

천연 물의 생물 조절 특성을 측정하는 플래니언 모틸리티 분석

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

생화학

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

생물학

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는<em자포니카> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

신경과학

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

니트로환원효소/메트로니다졸 매개 절제 및 제브라피쉬 망막 색소 상피의 재생 연구를 위한 MATLAB 플랫폼(RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...