Die Autoren möchten sie Michelle Deochand für die Perfektionierung dieses Auge Ablationstechnik, Taylor Birkholz für die Unterstützung bei dem Funktionstest, Michael Levin für die Anti-Arrestin Antikörper und Junji Morokuma Informationen zu den Peltier-Platten danken. Diese Arbeit wurde durch einen SFSA Zuschuss von der Western Michigan University WSB unterstützt.

1. Tier Kultur und Handhabung Hinweis: Dieses Protokoll verwendet Schmidtea mediterranea, eine diploide Planarien Spezies mit einem sequenzierten Genom 16, 17 , die üblicherweise für die Regeneration Forschung verwendet wird. Jedoch ist der Test ebenso erfolgreich mit anderen Arten, wie Dugesia Tigrina und Girardia dorotocephala (die im Handel erhältlich). <ol><li> Pflegen Würmer in „worm Wasser“ aus 0,5 g / l Meersalz wird in Reinstwasser (oder gefiltertes entionisiertes) Wasser. Verwenden sterile Polypropylen oder Glasbehälter des Wurm , Wasser zu halten. Siehe <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Zusatzdatei 1</a> für Details über Wurm Wasseraufbereitung. HINWEIS: Niemals Seife reinigen Behälter (oder andere Verbrauchsmaterialien), wie Seife ist giftig für Würmer; statt mit 70% Ethanol abwischen und an der Luft trocknen lassen. &lt;ol&gt; <li> Handschuhe tragen, während sie mit planaria arbeiten, um sie vor Verschmutzung zu schützen. HINWEIS: Würmer sind sehr empfindlich gegenüber Umweltgiften und Chemikalien, einschließlich Seife, Bleichmittel, Shampoo, Conditioner, und Handcreme. </li></ol></li><li> Haus Kolonien in Polypropylen Nahrungsmittelbehältern, wobei der Deckel teilweise geöffnet gelassen zum Luftaustausch bei ~ 20 ° C (Raumtemperatur). Store experimentelle Würmer in entweder Petrischalen (20 Würmer pro 100 mm-Schale) oder nicht-behandelten Gewebe-Kulturplatten (1 worm pro Well für 12-Well-Platten). Um Stress abzubauen, halten beide Kolonien und Experimente im Dunkeln. HINWEIS: Die Kolonien sollten nicht mehr als 500-1000 Würmer pro Liter Wurm Wasser. Für Experimente lassen Deckel vollständig an Ort und Stelle, da Luftstrom in diese Gerichte ausgelegt ist. </li><li> Feed-nicht-experimentelle Würmer einmal pro Woche mit püriertem Bio-Rindfleisch oder Hühnerleber mit Püree aus einer Transferpipette fallen, Platzierung Tropfen Nahrung in den Behälter. Lassen Sie Würmer 2 h Lebensmittel in die konsumierendunkel vor dem Behälter (siehe Schritt 1.4) Reinigung aus. Vor der Verwendung speichert Püree bei -20 ° C für kurzfristig (Wochen) oder -80 ° C für langfristige (Monate); nicht Püree zur erneuten Verwendung wieder einfrieren (als Bakterien blühen kann und die Würmer schaden). HINWEIS: Leber keine Hormone oder Antibiotika und vorzugsweise nicht vorher eingefroren enthalten sollte. Centrifuge Püree vor der Anwendung (oder vor der Fütterung) zum Gefrieren Luft zu entfernen und verhindern, dass Lebensmittel aus schweben. Lebensmittel sollten auf den Boden des Behälters sinken. 1 ml Püree ist für 500-1.000 Würmer ausreichend. </li><li> Austauschwasser einmal pro Woche mit frischem Wasser Wurm für beide Kolonien und Experimente. Colony Behälter auch mit einem ungebleichten Papiertuch abgewischt werden (entfernen Schleim Reste, die Trap-Abfälle) einmal pro Woche für Würmer oder zweimal in der Woche für die Zufuhr Würmer (2 h nach der Fütterung und wieder 2 Tage später) am Verhungern. Um den Biofilm zu behalten, nicht wischen mehr als 80% des Behälters. </li><li> Bewegen Würmer zwischen Containern (oder Operation setup) unter Verwendung einer Transferpipette. Um freie Würmer Behälteroberflächen anhaftet, spritzt Wasser über / hinter der Schnecke von der Oberfläche zu lösen. Dann saugen die Schnecke in die Pipette, bei dem Versuch, die Schnecke innerhalb des unteren inch (dünner) Teil der Pipette zu halten. <ol><li> Backload Pipetten mit einer kleinen Menge von Wurm Wasser vor ihnen zu saugen. </li><li> Versuchen Sie, das Wasser um den Wurm zu bewegen, anstatt der Wurm selbst, um zu verhindern, weiche Körper Würmer zu reißen, indem sie mit der Pipette zu berühren. </li><li> Halten Sie bedeckt experimentellen Gerichte, es sei denn Würmer übertragen oder Wasser zu ersetzen. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung <ol><li> Stoppen Sie Würmer mindestens eine Woche vor den Experimenten zugeführt wird . <ol><li> Wählen Sie Würmer, die für ≥1 Woche wurden nicht gefüttert worden und sind mindestens 5-7 mm in der Länge. Übertragen Sie die Würmer in eine Petrischale 2/3 voller Wurm Wasser und bestätigen Schneckenlänge von einem Lineal unterhalb der Schale gleiten. messen Sie worms während voll ausgefahren und bewegend. HINWEIS: Während kleiner (5-7 mm) Würmer besser funktionieren , wenn nachfolgende Immunofluoreszenz durchführt und in situ - Hybridisierungsanalysen, größere Würmer (8-10 mm) sind leichter zu handhaben - vor allem , wenn das Lernen abzutragen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Würmer sind ganze, unversehrt, und in letzter Zeit nicht regenerieren. HINWEIS: Regenerieren Würmer haben viel leichter (oder keine) Pigment im Kopf und / oder Schwanzbereich im Vergleich zu normalen Würmern. </li><li> Wenn RNAi oder pharmakologische Behandlungen von Würmern durchführen, tun Sie dies an dieser Stelle. Wenn Würmer als Teil der Behandlung (wie für RNAi) gefüttert wurden, wartet mindestens 7 Tage nach der letzten Fütterung vor dem Fortfahren zu Schritt 2.2. </li></ol></li><li> Reinigen der Arbeitsfläche und Präpariermikroskop Basis mit 70% igem Ethanol und lassen Sie ihn vollständig trocknen. Die Schale ausgewählter Würmer auf der linken Seite des Bereichs. Rechts von dem Umfang, Ort ein Paar von # 5 Zangen, a 31 G 5/16 Zoll Insulin Nadel mit einem 1ml-Spritze und eine saubere Transferpipette. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Instrumente durch Berühren der Bank gehalten werden (die Verunreinigungen einführen könnte). Verwenden ein starres Element (wie ein Stäbchen Rest), um die Zange zu halten, Nadel, Pipette und sauber. Alternativ Ort Instrumente auf einem frischen braunen (roh) Papiertuch. Hinweis: Diese und nachfolgende Befehle geschrieben werden, wie sie auf rechtshändige Personen betreffen. Linkshändig Personen sollten die rechts / links Richtung umkehren. </li></ol></li><li> Neben dem Arbeitsbereich, legen Sie eine Schachtel mit einem fusselfreien Tuch wischt, eine Quelle von frischem Wurm Wasser, und einige zusätzliche Transferpipetten (von der Tischplatte geschützt). Platz Wurm Wasser in einer Plastikwaschflasche für eine einfache Dosierung. stellen auch eine markierte 12-Well-Platte (oder 100 mm Petrischale) auf der rechten Seite des Umfangs für ablatiert Tiere zu sammeln. </li><li> Bei Verwendung einer maßgefertigte Platte Peltier Würmer zu immobilisieren, positioniert die Peltier - Platte in die Vertiefung in ter Basis des Binokular und stellt den Ausgang auf der Gleichstromquelle, bis die Arbeitsfläche der Peltier-Platte ausreichend kühl ist (typischerweise ~ 5 V) .Alternatively, bildet eine Kühlplatte mit einer 100 mm Petrischale Füllung ½ voll mit Wasser und frieren für mindestens 24 Stunden. Verwerfen Sie den Deckel und legen den Boden der 100-mm-Schale auf der Basis des Binokular, anschießend den Deckel einer 60 mm Petrischale mit der Oberseite nach unten direkt auf der Oberfläche des Eises (1A). <ol><li> Nachdem das Wasser in der 100-mm-Schale gefroren ist, wird ein „Vulkan“ von Eis in der Mitte der Platte erscheinen. Wenn dies der Fall ist, verwenden Sie eine Rasierklinge das Eis flach zu kratzen, Unregelmäßigkeiten von der Oberfläche zu entfernen. HINWEIS: Während der Operationen wird das Eis schmelzen, so dass Ablationen viel schwieriger. Bereiten mehr Eier Geschirr im Voraus, und gefrorene ersetzen für diejenigen während des Tests, sobald der Deckel der 60-mm-Schale beginnt floating schmelzen. </li></ol></li><li> Bereite das ... VorChirurgie Oberfläche. Geschnitten , um ein 5 cm x 10 cm großes Stück aus Kunststoffparaffinfilm (4 cm 2 bei Verwendung der Petrischal kalte Platte) und es auf dem Zentrum der Fixiereinrichtung. Falten Sie ein fusselfreien Tuch abwischen in ein Quadrat etwa 2 cm 2 und legen Sie es auf der Folie. Schneiden Sie ein Stück weißes Filterpapier 1,5-2 cm 2 und legen Sie es auf des Tuchs. Siehe Abbildung 1B-1E. <ol><li> Halten Sie die gefaltete Wischtuch an der Stelle mit einem behandschuhten Finger, und verwendet Wurm Wasser leicht zu dämpfen das Wischtuch, um sicherzustellen, dass es gefaltet bleibt. Verwenden, um die Seite einer Transferpipette zu rollen die flache abzuwischen. HINWEIS: Kälte hilft Würmer zu hindern. Die Arbeit „trocken“ hilft auch bei der Immobilisierung. Das Gewebe wirkt abzuwischen Wasser durch das Filterpapier Docht, die während der Operation worm feucht zu halten, ohne Würmer ermöglichen vollständig zu austrocknen (das letal ist). </li></ol></li></ol> 3. Chirurgische Ablation <ol><li> Verwenden einer Transferpipette Ort aufe worm dorsal auf das Filterpapier. Schalten Sie die Lichtquelle auf und leiten die Schwanenhälse, so dass das Licht auf der Wurm fokussiert ist. Stellen Sie den Binokular Fokus und Vergrößerung, so dass die Augen deutlich sichtbar sind (der gesamte Wurm muss nicht in Sicht sein); 5fache Vergrößerung ist ein guter Ausgangspunkt. Orientieren die Schnecke durch Drehen des Paraffinfilmes so dass der Kopf in Richtung der Forscher gerichtet ist (in Richtung der Vorderseite des Mikroskops), gewinkelt 30-40 Grad nach rechts. <ol><li> Vermeiden Sie den Einsatz von hellem Licht überschüssige Wurm Bewegung zu verhindern. Planarien Anzeige negativ Photo- und versuchen, helle Licht zu entziehen. </li><li> Wenn der Wurm ventrale Seite positioniert ist, nach oben zeigt (mit Schlundöffnung sichtbar), verwendet, um die matte Seite der Pinzette vorsichtig auf die Schnecken Dorsalseite repositionieren (mit Augen sichtbar). Vermeiden Sie das Tier mit der scharfen Spitze der Zange Annäherung an die Möglichkeit des Reißens durch Weichgewebe zu minimieren, wenn das Tier Neupositionierung. </li><li&gt; Das Mikroskop Fokus so einstellen, dass die Augen klar im Fokus. Achten Sie auch darauf, dass sowohl die Augen und die umgebenden Gewebe Kopf in Sicht sind. </li></ol></li><li> Halt eine frische Nadel / Spritze in der rechten Hand , als ob es ein Stift (zwischen Daumen und Zeigefinger) war. Verspannen den linken Daumens gegen die Peltier - Platte (oder eine Petrischale kalte Platte) und mit dem linken Daumen als einen Drehpunkt , auf das der Bodenabschnitt der Spritze aufliegt (Abbildung 2A). Schauen Sie durch das Mikroskop, und stellen Sie sicher , dass die Abschrägung der Nadel sichtbar ist. HINWEIS: Nadeln sind sehr scharf. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit ihnen. Das Tragen von Latex oder Nitril Handschuhe können einen gewissen Schutz bieten. <ol><li> Mit dem linken Daumen, um die Nadel / Spritze stetig während des gesamten Verfahrens zu halten und zu vermeiden Hände schütteln. </li><li> Bildet einen Winkel von etwa 40 ° mit dem linken Daumen und linken Zeigefingern (mit dem Zeigefinger auf der Oberfläche der Operation), um die Operation Oberfläche stabil zu halten. </li></ol></li><li> Mitdie Abschrägung der Nadel nach oben zeigt (wie ein Löffel) positioniert, um die Nadel im rechten Winkel zu dem Auge (2B). Verwenden, um die Spitze der Nadel vorsichtig auf die dünne Gewebeschicht durchdringt von rechts über den Augenbecher (weiß, unpigmentierten Region) des Auges, Ausschöpfen nach links. Sehr sanft jede pigmentierte Gewebe innerhalb des Augenbechers, wobei darauf geachtet befanden entfernen nicht den Boden zu durchstechen oder um die Grenzen der Exkavation zu zerstören. <ol><li> Wenn der Wurm auf dem Filterpapier für&gt; 1-2 min an jedem Punkt während des Verfahrens gewesen ist, einen Tropfen Wurm Wasser, um den Wurm zu rehydrieren. HINWEIS: Dehydration wird der Wurm Anfälligkeit Rippen Verletzungen erhöhen. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.3, bis alle schwarzen pigmentierten Geweben (Pigmentzellen) sowie alle weißen Geweben des Augenbechers (Dendriten der Sehzellen), werden entfernt. Entfernen Sie nach dem Ende der Nadel stecken operativ entfernte Gewebe durch sorgfältig mit einem Tuch abwischen wischen. Wenn Doppel Auge Ablation ist, abzutragen das zweite Auge an dieser Stelle gewünscht. HINWEIS: Um Verletzungen zu vermeiden, Nadeln können durch Greifen die Nadel mit einem sauberen Tuch wischt mit dem Daumen und Zeigefinger, dann mit der anderen Hand gehalten gereinigt werden, um die Nadel durch die wegzuwischen von Daumen und Zeigefinger zu ziehen. Alternativ kann die Nadel auf die Oberfläche eines feuchten Gewebes abzuwischen und untersucht Sauberkeits abgewischt werden. </li><li> Wenn Sie fertig ist , verwenden Sie eine Transferpipette den Wurm auf eine markierte Schale mit frischem Wurm Wasser zu bewegen. Wenn Gruppendaten zu analysieren, in einem einzigen 100 mm Petrischale bis 20 Würmer auf. Wenn die Regeneration in den gleichen Individuen über die Zeit - Tracking, lege 1 Wurm in jede Vertiefung einer 12-Well - Platte. Sobald alle Würmer übertragen werden, Würmer spülen , indem sie alle Würmer Wasser aus den Schalen / Brunnen entfernt und mit frischem Wurm Wasser zu ersetzen. <ol><li> Zum Entfernen von Würmern aus dem Filter, Backload die Pipette mit einer geringen Menge an Wasser worm und läßt das Wasser auf die Schnecke. Dies sollte heben ter Wurm aus dem Filterpapier, um sofort in die Pipette für die Übertragung angesaugt werden. </li></ol></li><li> Inkubieren Experimente bei ~ 20 ° C (Raumtemperatur) vor Licht geschützt und dem Regenerationsprozess folgen. HINWEIS: Würmer können in einem temperaturgesteuerten Inkubator gelagert werden, um eine konstante Temperatur zu halten, aber das ist nicht unbedingt notwendig. Die meisten Raumtemperaturen variieren nur von + 5 ° C, was nicht den Wurm der Fähigkeit beeinflussen zu regenerieren. </li><li> Wenn es gewünscht wird , zu beheben Würmer für die Immunhistochemie (siehe Abbildungen 3-4) und / oder in situ - Hybridisierungsanalysen der Genexpression. Verschiedene Befestigungsverfahren gibt es für Planarien Immunhistochemie 18, 19, 20 und in situ - Hybridisierung 21, 22, 23 - Protokolle. </li><li> Wenn Experimente abgeschlossen werden, sacrifice leben Würmer durch worm Wasser aus der Schale entfernt und mit 70% Ethanol zu ersetzen. Inkubieren Würmer für 3-5 min, für Würmer Kontrolle zu lysieren und drehen gräulich. </li><li> Legen Sie nicht behandelten Würmer in den normalen Abfallstrom einmal geopfert. Vermeiden Sie Live-Würmer in die Umwelt einzuführen, insbesondere nicht-einheimische Arten. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Auge Ablationstechnik verbessert die aktuellen Methoden (wie Lochung) von Hirngewebe mit Ausnahme von und Exzision hauptsächlich auf die Augengewebe zu beschränken. Mit etwas Übung kann diese Technik von den meisten Personen durchgeführt wird, von Technikern in microsurgeries zu unerfahren, aber gewissenhaft Studenten erlebt. Es wird empfohlen , dass diese Technik oft vor der Verwendung von Ablationen in Experimenten durchgeführt werden, einschließlich (wenn möglich) Bestätigung der vollständigen Entfernung aller Augengewebe durch Immunhistochemie oder in - situ - Hybridisierung für die Augen Marker (n) 4, 5, 13. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist das Schöpfen aus Geweben. Es ist wichtig, nicht zu viel oder zu wenig Gewebe zu entfernen. Dies kann durch nicht Schopf zu tief mit der Nadel vermieden werden, um zu verhindern bis zur ventralen Seite des Wurms durchdringt. Die Spitze des neeDLE sollte nur etwa 0,4 mm tief, und der abgeschrägte Teil der Nadel sollte nie den ganzen Weg durch das Auge eingeführt werden, gehen. Besondere Sorgfalt sollte das fragile Gewebe nicht beschädigt werden zwischen den beiden Augen (der mediale Rand der schwarzen pigmentierten Bereich jedes Auge repräsentiert die Grenzen jedes Auge) getroffen werden. Schaden zwischen dem Auge und dem distalen Rand des Wurms auch vermieden werden sollte. Kleinere Würmer sind eher zu reißen oder unabsichtlich verletzt werden, so dass die Verwendung von größeren Würmern (besonders für die Praxis) empfohlen. Die wichtigsten Einschränkungen dieser Technik sind, dass es relativ zeitintensiv ist (und nicht geeignet für Hochdurchsatz-Screenings), und es erfordert eine Investition bei der Durchführung der Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Doch mit der Praxis 10 Augen können in ~ 15 min abgetragen werden. Ein wichtiger Bereich für die Fehlerbehebung ist Planarien noch während des Verfahrens zu halten. Die zwei Hauptgründe Würmer nicht ausreichend immobilisiert Ablationen durchzuführenzu viel ist (a) Wasser und (b) den Verlust der Kälte. (A) Überschüssiges Wasser, das Planarie Pool auf der Oberfläche, während der Operation der Übertragung Würmer Würmer können, um die Operation zu bewegen und komplizieren. Die Operation Oberfläche (fusselfreien Tuch abwischen und Filterpapier) sollte nur feucht bleiben. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt während des Verfahrens wird das Abwischen mit worm Wasser gesättigt ist, es entweder ersetzt oder kann eine Transferpipette verwendet werden soll, um sanft überschüssige Flüssigkeit aus dem Gewebetuch (immer aus dem Wischtuch ziehen und nicht das Filterpapier) zu entfernen. Gewebetücher können auch überschüssigen Wasser-Pooling auf der OP-Oberfläche entfernen verwendet werden. Dieser Prozess muss möglicherweise viele Male wiederholt werden, abhängig von der Anzahl der Würmer abgetragen wird. (B) Wenn die Petrischale unter Verwendung von kalten Platte aufgebaut, erinnern die kalte Platte zu ersetzen, sobald das Eis zu schmelzen beginnt, und die 60-mm-Petrischalendeckel beginnt zu schweben. Dadurch wird sichergestellt, sowohl eine stabile Operation Oberfläche und eine entsprechend kalte Oberfläche. wenn mit der Peltier-Platte Alternativeingerichtet, sich bewusst sein, dass die Wärme in den äußeren Ringen nach 45 min bis 1 h der Verwendung wird die Kühlplatte in der Mitte überwinden und alle Kühl verloren. Wenn dies der Fall ist, schalten Sie die Peltier-Platte für 5-10 min ab, damit sie vor der Wiederaufnahme Ablationen auf Raumtemperatur kommen. Ein weiterer Bereich der Fehlersuche ist während des Wurms Übertragung zwischen dem Gericht und der Operation Oberfläche und wieder zurück. Wenn abgetragene Würmer schwer aus dem Filterpapier zu entfernen, bis die Flüssigkeit Pools auf das Filterpapier mit einem Tropfen Wurm Wasser auf dem Wurm platzieren. Worms kann dann in die Transferpipette wie üblich angesaugt werden. Wenn das Problem weiterhin besteht, versuchen Sie den Wurm auf seine Bauchseite Spiegeln ersten (die matte Seite der Zange verwenden). Wenn ein Wurm in der Transferpipette stecken bleibt, ist dies in der Regel ein Zeichen dafür, dass zu viel Wasser aufgenommen worden (Würmer sollten in die Transferpipette nicht weiter als etwa einen Zoll gezogen werden). eine Schnecke in einer Transferpipette stecken zu entfernen, aufzustellen 1-2 ml worm Water in die Pipette, so dass die Schnecke mit Wasser bedeckt ist. Flick fest auf der Seite der Pipette, bis die Schnecke von der Wand der Pipette löst und schwebend wird. Wenn die Nadel stumpf wird, mit einer neuen Nadel / Spritze ersetzen. Betrachten Sie die Nadel ersetzen, nachdem es mit ≥30 Augen abzutragen. Übermäßige Entfernung von resezierten Geweben durch Abwischen mit einem Tuch abwischen kann auch stumpft die Nadel, so dass Ablationen erschwert. Es ist in Ordnung, wenn reseziert Gewebe innerhalb des abgeschrägten Teils der Nadel während des gesamten Verfahrens (auch über mehrere Tiere) bleiben. Verwenden Sie immer eine frische Nadel / Spritze , wenn zwischen Würmern unterschiedlichen Bedingungen (zB Wildtyp vs. RNAi Würmer), sowie bei Beginn neue Ablation Sitzungen (dh an verschiedenen Tagen) zu verändern. Dieses chirurgische Auge Ablationstechnik ist ein mächtiges Mittel, lichtinduzierte Verhalten (und ihre genetische und neurologische Basis) in Planarien zu untersuchen, insbesonderewenn sie mit pharmakologischen Behandlungen oder RNA-Interferenz kombiniert. Eye - Ablation ist auch ein großes Mittel , mit denen die Mechanismen aufzuklären , die endogenen Planarienregeneration Auge (Auge und Stammzell Wartung und Differenzierung) in vivo reguliert. Da die meisten Wirbeltiere haben sehr begrenzte Fähigkeiten Augengewebe zu regenerieren, zu verstehen, wie Planarien der Lage sind, ihre Augen regenerieren wird bei der Identifizierung von möglichen Mechanismen für die Übersetzung in zukünftige Therapien von Bedeutung sein.

Planarien sind ein leistungsfähiger Modellorganismus für die adulte Stammzellvermittelte Regeneration zu studieren. Diese nichtparasitären Süßwasser Plattwürmer besitzen die Fähigkeit , jegliche und alle fehlenden Gewebe zu regenerieren, einschließlich ihrer zentralen Nervensystems und des Gehirns 1. Studium so weit zurück wie die 1700er Jahre 2, technologischen Fortschritte in den Planarien Feld in den letzten 10-15 Jahren (wie ein sequenzierten Genom, in - situ - Hybridisierung, Immunhistochemie, RNA - Interferenz (RNAi) und Transkriptomik) hat diesen historischen Modellorganismus aktualisiert . Insbesondere haben Planarien vor kurzer Popularität durchaus als ein Modell für die Augenforschung 3 gewonnen. Planarien haben prototypischen Augen mit nur zwei Gewebetypen, die Photorezeptorneuronen und Pigmentzellen; dies hat die Charakterisierung seiner Augenstammzellpopulation und demonstriert ermöglicht, dass viele der gleichen Gene Wirbeltierauge de Regulierungwicklung ist in Planarien konservierte 4, 5. Die Augenbecher befinden sich dorsal und der weißen, nicht pigmentierten Dendriten der Photorezeptorneuronen und den Halbmond schwarzen Pigmentzellen enthalten, und die Augen, das Gehirn über eine Chiasma innervate. Zusätzlich ist ein Modell zur Erläuterung regenerative Prozesse 6 ist, wobei die Planarien Auge zu studieren , die Entwicklung der visuellen Mechanismen gut geeignet ist , 7, Verhaltensreaktionen auf Licht (Planarien anzuzeigen negativen Phototaxis) 8 und die neurologische Grundlage des Verhaltens 9. Augenregeneration in Planarien wurde in zwei Kontexten weitgehend untersucht: als Teil des Regenerationskopfes Dekapitation folgenden 4, 10, und im Anschluss an der Exzision von nur die Augengeweben 11, 12 </sup&gt;. Die meisten Planarien Studien zur Augen Regeneration haben die Enthauptung Methode verwendet, da es einfach und unkompliziert ist. Die gebräuchlichste Methode Planarien Auge Exzision hat bisher mit einem feinen Glaskapillare 13 über Locher gewesen, 14, obwohl einige Studien auch Amputationen durchgeführt sind gerade hinter den Augen (teilweise Enthauptung) 15. Jedoch beinhalten alle diese Methoden, um den Verlust von vielen anderen Geweben als nur das Auge (wie Gehirn, Darm und Nephridien), möglicherweise die Ergebnisse kompliziert Interpretation. Das Protokoll Auge Ablation präsentierte hier beschränkt Exzision auf die Augengewebe (insbesondere ohne Gehirn), in Daten entstehen, die spezifischen für das Auge sind. Außerdem, im Gegensatz zu geköpft Würmer , die 7-14 Tage , um Fütterung zu beginnen, Augen abgetragenen Würmer füttern innerhalb von 24 h von Ablation 12, so dass RNAi - Experimente (wo RNAi über die Nahrung zugeführt wird) werden performed gleichzeitig. Obwohl technisch schwieriges Auge Ablation erfolgreich als Enthauptung durchzuführen, Exzision aktuelle Studien mit Auge haben keine detaillierten Anweisungen auf ihren Verfahren enthalten. Das Ziel dieses Video-Artikel ist Forscher zu ermöglichen, konsequent die Planarien Exkavation zu entfernen, ohne die zugrunde liegenden Hirngewebe zu stören und so einige anderen Gewebe wie möglich zu entfernen. Dieses Verfahren kann sowohl für die Einzel- und Doppel Auge Ablation verwendet werden und ist für eine Vielzahl von Untersuchungen. Wie die meisten Regenerations Assays wird Augen Ablation gut geeignet für die Kombination mit sowohl pharmakologischen und genetischen (RNAi) Bildschirme sowie Verhaltensstudien. Hier beschreiben wir Methoden für die Behandlung von Würmern, eine Planarien Kolonie Aufrechterhaltung und das Auge Ablationstechnik selbst.

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean sea salts</td><td>Spectrum Brands&amp;nbsp;</td><td>SS15-10</td><td>&quot;10 Gallon&quot; box&amp;nbsp; (net weight 3 lbs)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4.5 x 8.5 in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman #2 filter paper</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Circles, 125 mm diameter, white</td></tr><tr><td>Easy Touch Insulin syringe (with needle)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&amp;nbsp;U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&amp;nbsp; forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, straight tip , 11 cm</td></tr><tr><td>Transfer pipettes&amp;nbsp;</td><td>Samco Scientific&amp;nbsp;</td><td>225</td><td>Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile</td></tr><tr><td>Parafilm M paraffin film</td><td>Brand&amp;nbsp;</td><td>701606</td><td>&amp;nbsp;4 in x 125 ft roll</td></tr><tr><td>12-well untreated tissue culture plate</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand</td></tr><tr><td>Plastic food containers (for colony)&amp;nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Large rectangle</td><td>2.25 qt (2.12 L), 10&quot; x 6 -3/4 &quot; x 3 -3/16&quot;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Girardia tigrina&lt;/em&gt;)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>Sold as &quot;Brown&quot; Planaria; most often they are &lt;em&gt;G. tigrina&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia tigrina&lt;/em&gt;), but sometimes are &lt;em&gt;G. dorotocephala&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia dorotocephala&lt;/em&gt;); either will work.</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Schmidtea mediterranea&lt;/em&gt;)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>&lt;em&gt;S. mediterranea&lt;/em&gt; are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.</td></tr><tr><td>Brown paper towels&amp;nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8&quot; 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED</td></tr><tr><td>Wash bottle (for worm water), optional</td><td>VWR</td><td>16650-275</td><td>Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL</td></tr><tr><td>Anti-synapsin antibody, optional</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3C11</td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>Anti-arrestin antibody, optional</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&amp;nbsp; polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Custom Peltier plate, optional</td><td>Williams Machine, Foxboro, MA&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:&amp;nbsp; Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;).&amp;nbsp; The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is&amp;nbsp; &quot;anchored&quot; to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a &quot;foot&quot; that fits into the opening of your microscope&#039;s base plate.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DC power source (for Peltier plate), optional</td><td>B &amp;amp; K Precision</td><td>1665</td><td>Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.</td></tr><tr><td>Other common supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blade&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope with gooseneck lighting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chopstick rests, optional</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surgical ablation assay for studying eye regeneration in planarians

In der Studie von adulten Stammzellen und Regenerationsmechanismen sind Planarienplattwürmer eine Heftklammer in vivo Modellsystem. Dies ist zum großen Teil auf ihre reichlich vorhandenen pluripotenten Stammzellpopulation und die Fähigkeit, alle Zell- und Gewebetypen nach Verletzungen zu regenerieren, die für die meisten Tiere katastrophal sein würde. Vor kurzem haben Planarien an Popularität gewinnen als Modell für die Augenregeneration. Ihre Fähigkeit, das gesamte Auge (bestehend aus zwei Gewebetypen: Pigmentzellen und Photorezeptoren) zu regenerieren ermöglicht die Präparation der Regulierungsmechanismen Sehsystem Regeneration. Eye Ablation hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Techniken (wie Enthauptung oder Loch) für die Prüfung Augenspezifische Wege und Mechanismen, die wichtigsten davon ist, dass die Regeneration weitgehend Augengewebe allein beschränkt ist. Der Zweck dieses Video-Artikel ist zu zeigen, wie zuverlässig die Planarien Exkavation zu entfernen, ohne das Gehirn oder die umgebenden Gewebe zu stören.Der Umgang mit Würmern und Wartung einer etablierten Kolonie wird ebenfalls beschrieben. Diese Technik verwendet eine 31-G, 5/16-Zoll-Nadel Insulin chirurgisch die Exkavation von Planarien auf einer kalten Platte immobilisierte aushöhlen. Dieses Verfahren umfasst sowohl Einzel- und Doppel Auge Ablation, mit den Augen in 1-2 Wochen zu regenerieren, so dass für eine breite Palette von Anwendungen. Insbesondere kann diese Ablationstechnik leicht mit pharmakologischen und genetischen (RNA-Interferenz) Bildschirmen für ein besseres Verständnis von Regenerationsmechanismen und deren Entwicklung, Augen Stammzellen und deren Wartung und phototaxic Verhaltensreaktionen und deren neurologischen Basis kombiniert werden.

Für die ersten 1-2 Stunden nach der Operation erhalten die Tiere Bewegung aufweisen können im Vergleich zu intakten Würmer verringert (aber sie werden immer noch bewegen). Falls gewünscht, werden essen Würmer innerhalb von 24 h nach der Operation (beispielsweise für RNAi Fütterung). Wenn folgendes Auge Regeneration in den gleichen Individuen im Laufe der Zeit, stellen Sie sicher, dass ein Foto von jedem Wurm sowohl vor der Operation (intakt) und bei 1 h nach der Ablation (hpa) zu nehmen. Durch die 4 Tage nach der Ablation (dpa) Regenerieren Pigmentzellen sollte sichtbar sein, und von 14 dpa das gesamte Auge vollständig regeneriert worden (3A-B). Dazu gehört auch die Photorezeptorneuronen und ihre Innervation an das Gehirn (3C), sowie die funktionelle Erholung des visuellen Systems (4A-C). Erfolgreiche Ablationen werden die darunter liegenden Gewebe des Gehirns (4D-E) nicht stören, noch andere Verletzungen einführen , um das Tier (5A). erfolglos Ablationenumfassen Tiere mit: eine übermäßig große Exzision, die die beiden Augen (5B) verbunden ist , reißen an den Seitenrand des Tieres (5C) und / oder Wundstellen , die durch die ventralen Poke Epidermis (5D). Weiterhin zählen zu erfolglos Ablationen unvollständiger Entfernung des gesamten Augenbechers, beide der weißen unpigmentierten Gewebe bestand und die schwarzen Pigmentzellen (5E-F). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55594/55594fig1.jpg" /> Abbildung 1: OP - Vorbereitung. (A) Schematische Darstellung der Kaltplattenkonstruktion, mit der Boden einer 100 mm Petrischale (mit Eis gefüllt ist ) und den Deckel einer 60 mm Petrischale (platziert Oberseite nach unten auf der Eisoberfläche). (B) Schematische Darstellung der Operation Oberfläche, hergestellt aus einem Stapel ( von oben nach unten) weißen Filterpapier, ein feuchtes Abwischen gefaltete Gewebe, und ein Stück Paraffinfilm.(C) Die Operation eingerichtet (für den rechtshändigen). A: Binokular, B: Gooseneck Beleuchtung, C: Chirurgie Oberfläche, D: Peltier-Platte, E: Schal von 5-7 mm Würmern bereit für die Ablation, F: Waschflasche von worm Wasser, G: chopstick Rest saubere Übertragung Pipette, H: chopstick Rest Halt Nadel / Spritze, I: chopstick Rest Zange, J holding: Behälter mit zusätzlichen Transferpipetten. (D) Individuelle Peltier Plattenkonfiguration. (E) Petrischale kalte Platte - Konfiguration. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55594/55594fig2.jpg" /> Abbildung 2: Position der Hände und die Nadel / Spritze während der Ablation. (A) Platzierung der Hände (für Rechtshänder). Beachten Sie, dass der linke Daumen verwendet wird, um die Spritze zu unterstützen (gehaltenenin der rechten Hand) Bewegung zu minimieren. (B) Anordnen der Nadel in Bezug auf das Auge des Wurms. Man beachte, dass die abgeschrägte Oberfläche der Nadel nach oben zeigt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55594/55594fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die abgetragenen Planarien Augen regenerieren. Morphologie von Schmidtea mediterranea Planarien nachwachsende Augen folgenden (A) Doppelaugen Ablation und (B) monokularen Ablation. (C) Immunhistochemie zeigt Regeneration der Photorezeptorneuronen (anti-Arrestin) folgende Einzel Auge Ablation. Intakte Würmer werden vor der Operation gezeigt, und regeneriert werden an den Tagen 4 und 14 nach der Ablation gezeigt. Für einzelnes Auge Ablationen war das linke Auge einerblated und das rechte Auge dient als interne (heil) Kontrolle. Rote Pfeile: abgetragene Augen. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55594/55594fig4.jpg" /> Abbildung 4: Funktionelle Erholung des visuellen Systems nach der Ablation. (A - C) Funktioneller Assay Planarienphotophobie zu testen. (A) Intact Würmer vermeiden durch Bereiche von Licht reisen, wie beispielsweise eine Stelle von einem grünen Laserpointer. (B) bei 24 h nach der Ablation „blind“ double Auge ablatiert Würmer reisen durch Lichtflecken. (C) bei 7 Tage nach der Ablation abgetragenen Doppelaugen Würmer haben ihre Sehsystem regenerierten ausreichend Licht Vermeidung zu erholen. Gelbe Pfeilspitze: abweichendes Verhaltenal Antwort. (D - E) Augen Ablation zu den Geweben des Augenbechers beschränkt und stört nicht die zugrundeliegenden Hirngewebe. (D) Immunhistochemie zeigt Hirn Architektur (anti-Synapsin) aus der Zeit vor der Ablation zu 1 h nach der Ablation unverändert ist. (E) Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung bei 1 h nach der Ablation in einem Querschnitt zeigt , Beschädigungen weitgehend auf der Seite des abgetragenen Exkavation beschränkt. Die rechte Auge (mit schwarzen Pigmentzellen) dient als interne Kontrolle. Rote Pfeile: abgetragene Augen. Maßstabsbalken = 1 mm (AC) 1 mm, 100 &amp; mgr; m (DE). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55594/55594fig5.jpg" /> Abbildung 5: Kennzeichnend für erfolgreiche und erfolglose Ablationen. </strong&gt; (A) Erfolgreiche Einzel- und Doppel Auge Ablationen (bei 5 min nach der Ablation) haben Wunden, die in etwa die gleiche Größe wie das Original Exkavation sind. (B - E) Erfolglos Ablationen: (B) zu viel Gewebe entfernt wird oder die Wunde verbindet die beiden Augen, (C) die Wundstelle reißt und erstreckt sich bis zum Rand, (D) die Wunde zu tief ist , und stößt von der Durch dorsale (D) an den ventralen (D‘) Seite und (E - F) nicht alle der Exkavation Gewebe entfernt werden, sichtbar gemacht sowohl morphologisch als (E) und durch anti-Arrestin - Färbung der Photorezeptorneuronen (F). Gelbe Pfeile: anomale Ablationen. Gelbe Kreise: Ablation Ort. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55594/55594fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a></a>

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Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Dieses Protokoll zeigt, wie konsequent Planarien Augen (Augenbecher) ohne störende umgebende Gewebe auszuschneiden. Verwendung eine Insulin-Nadel und Spritze, entweder einen oder beiden Augen ablatiert werden können Untersuchungen über die Mechanismen der Regeneration regulierenden Auge, um die Entwicklung der visuellen Regeneration und die neuronalen Grundlage des lichtinduzierten Verhaltens zu erleichtern.

Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K Aufrufe.  Western Michigan University.  Dieses Protokoll zeigt, wie konsequent Planarien Augen (Augenbecher) ohne störende umgebende Gewebe auszuschneiden. Verwendung eine Insulin-Nadel und Spritze, entweder einen oder beiden Augen ablatiert werden können Untersuchungen über die Mechanismen der Regeneration regulierenden Auge, um die Entwicklung der visuellen Regeneration und die neuronalen Grundlage des lichtinduzierten Verhaltens zu erleichtern. 

Serie: Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

Ein planarischer Motilitätstest zur Messung der biomodulierenden Eigenschaften natürlicher Produkte

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Biochemie

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Biologie

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Neurowissenschaften

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...