This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia &amp; Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

이 프로토콜은 인간의 연구 윤리에 대한 UCSF의 지침을 준수합니다. T 세포 배양, CD4 + T 세포의 분리와 Th17 분극 1. 제조 <ol><li> 0 일에, CD3에게 항 - 인간 (2 ㎍ / ㎖) 및 항 - 인간 CD28의 웰 당 1.5 ㎖의 코트 6 웰 조직 배양 플레이트 (4 ㎍ / ㎖), 적어도 2 시간 동안 칼슘 및 마그네슘에 함께 PBS에서 37 ° C. <ol><li> 대안 적으로, 코트 밤새 39 ° C에서 플레이트. 파라 필름에서 접시를 감싸. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 밀도 구배 원심 분리하여 제대혈 단핵 세포 (CBMCs)를 준비합니다. 주의 :주의 깊게 작업 및 혈액 매개 병원균에 노출의 위험을 피하기 위해 인간의 피를 처리 할 때 착용 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 확인합니다. </li><li> 단핵 세포를 분리하여 세척 한 후, 음극 실리 의해 인간 CD4 + T 세포의 분리를 수행ction 특 상업용 인간 CD4 + T 세포를 이용하여 키트. 참고 : 단핵 세포 분리 후 적혈구 오염이있는 경우, 옵션 적혈구 세포 용해가 CD4 + T 세포의 분리 단계 이전에 수행 될 수있다. 차단 완충액 (PBS 2 % FBS)의 1 mL의 단핵 세포를 재현 탁. 1 배 용균 솔루션의 5 ML을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. 그런 다음 세포 펠렛 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 차단 완충액 원심 5 mL를 추가한다. <ol><li> 새로운 5 ㎖ 튜브에 차단 완충액 500 μL 당 50 × 106의 밀도에서 단핵 세포를 재현 탁. </li><li> FBS 100 μL 후 잘 섞어 오비탈 진탕 기에서 20 분 동안 4 ℃에서 각각 배양 튜브를 튜브 당 항체 믹스 100 μL를 추가한다. </li><li> 배양 후, 세포를 세척 버퍼 분리 3-4 mL를 첨가. 세포 펠렛을 39 ° C에서 8 분간 300 XG에 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 공중으로 대기음rnatant. </li><li> 이 회전하는 동안, 자기 구슬을 미리 씻는다. (1에서 사용했을 때 세포로 1) 새로운 튜브에 자성 비드의 원하는 양을 옮기고 비드를 세척 완충액 분리 동량을 추가한다. 1 mL의 마이크로 피펫을 사용하여 잘 혼합 한 다음, 적어도 1 분 동안 자석에 튜브를 놓는다. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 초기 세척 전에 전송 된 동일한 부피의 자성 비드를 재현 탁. </li><li> 분리 완충액 500 μL 각 튜브에 세포를 재현 탁 및 사전 세정 자성 비드 500 μL를 추가한다. </li><li> 잘 섞어 상온 (25 ° C 내지 18 ° C)에서 오비탈 진탕 기에서 15 분 동안 자성 비드와 세포를 인큐베이션. </li><li> 인큐베이션 후, 충분히 1 mL의 마이크로 피펫을 적어도 10 배를 사용하여 세포를 피펫. 이어서 분리 버퍼 3-4 mL를 첨가하고 2 분 동안 상기 자석의 각각의 튜브를 배치했다. </li><li> 조심스럽게에있는 부정적인 선택 CD4 + T 세포를 전송새로운 튜브에 뜨는. </li></ol></li><li> CD4 + T 세포의 분리가 완료되면, 혈구와 세포를 계산하고 얼음에 세포를 유지한다. </li><li> PBS와 항체 코팅 된 플레이트를 두 번 씻으십시오. 이어서 각 웰에 Th17 - 편광 미디어 1.5ml의 배의 혼합물을 추가 항 - 인간 IFNγ (20 ㎍ / ㎖), 항 인간 IL-4 (20 ㎍ / ㎖) 인간 TGFβ (10 NG / ㎖) 인간 IL-1β (40 ng의 / ㎖) 인간 IL-23 (40 ng의 / ㎖) 인간 IL-6 (50 NG / ㎖) 총 2 mM의 L- 글루타민이 보충 된 무 혈청베이스 미디어 (희석 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 100 μM 2- 머 캅토 에탄올). 참고 : 형질 및 RNA 간섭 혈청 함유 미디어에서 작업을 수행합니다. 이 프로토콜과 혈청이없는 미디어를 사용하는 목적은 더 나은 IL-17의 생산을 달성하는 것입니다. </li><li> 원심 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 인간 CD4 + T 세포는 세포 펠렛. 조심스럽게 supernat를 대기음개미. 그런 다음, 최종 부피가 웰 당 3 ㎖이고 편광 사이토킨은 1X 최종 농도 이제 잘되도록 1.5 mL의 3 × 106의 밀도로 세포를 무 혈청베이스 미디어 세포를 재현 탁하고 접시. <ol><li> 5 % CO 2에서, 이틀 동안 37 ° C의 배양기 판을 놓는다. </li></ol></li></ol> 2. 일렉트로 체외 편광 인간 Th17 세포 <ol><li> 제 2 일, CD3에게 항 - 인간 (2 ㎍ / ㎖) 및 항 - 인간 CD28의 웰 당 250 μL로 코팅 48- 웰 조직 배양 플레이트 (4 ㎍ / ㎖), 적어도 2 시간 동안 칼슘 및 마그네슘에 함께 PBS에서 37 ° C. <ol><li> 대안 적으로, 코트 밤새 39 ° C에서 플레이트. 파라 필름에서 접시를 감싸. </li></ol></li><li> 형질 전환을위한 작은 RNA를 준비. 각 형질 1.5 ML의 마이크로 원심 튜브에 siRNA를 5 μM 스톡 용액의 분취 액 1 μL. 적절한 화학 - 일치하는 작은 RNA의 제어 방식을 포함OL. 얼음의 모든 튜브를 유지합니다. </li><li> PBS와 항체 코팅 된 플레이트를 두 번 씻으십시오. 인간 TGFβ (5 NG / ㎖) 인간 IL-항 인간 IFNγ (10 ㎍ / ㎖), 항 인간 IL-4 (10 ㎍ / ㎖) : 500 μL 1X 각 웰 미디어 Th17가 - 편광의 추가 1β (20 ng의 / ㎖) 인간 IL-23 (20 ng의 / ㎖) 인간 IL-6 (25 NG / ㎖) 모두 2 mM L- 글루타민, 100 U 보충 된 무 혈청베이스 미디어 (희석 / mL의 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 100 μM 2- 머 캅토 에탄올). </li><li> 배양 플레이트와 형질 전환 시약을 제조 한 후, 1 ㎖의 마이크로 피펫, 피펫으로 부드럽게 세포를 제외한 모든 세포가 웰의 바닥으로부터 분리되는 것을 보장을 재현 탁. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원추형 원심 분리 튜브에 세포를 풀. 참고 : 여기에 제시된 나흘 프로토콜 이상 문화 기간의 경우, 세포는이 같은 프로토콜을 사용하여 3 일마다 약 형질 전환되어야한다. 2 단계다른 작은 RNA를 처리 한 세포를 풀링 안 보낸 .4 그러나 수정되어야한다. 시험되는 조건이 모두 수집 계산, 별도로 형질 전환해야합니다. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 PBS 세척 중 적어도 1 mL 중에 세포를 재현 탁. 다음 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송 (생존 능력을 평가하기 위해 트리 판 블루 배제를 사용하여 혈구와 예) 라이브 Th17 세포를 계산합니다. </li><li> 세포 펠렛을 실온에서 5 분 동안 500 XG 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 용액 당 2.5-4 X 107 세포의 밀도로 형질 감염 시스템 10 μL 키트에서 제공 재현 탁 완충액을 사용하여 세포를 재현 탁. 실온에서 세포를 유지합니다. 참고 : 가이드 라인으로, 30 분 내에 형질 전환 될 수만큼의 세포를 준비하려고합니다. 다수의 배치는 비교 될 수있다. </li><li> 각는 MicroC 작은 RNA 1 μL에 세포의 9 μL를 추가entrifuge 튜브. 피펫은 한번 설치 후 피펫 팁 전극에로드 형질 세포 작은 RNA를 혼합한다. 주 : 일반적으로, 형질 감염 이전 피펫 팁 전극에 거품을 만드는 것을 방지하기 위해 충분히 혼합가되도록 세포 현탁액 9.5 μL를 추가한다. </li><li> 실온 전해 버퍼 E. 장소 3 ㎖ 피펫 스테이션 큐벳 내부로 제공 큐벳을 기입 한 후, 큐벳 내부의 위치에 배치 피펫. </li><li> 바로 다음의 파라미터를 이용하여 셀과 작은 RNA 각각 10 μL를 혼합 electroporate : 1,500-1,550 펄스 전압을 V, 펄스 폭 10 밀리 초, 3 펄스 형질 장치 합계. </li><li> 일렉트로가 완료되면 바로 1X 배양 플레이트의 웰에 제조 된 미디어 Th17가 편광-500 μL에 세포 혼합액을 추가한다. 5 % CO 2 개의 일 이상 37 ℃ 인큐베이터에 넣어 판. 참고 : 피펫 팅하여 피펫 전극의 끝 부분을 세척위아래로 PBS에서의 각 형질 사이. </li></ol> 3. 인간 수확 Th17 세포 <ol><li> 부드럽게 피펫 팅하지만 모든 세포가 웰의 바닥으로부터 분리되는 것을 보장하는, 마이크로 피펫으로 배양 배지에서 세포를 재현 탁. 기능적 및 / 또는 유전자 발현의 분석을 위해 세포를 준비한다. 주 : 일상적 충분한 세포가 형질 Th17 세포의 단일 웰에서 수득되는 표면 마커 및 세포 내 사이토 카인 및 전사 인자 염색 유세포 분석 또는 유전자 발현 분석 RNA의 제조에 사용된다. </li></ol>

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	<li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations*.">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li><li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-23-IL-17+immune+axis:+from+mechanisms+to+therapeutic+testing.">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li><li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+origin+of+human+Th17+cells.">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells.">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis.">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li><li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression.">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210.">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&amp;gamma;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&amp;gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li><li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production.">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li><li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production.">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li><li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Na&#239;ve+CD4++T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets.">Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins.">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 인간 Th17 세포로 소형의 RNA 전달하기위한 개선 된 방법을 제공한다. 인간 Th17 세포가 여기에 사용되었지만, 소형 RNA를 가진 전기의 방법은받은 Th1, TH2 및 Tregs 다른 기본 인간 T 헬퍼 집합으로 사용될 수있다. 세포가 이전에 형질 전환에 문화를 활성화해야합니다 그래서 순진한 CD4 + T 세포에 대해 잘 작동되지 않았습니다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 먼저 더 나은 IL-17의 생산을 위해 체외 배양 시스템을 최적화. 가장 큰 요인은 기본 미디어이었다. 우리는 혈청이없는 미디어는 기존의 혈청 함유 생산 IL-17A의 더 나은 유도를 위해 미디어를 인간의 Th17 세포에 우수한 것을 알았다. Th17 세포가 사이토킨 TGFβ, IL-1β, IL-23 및 IL-6의 서브 세트에 의해 발생 될 수 있기 때문에, 우리는 다른 시토 킨의 혼합물을 시험했다. 네 편광 사이토 카인이 포함 된 경우 본 연구에서는보다 강력한 IL-17의 생산을 달성했다. 또한, 우리는의 길이를 단축 최적화 된문화는 하나의 형질 전환은 배양 기간 동안 필요하다고 보장합니다. 이 나흘 프로토콜은 결과를 빠르게 생성하고 하나 개의 형질을 필요로 할 수 있지만, 문화, 길이는 더 IL-17의 생산을 증가하기 위해 길게 할 수있다. 더 긴 배양 기간에도 다른 프라이 머리 T 세포 서브 세트의 최적의 분화를 달성 할 필요가있다. 이러한 형질이 과도하기 때문에, 여러 형질이 긴 배양 기간 동안 시간이 지남에 따라 필요할 수 있습니다. 우리는 여러 세포 분열을 통해 희석을 방지하기 위해 시약과 세포를 다시 electroporating에 의해 약 3 일 후에 작은 RNA 시약을 보충하는 것이 좋습니다. 우리는 일상적으로 마우스 CD4 + T 세포에 대한 이런 짓을했는지. 각 조건에서 세포를 별도로 수집 및 계산해야하기 때문에 좀 더 기술적으로 도전하지만, 형질 전환에 성공하고 세포 생존에 미치는 효과가있다. 이 실험에서, 인간의 Th17 세포 우리를인간 탯줄 혈액의 체외 배양을 재생성. 중요한 것은,이 분화 분석을위한 대안 옵션은 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하는 것이다. 두 CBMCs와 PBMC를 들어, 배양 개시 전에 CD4 + T 세포를 분리 할 필요가있다. 우리는 강력한 형질 전환 효율을 산출 부정적인 선택에 의해 CD4 + T 세포를 정제 여기에 우리의 방법을 제시한다, 그러나 우리는 똑같이 잘 작동 주 인간의 CD4 + T 세포를 제조하는 다른 방법을 기대합니다. 우리는 비슷한 형질 전환 효율 이어질 마우스 CD4 + T 세포와 두 가지 방법의 분리에 대한 긍정적 또는 부정적 선택을 사용하는 여러 키트를 시도했다. 추가적인 고려하여 최적 Th17 세포로 분화시키기 위해 나이브 T 세포를 사용하는 것이 중요하다. 사람의 제대혈을 사용하는 것은 이미 나이브 T 세포 (P)의 높은 비율을 가지고 있기 때문에, 이러한 이유로 유리하다원망하고 따라서 정렬하거나 문화의 시작에 앞서 순진 T 세포에 대한 사전 풍부하게 할 필요는 없습니다. 그러나이 방법의 명확한 단점은 제대혈의 제한된 가용성이다. 이 자원에 더 용이하게 사용할 수 있기 때문에 많은 양이 얻어 질해야하지만 다르게, PBMC를 14 나이브 T 세포로 분류하면, 배양하기 전에 수행 될 수있다. 포유류 세포를 형질 감염을위한 다양한 방법이 있지만, 일차 T 세포는 형질 더 어려운 세포 유형 경향이있다. 차세대 전기 수행 기술적으로 용이하며 재현 일시적 형질 감염 T 세포의 성공적인 물리적 방법이다. 최적화 된 후에는 100 %에 가까워 작은 RNA를위한 형질 감염의 매우 높은 효율을 갖는다. 이는도 2에서 알 수있는 CD45 + 세포 (도 2a) 및 포 전체 인구 단봉낮은 발현 수준 RORγt (도 2B) 시프트를 발현하는 모든 세포의 pulation. 중요한 것은, 작은 RNA를 최적화 된 형질 전환 세포 생존 능력을 손상하지 않습니다. 우리는 일상적으로 작은 RNA를 (그림 1D)와 70 % 이상 생존 포스트 형질을 관찰합니다. 생존이 프로토콜, 예컨대 사이토 카인 생산과 같은 다른 T 세포 특성의 생물학에 문제가되지 않지만, 작은 RNA를 가진 형질 감염 후에 영향을받을 수있다. 이러한 이유로, 모든 실험에서 화학 일치 작은 RNA 제어를 사용하는 것이 매우 중요하다. 우리는 세포 사멸을 최소화하고 형질 전환 효율을 극대화하기위한 두 개의 전기 매개 변수, 펄스 전압을 최적화. 높은 전압이 형질 전환시 세포 사멸을 증가시킨다. 다른 어떤 기술적 고려는 세포 사멸을 방지하고 성공적인 형질 사용 합성 시약의 양을 최소화하고 시간 betwee을 제한하는 등 보장<html> N 전지 제조 및 전기. 형질 전환 시약의 합성에 필요한 최소 농도는 항상 잠재적 인 T 세포 독성 및 오프 - 타겟 효과를 방지하기 위해 사용되어야한다. 실내 온도가 매우 중요하고, 필요한 경우 일괄 적으로 세포를 제조함으로써 달성 될 수로 형질 감염 전에 셀 제조 시간을 단축하는 형질 세포의 버퍼 시간을 최소화한다. 현재,이 개 상업적으로 이용 가능한 차세대 전기 장비가있다. 이러한 시스템은 모두 효율적으로 차 T 세포에 감염 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 네온 형질 전환 시스템을 사용하여 최적화되었다. 이 형질 전환 시스템이보다 비용 효과가 있지만, Amaxa의 시스템은 고유의 높은 처리량 애플리케이션을위한 전기에 대한 96 웰 어댑터를 제공합니다. 우리는 추가적인 상업 발전은 최소 비용을 유지하면서, 이러한 형질 전환 시스템의 처리량과 효율성을 계속 증가 할 수 있기를 바랍니다. 이 프로토콜뿐만 아니라 miRNA의 모방 또는 억제제에 예시 된 바와 같이 &quot;인간 T 세포의&gt; 차세대 전기를 효율적으로 관심 대상의 유전자에 대한 siRNA를 포함 작은 RNA를 도입 할 수있다. 높은 효율이 불필요 거의 모든 세포이기 때문에 형질 마커를 사용할 수있게 작은 RNA를 형질. 이것은 전형적인 플라스미드 형질 플라스미드의 양이 증가함에 따라 증가 50 % 초과의 독성 표지 유전자의 20 ~ 30 % 발현 될 DNA 플라스미드 일차 T 세포의 형질 대조적이다. 등장 이 방법을 사용하여 합성 모방 유전자 수십 분자 클로닝 (12, 13)을위한 필요없이 병렬 T 세포 생물학 함수 상영 할 수있다. 또한, 11 병렬 T 세포에 의해 발현 모두의 miRNAs 기능에 대한 테스트를 가능하게했다 13.이 프로토콜적당한 처리량 화면의 이러한 유형의 인간 T 세포에 적용 할 수있다. 특히,이 기술은 최근 게놈 편집 15 차 인간 T 세포에 작은 RNA (gRNA) -Cas9 리보 핵산 단백질 복합체를 소개 하였다. 이러한 다양한 응용 프로그램은 T 세포 생물학을 연구하고자하는 면역 학자를위한 중요한 도구로 여기에 제시된 프로토콜의 유틸리티, 유연성과 기능을 강조 표시합니다.

CD4 + T 세포는 적응 면역 반응의 중요한 관현악입니다. 나이브 CD4 + T 세포는 여러 이펙터 T 세포 (예받은 Th1, TH2, Th17 등)로 현상 할 수있는 로컬 미세 1에 따라 특성 사이토킨 및 전사 인자의 그 자신의 세트 각각. T 세포가 만들어 계보 결정은 자기에게 모두 보호 면역 관용에 대한 중요합니다. Th17 세포 외 박테리아 및 곰팡이를 방지하기 위해 공지 된 T 세포의 서브 세트 중 하나이지만, 그 부적절한 반응은 또한 다발 경화증, 건선과 2, 3과 같이 다수의자가 면역 및 염증성 질환의 병인에 연루되어있다. 인간 Th17 세포는 적절한 환경 편광판 (4)을 제공함으로써 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 생성 될 수있다. 바리오<html> 사이토 카인의 우리 조합은 IL-1β, IL-23, TGFβ, 및 IL-6는 인간의 Th17 세포의 개발을 위해 사용되어왔다. 인간 Th17 세포 CCR6, 통상이 세포 집단을 식별하는 데 사용되며, 그 주요 전사 인자 (RORC 의해 코딩) RORγt (5, 6)의 식에 의해 정의된다 케모카인 수용체 발현. Th17 세포는 여러 사이토 카인을 발현하는 능력을 가지고 있지만, IL-17A는 이들 세포에 의해 생성 된 계통 정의 이펙터 사이토 카인이다. 우리는 우리의 인간 Th17 체외 분화 분석의 견고성을 평가하기 위해 세 가지 Th17 관련 마커 (CCR6, RORγt, IL-17A)의 발현을 조사 하였다. 또한, 우리는이 Th17 마커의 발현이 매우 낮은 또는 부재이어야 이후에는 사이토 카인이나 차단 항체를 음성 대조군으로 사용하는 배지에 첨가되지 않았다 비 편광 조건 하에서 인간 CD4 + T 세포를 배양 하였다. ve_content는 &quot;&gt; 정상적인 인간 T 세포의 발달 및 생물학을 연구하는 하나의 방법은 개발 중에 유전자 발현을 조작 할 수있다. 짧은 간섭 RNA (siRNA와)는 단백질을 코딩하는 mRNA를 타겟팅 특정 유전자의 발현을 감소시키기 위해 이용 될 수있는 합성 작은 RNA 분자이다 . 마이크로 RNA (miRNA가)는 포스트 - 전사적 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 내인성 비 코딩 작은 RNA를이다.의 miRNAs는 Th17 전지 7, 8, 9를 포함하여 쥐와 인간 T 세포 생물학 모두에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 이는 유전자 발현에 궁극적으로 인간 T 세포 생물학에 미치는 영향을 연구하기 위해 인간 T 세포에서 작은 RNA 활동을 조작하는 신뢰할 수있는 방법을 가지고 매우 중요하다. 여기에서, 우리는 우리가 도입 용으로 개발 된, 사용하기 쉽고 일관되고 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명 작은 합성 RNA를 잠긴 핵산 (LNA들에서는 화학적 안정성이 증가 된 핵산을 개질)면역 세포로, 특히 인간의 Th17 세포로. 일반적으로, 생물 화학적 또는 물리적 카테고리 (10)에 속하는 포유 동물 세포 내로 RNA를 작은 도입 여러 다른 방법들이있다. 지질 계 형질 감염, 칼슘 포스페이트 형질 비롯한 일반적으로 사용되는 화학적 방법이 더 효율적으로 세포에 의해 흡수되는 화학-DNA 복합체를 만드는 방법에 의존한다. 일반적으로, 화학적 방법은 일차 T 세포의 형질 감염에 대해서는 비효율적이다. 가장 일반적인 생물학적 방법은 직접 자연 복제주기의 일환으로 호스트에 외국 RNA를 삽입하는 바이러스 벡터 (예 : 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스)를 사용하는 것입니다. 바이러스 성 전달은 일반적으로 하나가 프로 바이러스 플라스미드의 분자 클로닝 시간에 요인 특히, 완료하는 데 시간이 오래 걸립니다. 또한, 바이러스 전달 벡터는 인간의 연구자들에게 잠재적으로 해로울 수 있습니다. 전기 물리적 인 m핵산은 일시적으로 그들의 타겟에 작용할 수있는 세포에 들어갈 수 있도록, 고전압 펄스에 세포를 실시함으로써 막 permeabilization 유도 ethod. 전통적인 전기 장비는 차 림프구를 형질 감염에 효과가 없었다. 그러나, 최적화 된 차세대 전기가 작은 물질 인 RNA 형질 감염 될 때, 특히 매우 높은 효율로 T 세포를 형질 감염 할 수있는 것으로 입증되었다. 용어 차세대 느슨하게 기존의 전기 기계에서 두 개의 새로운 플랫폼 (예를 들어, 네온, Amaxa의)를 구분하는 데 사용됩니다. 또한,이 방법은 하나의 실험에서 약 120 작은 RNA를, 최대 종종 검증 합성 시약을 사용하여 함께 적당한 처리량 스크린의 확장이 용이하다. 중요한 것은, 성공적인 형질 감염은 T 세포 활성화 후 적게 16 시간 후에 달성 될 수있다. 이 방법의 단점은, 그러나, 안정한 유전자 incorporati 초래하지 않는다는 점이다에, 그리고 것은 그러므로 과도이다. 따라서, 그것은 바이러스 벡터에 패키지 성공적으로 작은 RNA의 장기 발현이 요구되는 경우에 T 세포에서 발현 할 수있는 안정적인 발현 구조를 만들 수있는 여분의 노력이 가치가있다. 우리는 서로 다른 목적으로 11, 12, 13에 대한 다양한 합성 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 LNA 올리고 뉴클레오티드 도구를 제공하는 차세대 형질 (예를 들어, 네온)을 사용했다. 효율적인 RNA 간섭은 이중 가닥 짧은 간섭 RNA (siRNA에)를 사용하여 기본 마우스와 인간 T 세포에서 유도 할 수있다. 이 프로토콜은 인간 Th17 세포에서이 기술을 사용하기위한 최적의 조건을 설명한다. siRNA를 외에도 시판 합성 miRNA의 모방 및 억제제 miRNA의 이득 및 기능 상실을 연구하는데 사용될 수있다. miRNA의 모방은 siRNA를 매우 유사 이중 가닥 RNA 분자하지만 고안은성숙한 miRNAs는 내생의 시퀀스 D. miRNA의 억제제는 고유의 miRNA에 결합하여 그 기능을 길항하는 RNA 및 / 또는 LNA 기초하여 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 화학적으로 변성된다. 우리는이 모든 도구가 포함 배양 차 T 림프구에서 효과적으로 사용하지만 인간 Th17 세포에 국한되지 될 수 있다는 것을 발견했다.

<table><tbody><tr><td>anti-human IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&amp;nbsp;</td><td>Clone: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-human IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clone: 4S.B3</td></tr><tr><td>anti-human CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clone: SK3</td></tr><tr><td>mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clone: 11A9</td></tr><tr><td>anti-human RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>Clone: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-human CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Clone: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>For intracellular transcription factor flow cytometry staining</td></tr><tr><td>Hu FcR Binding Inhibitor Purified</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>&quot;Serum-Free Base Media&quot;</td></tr><tr><td>MACS CD28 pure functional grade, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Clone: 15E8</td></tr><tr><td>anti-human CD3 Purified</td><td>UCSF monoclonal antibody core</td><td>N/A</td><td>Clone: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF purified anti-human IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Clone: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-human IFNg, functional grade purified</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>Clone: NIB42</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-23</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-1&amp;beta;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human TGF-&amp;beta;1</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-6</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, Non-targeting #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell Isolation Kit</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Next generation electroporation instrument</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System 10 &amp;mu;L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Provided in kit (MPK1096)</td><td>&quot;Transfection Resuspension Buffer&quot;</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>costar 6-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>costar 48-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Must make 1x solution with distilled water prior to use</td></tr></tbody></table>

small rna transfection in primary human th17 cells by next generation electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

성공적으로 인간의 Th17 세포를 electroporating의 신뢰할 수있는 시스템을 개발하는 첫 번째 단계는 체외 차별화 된 인간의 Th17 세포 배양에서 강력한 생성하는 것이었다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 케모카인 수용체 CCR6 및 전사 인자 RORγt (도 1a 왼쪽)을 나타냈다. T 세포 (오른쪽 그림 1A) 비 편광 (THN) 조건에서 배양했을 때 이러한 마커는 발현되지 않았다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 재 자극시 IL-17A를 생성하지만 THN 조건 (도 1B, 우측) (좌측도 1b). Th17 분화 여전히 작은 RNA를 가진 형질 전환 후에 발생하지만, 일부 실험에서, IL-17의 생산의 주파수 (도 1C)에서 관측 된 환원있다. 사이토 카인 생산에 작은 RNA 형질 감염의 효과를 보여 impor의각 실험 내에서 비교를위한 화학 정합 작은 RNA 제어를 갖는 tance. 중요한 생존 작은 RNA들로 형질 감염 한 후에 유지 전형적 70 % 이상 (도 1d)이다. 이 프로토콜의 효율성을 결정하기 위해, 우리는 RNA 간섭을 사용했습니다. 의 CD45 항원 (단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입 C) PTPRC 유전자에 의해 코딩된다. CD45는 조혈 세포 모두에서 발현되고, 따라서 인간 Th17 세포 견고이 표면 마커를 발현한다. PTPRC 타겟팅 siRNA를 완비 2 일에 인간 Th17 세포의 형질 강하게 화학에 비해 CD45의 발현이 조절 된 siRNA (도 2A)를 일치 감소. CD45 발현이 단봉 인구 이동은 작은 RNA를위한이 프로토콜의 전형적인 100 %의 형질 전환 효율, 근처에 나타냅니다. 따라서,이 형질 EFF을 평가하는데 사용될 수있는 중요한 도구이다프로토콜 최적화 동안 iciency. RORC는 RORγt 직접 IL-17의 생산을 조절하는 인간 Th17 세포의 주된 전사 인자를 암호화한다. (도 2B)가 예상대로 RORC siRNA에 대하여 풀과 현상 Th17 인간 세포를 형질 RORγt 강하게 발현을 감소시켰다. 전시 된 이들 세포는 제어 siRNA를 형질 감염된 세포에 비해 IL-17의 생산 (도 2C)를 환산하여 RNAi를 감소 RORγt 발현은 기능적 효과가 있었다. 비 편광 된 CD4 + T 세포는 RORγt 또는 IL-17A 표현 안되며이 도면에서 음성 대조군으로 나타내었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55546/55546fig1.jpg" /> 도 1 : 시험 관내 인간 Th17 분화 세포 익스프레스 CCR6, RORγt, 및 IL-17A에서. 제대혈에서 분리 된 인간 CD4 + T 세포가 운데 배양 하였다R Th17 조건 (IL-1β, IL-23, IL-6, TGFβ) 또는 비 편광 (THN) 조건 (용지 만, 아니 편광 사이토킨 또는 첨가 된 항체 차단) 시험 관내 및 Th17 마커에 대해 4 일에 분석 유동 세포 계측법에 의해 식 (A) 주제 콘타 디스플레이 표면 CCR6 및 CD4 + T 세포의 세포 RORγt 공동 염색. 사분면에있는 숫자는 %의 CCR6 및 / 또는 RORγt 양성 라이브 단일의 CD4 + 세포를 나타냅니다. (B) PMA / 이오 노마 이신과 함께 재 자극 후 IL-17A 및 IFNγ 생산. 사분면에있는 숫자는 %의 IL-17A 및 / 또는 IFNγ 양성 라이브 단일 CD4 + 세포를 나타냅니다. (C) 대표 등고선 플롯 표시 작은 RNA 컨트롤 CCR6 및 CD4 + T 세포의 세포 RORγt 공동 염색 후 형질 표면. 사분면에있는 숫자는 %의 CCR6를 표시 및 / 또는 RORγt 양성 라이브 단일의 CD4 + 세포 (왼쪽). Representa적인 윤곽 플롯 작은 RNA 컨트롤 후 형질 이오 노마 이신 PMA / 함께 재 자극 후 IL-17A 및 IFNγ 생산을 표시한다. 사분면에있는 숫자는 %의 IL-17A 및 / 또는 IFNγ 양성 라이브 단일 CD4 + 세포 (오른쪽)을 나타냅니다. (D) 주제 등고선 플롯은 CD4 + 세포의 생존율은 작은 RNA 컨트롤 후 형질 표시한다. 번호 %의 CD4 + 살아있는 단일 세포를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55546/55546fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55546/55546fig2.jpg" /> 도 2 : 1 차 인간 Th17 세포에서 RNA 간섭. Th17 조건 하에서 배양 제대혈로부터 인간 CD4 + T 세포는 siRNA를 nontargeting 제어 (siNeg는 Ctl) 또는 풀에 대한 표적으로 하루 2에 형질 감염시켰다<html> PTPRC (SI PTPRC) 또는 RORC (SI RORC)가 4 개 개인 된 siRNA를 포함하는 방법. SI PTPRC (회색 색조)이나 siNeg FET의 (검은 선)를 형질 전환 한 후 대표적인 히스토그램에 나타낸 (A) 표면 CD45 발현 : 세포 계측법 후 4 일째 흐름으로 분석 하였다. (B) 세포 내 발현 RORγt SI RORC (회색 색조)이나 siNeg FET의 (검은 선)를 형질 전환 한 후 대표적인 히스토그램에 도시되어있다. (C) 대표 등고선 플롯은 PMA / 이오 노마 이신 (하단 패널)로 재 자극 한 후 표면 CD4 및 CD4 + T 세포의 세포 RORγt 공동 염색 (상단 패널) 또는 IL-17A 및 IFNγ 생산을 표시. 사분면 숫자 siNeg FET의 또는 Si RORC 형질 THN 또는 Th17 조건 퍼센트 CD4 + RORγt + 또는 IL-17A 및 / 또는 양성 IFNγ 라이브 단일 셀을 나타낸다.fig2large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K 조회수.  University of California, San Francisco. Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

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Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

연구

면역학 및 감염병학

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Microelectrode 배열을 사용하여 siRNA와 자기편 세포의 높은 효율, 특정 사이트 Transfection (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

생체공학

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

생물학

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately understood, thus impeding the establishment of defined treatments. Cell-based additive gene therapies for the increased expression of a protective factor are considered as a promising option to medicate neurodegenerative diseases, such as age-related macular degeneration (AMD). We have developed a method for the stable expression of the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF), which is characterized as a neuroprotective and anti-angiogenic protein in the nervous system, into the genome of primary human pigment epithelial (PE) cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Primary PE cells were isolated from human donor eyes and maintained in culture. After reaching confluence, 1 x 104 cells were suspended in 11 &#181;L of resuspension buffer and combined with 2 &#181;L of a purified solution containing 30 ng of hyperactive SB (SB100X) transposase plasmid and 470 ng of PEDF transposon plasmid. Genetic modification was carried out with a capillary electroporation system using the following parameters: two pulses with a voltage of 1,100 V and a width of 20 ms. Transfected cells were transferred into culture plates containing medium supplemented with fetal bovine serum; antibiotics and antimycotics were added with the first medium exchange. Successful transfection was demonstrated in independently performed experiments. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) showed the increased expression of the PEDF transgene. PEDF secretion was significantly elevated and remained stable, as evaluated by immunoblotting, and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-mediated transfer allowed for a stable PEDF gene integration into the genome of PE cells and ensured the continuous secretion of PEDF, which is critical for the development of a cell-based gene addition therapy to treat AMD or other retinal degenerative diseases. Moreover, analysis of the integration profile of the PEDF transposon into human PE cells indicated an almost random genomic distribution.

We have developed a protocol to transfect primary human pigment epithelial cells by electroporation with the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF) using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Successful transfection was demonstrated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), immunoblotting, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

의학

<meta charset="utf8"></head><body>유세포 분석을 사용한 Naive CD4+ T 세포에서 Th17 세포 분화

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 사이토카인 농도 조절을 사용하여 Th17 세포의 고순도 In Vitro 분화 달성

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

<meta charset="utf8"></head><body>Th17 분화에서 유전자 편집을 위한 가이드 RNA의 레트로바이러스 형질도입

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

요약

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세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Microelectrode 배열을 사용하여 siRNA와 자기편 세포의 높은 효율, 특정 사이트 Transfection (MEA)

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

마우스에서 Naive CD4⁺ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

마우스에서 Naive CD4⁺ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

마우스에서 Naive CD4⁺ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화