This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia &amp; Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

このプロトコルは、人間研究倫理のためのUCSFのガイドラインに準拠しています。 T細胞培養、CD4 + T細胞の単離、及びのTh17分極の調製<ol><li> 少なくとも2時間、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中の抗ヒトCD3（2μg/ ml）および抗ヒトCD28（4μgの/ mL）をウェル当たり1.5mLの0日目に、コート6ウェル組織培養プレート37°C。 <ol><li>代替的に、4℃で一晩コートプレート。パラフィルムでプレートを包みます。 </li></ol></li><li>製造者の指示に従って、密度勾配遠心分離によって臍帯血単核細胞（CBMCs）を準備。 注意：慎重に作業し、血液媒介病原体への曝露のリスクを回避するために、ヒトの血液を取り扱う際に着用され、適切な個人用保護具（PPE）を確保。 </li><li> 単核細胞を単離し、洗浄した後、負SELEによるヒトCD4 + T細胞単離を行います市販のヒトCD4 + T細胞のキットを使用してction。 注：単核細胞の単離後に赤血球の混入がある場合、オプションの赤血球の溶解がCD4 + T細胞単離工程の前に行ってもよいです。分離緩衝液（PBS中2％FBS）1mLの単核細胞を再懸濁します。 1X溶解溶液5mLを加えます。室温で15分間インキュベートします。次いで、細胞をペレット化し、4℃で5分間、300×gで分離緩衝液及び遠心分離機の5ミリリットルを加えます。 <ol><li>新しい5mLのチューブに分離バッファー500μLあたり50×10 6の密度で単核細胞を再懸濁します。 </li><li> FBSの100μL、次いでよく混合するオービタルシェーカー上で20分間、4℃で各チューブをインキュベートチューブ当たり抗体混合物の100μLを加えます。 </li><li>インキュベーション後、細胞を洗浄し、分離緩衝液の3-4 mLを加え。細胞をペレット化し、4℃で8分間、300×gで細胞を遠心分離。慎重にsupeを吸引rnatant。 </li><li>このスピンの間に、磁気ビーズを事前に洗います。ビーズを洗浄し、分離緩衝液の等量を追加します（細胞と1：1で使用）を新しいチューブに磁気ビーズの所望の量を転送します。 1mLのマイクロピペットを用いてよく混合した後、少なくとも1分間磁石中に管を置き。注意深く上清を吸引除去します。最初の前洗浄に移し、同じボリューム内の磁気ビーズを再懸濁。 </li><li>分離緩衝液500μlで各チューブに細胞を再懸濁し、予め洗浄した磁気ビーズの500μLを加えます。 </li><li>よく混合するために室温（25°C〜18°C）でオービタルシェーカー上で15分間、磁気ビーズで細胞をインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、十分少なくとも10倍1mLのマイクロピペットを用いて細胞をピペット。次いで、分離バッファー3-4 mLを加え、2分間磁石中に各管を配置します。 </li><li>慎重にある負の選択CD4 + T細胞を転送します新しいチューブに上清。 </li></ol></li><li> CD4 + T細胞の分離が完了すると、血球計数器で細胞をカウントし、氷上で細胞を維持します。 </li><li> PBSで抗体コーティングプレートを2回洗浄します。抗ヒトIFNγ（20μgの/ mL）を、抗ヒトIL-4（20μgの/ mL）を、ヒトTGFβ（10ng / mLの）、ヒト：次いで、各ウェルへのTh17分極媒体の2X混合物1.5 mLを加えIL-1β（40 ngの/ mL）を、ヒトIL-23（40 ngの/ mL）を、ヒトIL-6（50ng / mlの）すべて2mMのL-グルタミンを補充した無血清基本培地（100で希釈しましたU / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび100μMの2-メルカプトエタノール）。 注：トランスフェクションおよびRNA干渉は、血清含有培地中で作業を行います。このプロトコルを無血清培地を使用する目的は、より優れたIL-17Aの生産を達成することです。 </li><li> 遠心分離機4℃で5分間、500×gでのヒトCD4 + T細胞は、細胞をペレット化します。慎重supernatを吸引蟻。その後、無血清基本培地中で細胞を再懸濁し、最終容量をウェル当たり3ミリリットルであり、偏光サイトカインが1×最終濃度で今であるように、ウェル当たり1.5mLの中に3×10 6の密度で細胞をプレート。 <ol><li> 5％CO 2、2日間37℃のインキュベーターにプレートを置きます。 </li></ol></li></ol> 2.エレクトロポレーションインビトロの極性ヒトTh17細胞<ol><li> 少なくとも2時間、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中の抗ヒトCD3（2μg/ ml）および抗ヒトCD28（4μgの/ mL）をウェル当たり250μLと2日目に、被覆48ウェル組織培養プレート37°C。 <ol><li>代替的に、4℃で一晩コートプレート。パラフィルムでプレートを包みます。 </li></ol></li><li>トランスフェクションのために小さなRNAを準備します。各トランスフェクションのために、1.5mLの微量遠心管へのsiRNAの5μMストック溶液のアリコートを1μL。適切な化学マッチした小さなRNAのCONTRを含めますオール。氷の上のすべてのチューブを保管してください。 </li><li> PBSで抗体コーティングプレートを2回洗浄します。 、抗ヒトIFNγ（を10μg/ mL）を、抗ヒトIL-4（10μgの/ mL）を、ヒトTGFβ（5 NG / mL）を、ヒトIL-：次いで、各ウェルに1×のTh17分極媒体の500μLを加えます1β（20ng / mlの）、ヒトIL-23（20ng / mlの）、ヒトIL-6（25 ngの/ mL）を全て2mMのL-グルタミンを補充した無血清基本培地（100 Uで希釈します/ mLのペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび100μMの2-メルカプトエタノール）。 </li><li>培養プレートおよびトランスフェクション試薬を調製した後、穏やかにピペッティングが、すべての細胞がウェルの底から剥離されることを保証する、1 mLのマイクロピペットで細胞を再懸濁します。 4℃で5分間、500×gでコニカルチューブと遠心分離機に細胞をプールします。 注：本明細書で提示する4日間のプロトコルよりも長い培養期間のために、細胞は、この同じプロトコルを使用して、3日毎に約トランスフェクトされなければなりません。ステップ2異なる低分子RNAで処理した細胞をプールすべきではないので、0.4しかし修飾されなければなりません。テストされた条件のすべてが、収集し、計数し、個別にトランスフェクトされなければなりません。 </li><li>注意深く上清を吸引し、その後洗浄するPBSの少なくとも1 mL中に細胞を再懸濁。その後、マイクロ遠心チューブに細胞を移す（生存率を評価するためにトリパンブルー排除を使用して、血球計など ）のライブTh17細胞を数えます。 </li><li>細胞をペレット化し、室温で5分間、500×gで遠心します。 </li><li>注意深く上清を吸引し、その後、mL当たり2.5〜4×10 7細胞の密度でトランスフェクションシステム10μLキットから提供再懸濁緩衝液を用いて細胞を再懸濁します。室温で細胞を保管してください。 注：ガイドラインとして、30分以内にトランスフェクトすることができるようにのみなど、多くの細胞を調製してみてください。複数のバッチを比較することができます。 </li><li>それぞれのMicroCに小さなRNAの1μLに細胞の9μLを追加entrifugeチューブ。ピペットは、一度に設けられピペット電極チップにロードし、次いでトランスフェクションのための細胞および小RNAを混合します。 注：典型的には、トランスフェクション前にピペット電極先端に泡を作成防ぐために混合物の十分があることを確認するために、細胞懸濁液の9.5μLを加えます。 </li><li>室温電解バッファE.プレイス3mLのピペットステーション内部キュベットを備えたキュベットを充填した後、キュベット内の位置にピペットを配置します。 </li><li>以下のパラメータを使用して、細胞および小RNAの直ちにエレクトロポレーション各10μLミックス：パルス電圧1,500-1,550 Vを、パルス幅10ミリ秒、及び3つのパルストランスフェクションデバイスに合計します。 </li><li>エレクトロポレーションが完了した後、直接培養プレートの調製ウェルに1XのTh17分極媒体の500μLに細胞混合物を加えます。 5％CO 2、さらに2日間37℃のインキュベーターに入れプレート。 注：ピペットでピペット電極チップを洗います上下PBS中で各トランスフェクションの間です。 </li></ol> 3.収穫ヒトTh17細胞<ol><li>穏やかにピペッティングが、すべての細胞がウェルの底から剥離されることを保証する、マイクロピペットで培養培地中で細胞を再懸濁。機能的および/または遺伝子発現アッセイのための細胞を調製します。 注：定期、十分な細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析および転写因子染色のために、または遺伝子発現分析のためのRNAの調製のために使用されるトランスフェクトされたTh17細胞の単一のウェルから得られています。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、ヒトTh17細胞への小RNAの送達のための改良された方法を提供します。ヒトTh17細胞は、ここで使用されたが、低分子RNAとエレクトロポレーションのこの方法は、TH1、TH2及びTregのような他の初代ヒトTヘルパーサブセットと共に使用することができます。細胞はトランスフェクションの前に培養して活性化されなければならないので、ナイーブCD4 + T細胞についてうまくいっていません。このプロトコルのために、我々は最初のよりよいIL-17Aの生産のためのin vitro培養系を最適化。最大の要因は、ベースのメディアでした。私たちは、無血清培地は、IL-17Aが、ヒトTh17細胞を産生するより良い誘導のために、従来の血清含有培地より​​も優れていたことがわかりました。 Th17細胞は、サイトカインTGFβ、IL-1β、IL-23、およびIL-6のサブセットを用いて生成することができるので、我々は、異なるサイトカインの混合物を試験しました。すべての4つの偏光のサイトカインが含まれていたときに、この研究では、より強固なIL-17Aの生産を達成しました。さらに、当社は、の長さを短く最適化唯一のトランスフェクションを確実にする文化は、培養期間中に必要でした。この4日間のプロトコルは、結果をより速く生成することを可能にする、唯一のトランスフェクションを必要としながら、培養長はさらに、IL-17A産生を増加させるために長くすることができます。より長い培養期間があっても、他の一次T細胞サブセットの最適な分化を達成するために必要であり得ます。これらのトランスフェクションは一過性であるため、複数のトランスフェクションは、長い培養期間のために時間をかけて必要な場合があります。我々は、複数の細胞分裂を超える希釈を防ぐための試薬で細胞を再エレクトロポレーションにより約3日後に、小さなRNAの試薬を補充することをお勧めします。私たちは日常マウスCD4 + T細胞のためにこれを行っています。各条件で細胞を回収し、別々にカウントしなければならないので、それは、より技術的に困難ではあるが、トランスフェクションが成功し、細胞生存率に対する最小の効果があります。 これらの実験において、ヒトTh17細胞たちヒト臍帯血のインビトロ培養によって再生成。重要なことに、この分化アッセイのための代替オプションは、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を使用することであろう。 CBMCsとのPBMCの両方のために、前培養の開始にCD4 + T細胞を単離することが必要です。ここでは堅牢なトランスフェクション効率をもたらした負の選択によって、CD4 + T細胞を精製するための手法を提示し、私たちは、初代ヒトCD4 + T細胞を調製する他の方法は、同様にうまく機能するであろう期待しています。我々は、同様のトランスフェクション効率をもたらしたマウスCD4 + T細胞および両方の方法の単離のために、正または負のいずれかの選択を使用するいくつかのキットを試みました。追加の考慮事項は、最適Th17細胞に分化するために、ナイーブT細胞を使用することの重要性です。ヒト臍帯血を使用することは既にナイーブT細胞pの高い割合を有しているので、この理由のために有利です再送としたがって、ソートまたは培養の開始前に、ナイーブT細胞をプレ濃縮する必要はありません。しかし、このアプローチの明確な欠点は、臍帯血の利用が限られています。このリソースがより容易に利用可能であるので、大量に取得しなければならないであろうがあるいは、PBMCを14からナイーブT細胞の選別は、培養の前に行うことができます。 哺乳動物細胞をトランスフェクトするための複数の方法があるが、一次T細胞をトランスフェクトすることがより困難細胞型になる傾向があります。次世代エレクトロポレーションは、実行するのは技術的に容易であり、再現性のある一過性トランスフェクトT細胞の成功した物理的な方法です。最適化されたら、それは100％に近づく小さなRNAのトランスフェクションのための非常に高い効率を有します。これは、 図2に見ることができる場所CD45 +細胞（ 図2A）およびPOの全体単峰人口低い発現レベルのRORγt（ 図2B）シフトを発現する全ての細胞のpulation。重要なのは、小さなRNAとの最適化されたトランスフェクションは、細胞の生存率を損ないません。我々は日常的に低分子RNA（ 図1D）と70％以上の生存率のトランスフェクション後に観察します。生存率は、このプロトコル、例えばサイトカイン産生などの他のT細胞特性の生物学の問題ではないが、低分子RNAによるトランスフェクション後に影響を受けることができます。このため、すべての実験で化学をマッチさせた小さなRNAコントロールを使用することが非常に重要です。 我々は、細胞死を最小限にし、トランスフェクション効率を最大にするため、2つのエレクトロポレーションパラメータ、パルス電圧を最適化します。高い電圧は、トランスフェクション時に細胞死を高めます。細胞死を防止し、成功したトランスフェクションを確保するために他のいくつかの技術的な考慮事項は、使用される合成試薬の量を最小限に抑え、betwee時間を限定的<html> n個の細胞の調製およびエレクトロポレーション。合成トランスフェクション試薬のために必要な最小濃度は、常に潜在的なT細胞毒性およびオフターゲット効果を防止するために使用されるべきです。室温でのトランスフェクション緩衝液中の細胞の時間を最小限にするためにトランスフェクション前に細胞調製時間を短縮することは重要であり、必要に応じて、バッチで細胞を調製することによって達成することができます。 現在、2台の市販されている次世代のエレクトロポレーション機器があります。これらのシステムの両方を効率的に一次T細胞をトランスフェクトすることができます。このプロトコルは、ネオントランスフェクション系を使用して最適化しました。このトランスフェクション系は、よりコスト効果的であるが、AMAXAシステム一意高いスループットアプリケーションのためのエレクトロポレーションのために96ウェルアダプタを提供します。私たちは、最低でもコストを維持しながら、追加の商業的進歩は、これらのトランスフェクションシステムのスループットと効率を向上し続けることを願っています。 「ヒトT細胞の&gt;次世代エレクトロポレーションを効率的にこのプロトコルに例示されるように、目的の標的遺伝子に対するsiRNAと同様のmiRNA模倣剤または阻害剤を含む小RNAを導入することができる。ほぼすべての細胞であるため、高効率トランスフェクションのマーカーを使用する必要がなくなります小さなRNAでトランスフェクトされた。これは典型的なプラスミドのトランスフェクションは、プラスミドの量の増加に伴って増加50％以上の毒性マーカー遺伝子のわずか20〜30％の発現をもたらすDNAプラスミド一次T細胞のトランスフェクションとは対照的である。概要この方法を用いて合成模倣体は、遺伝子の多数は、分子クローニング12、13を必要とせずに並列にT細胞生物学における機能についてスクリーニングするために許可されている。また、11並列にT細胞によって発現されるすべてのmiRNAの機能のテストを可能にしました、13。このプロトコルで、適度スループットスクリーニングのこれらのタイプは、ヒトT細胞に適用されます。特に、この技術は、最近ゲノム編集15のプライマリヒトT細胞への小RNA（gRNA）-Cas9リボ核タンパク質複合体を導入するために使用しました。これらの多様なアプリケーションには、T細胞生物学を勉強しようとしている免疫学者のための重要なツールとして、ここで紹介するプロトコルの有用性、柔軟性とパワーを強調表示します。

CD4 + T細胞は、適応免疫応答の重要なオーケストレーターです。ナイーブCD4 + T細胞は、いくつかの異なるエフェクターT細胞（ 例えば TH1、TH2、Th17細胞、 等 ）に現像することが可能である、局所微小環境1に依存特性サイトカインおよび転写因子の独自のセットをそれぞれ。 T細胞が作る系譜の決定は、自己に対する防御免疫と寛容の両方のために重要です。 Th17細胞は、細胞外細菌および真菌に対抗することが知られているT細胞のサブセットであるが、その不適切な応答はまた、多発性硬化症および乾癬2、3のように複数の自己免疫疾患および炎症性疾患の病因に関与しています。ヒトTh17細胞は、適切な偏光環境4とそれらを提供することにより、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から生成することができます。バリオ<html>私たちのサイトカインIL-1βの組み合わせ、IL-23、TGFβ、及びIL-6は、人間のTh17細胞の発達のために使用されています。ヒトTh17細胞はCCR6、一般的にこの細胞集団を同定するために使用され、それらの主要な転写因子、（RORCによってコードされる）のRORγt5、6の式で定義されるケモカイン受容体を発現します。 Th17細胞は、複数のサイトカインを発現する能力を有するが、IL-17Aは、これらの細胞によって産生さ系統規定エフェクターサイトカインです。私たちは、ヒトTh17細胞のin vitro分化アッセイの頑健性を評価するために、3つのすべてのTh17関連マーカー（CCR6、のRORγt、IL-17A）の発現を調べました。また、我々は、これらのTh17マーカーの発現が非常に低いかまたは存在しないなければならないので、何のサイトカインまたはブロッキング抗体を陰性対照として使用するために培地に添加しなかった非分極条件下でヒトCD4 + T細胞を培養しました。 ve_content &quot;&gt;正常ヒトT細胞の発達及び生物学を研究する1つの方法は、開発中の遺伝子発現を操作することである。短干渉RNA（siRNA）は、タンパク質をコードするmRNAを標的とする合成小RNA分子であり、特定の遺伝子の発現を減少させるために利用することができます。マイクロRNA（miRNA）は転写後遺伝子発現を調節することが知られている内因性の非コード小型RNAである。miRNAは、Th17細胞7、8、9に含め、マウスおよびヒトT細胞生物学の両方で重要な役割を果たしていることが示されている。これは、遺伝子発現に及ぼす影響を研究するために、ヒトT細胞の小さなRNAの活動を操作し、最終的にはヒトT細胞生物学上の信頼性の高い方法を持つことが重要です。ここでは、我々は我々が導入するために開発さ簡単に使用できる、一貫性と信頼性プロトコルを記述小さな合成RNAおよびロックされた核酸（LNA、増大した安定性を有する化学的に修飾された核酸）免疫細胞への、そして、ヒトTh17細胞へ。 一般に、化学、生物学的、または物理的なカテゴリ10に分類された哺乳動物細胞、内低分子RNAを導入するいくつかの代替方法があります。脂質ベースのトランスフェクション、およびリン酸カルシウムのトランスフェクションを含む一般的に使用される化学的方法は、より効率的に細胞に取り込まれている化学-DNA複合体を作成することに依存しています。一般的に、化学的方法は、一次T細胞のトランスフェクション用として効率的ではありません。最も一般的な生物学的方法は、直接的にその天然の複製サイクルの一部として宿主に外来RNAを挿入するウイルスベクター（ 例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス）を使用することです。ウイルス形質導入は、一般的にプロウイルスプラスミドの分子クローニングのための時間にする場合は特に1つの要因、完了するまでに時間がかかります。また、ウイルス形質導入ベクターとしては、人間の研究者に対して潜在的に有害であり得ます。エレクトロポレーションは、物理mで核酸は一過性に、彼らは彼らのターゲットに作用することができセルに入力することができ、高電圧パルスに細胞を付すことにより、膜透過性を誘導するethod。従来のエレクトロポレーション機器は、初代リンパ球をトランスフェクトするための効果的ではなかったです。しかし、最適化された次世代のエレクトロポレーションは、トランスフェクトされる材料は、小さいRNAである場合は特に、非常に高い効率でT細胞をトランスフェクトすることができることが証明されています。用語次の世代は緩く、伝統的なエレクトロポレーションマシンから2つの新しいプラットフォーム（ 例えば 、ネオン、AMAXA）を区別するために使用されます。また、この方法は、多くの場合、検証合成試薬を用いて単一の実験で最大約120小RNAと中程度のスループットスクリーニングのために容易に拡張可能です。重要なことに、成功したトランスフェクションは、T細胞活性化後にわずか16のような時間で達成することができます。この方法の欠点は、しかし、それは安定したゲノムincorporatiが生じないということです上、したがって、一過性です。したがって、ウイルスベクターにパッケージングされ、正常に小さなRNAの長期発現が必要とされる場合にはT細胞で発現させることができる安定した発現構築物を作成するために余分な労力の価値があります。 我々は、異なる目的の11、12、13のために多様な合成一本鎖または二本鎖RNA又はLNAオリゴヌクレオチドのツールを提供する次世代のトランスフェクション（ 例えば 、ネオン）を使用しています。効率的なRNA干渉は、二本鎖短干渉RNA（siRNA）を使用して、一次マウスおよびヒトT細胞において誘導することができます。このプロトコルは、ヒトTh17細胞は、この技術を使用するための最適化された条件を記載しています。 siRNAに加えて、市販の合成miRNA模倣剤および阻害剤は、機能のmiRNAの利得及び損失を研究するために使用することができます。 miRNA模倣は、siRNAと非常に類似した二本鎖RNA分子であるが、デザイン性は、内因性の成熟miRNAの配列とD。 miRNA阻害剤は、化学的に修飾されたRNAおよび/または天然のmiRNAに結合し、その機能を拮抗するLNAベースの一本鎖オリゴヌクレオチドです。私たちは、これらのツールのすべてを含めて、初代培養Tリンパ球に効果的に使用されるが、人間のTh17細胞に限定されないことができることを見出しました。

<table><tbody><tr><td>anti-human IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&amp;nbsp;</td><td>Clone: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-human IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clone: 4S.B3</td></tr><tr><td>anti-human CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clone: SK3</td></tr><tr><td>mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clone: 11A9</td></tr><tr><td>anti-human RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>Clone: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-human CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Clone: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>For intracellular transcription factor flow cytometry staining</td></tr><tr><td>Hu FcR Binding Inhibitor Purified</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>&quot;Serum-Free Base Media&quot;</td></tr><tr><td>MACS CD28 pure functional grade, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Clone: 15E8</td></tr><tr><td>anti-human CD3 Purified</td><td>UCSF monoclonal antibody core</td><td>N/A</td><td>Clone: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF purified anti-human IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Clone: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-human IFNg, functional grade purified</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>Clone: NIB42</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-23</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-1&amp;beta;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human TGF-&amp;beta;1</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-6</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, Non-targeting #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell Isolation Kit</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Next generation electroporation instrument</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System 10 &amp;mu;L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Provided in kit (MPK1096)</td><td>&quot;Transfection Resuspension Buffer&quot;</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>costar 6-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>costar 48-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Must make 1x solution with distilled water prior to use</td></tr></tbody></table>

small rna transfection in primary human th17 cells by next generation electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

正常ヒトTh17細胞をエレクトロポレーションの信頼性の高いシステムを開発するための最初のステップは、 インビトロ分化ヒトのTh17細胞培養におけるロバスト生成することでした。 Th17分極条件下で培養T細胞は、ケモカイン受容体CCR6および転写因子のRORγt（ 図1A、左）を発現しました。 T細胞は（右図1A）非偏光（THN）条件下で培養したときに、これらのマーカーは発現されませんでした。 Th17分極条件下で培養T細胞は、再刺激時にIL-17Aを産生しなくTHN条件下（ 図1B、右）（左図1B）。 TH17分化は依然として低分子RNAによるトランスフェクション後に起こるが、いくつかの実験では、IL-17A産生の頻度（ 図1C）で観察された減少があります。サイトカイン産生に対する小さなRNAトランスフェクションの効果はimporを実証します各実験内の比較のための化学整合小RNA制御を有するのタンス。重要なことに、生存率は低分子RNAでトランスフェクションした後に維持され、典型的には70％以上（ 図1D）です。 このプロトコルの効率を決定するために、我々は、RNA干渉を使用しました。 CD45抗原は、PTPRC（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプC）遺伝子によってコードされています。 CD45は、全ての造血細胞上に発現され、したがって、ヒトTh17細胞は、ロバストこの表面マーカーを発現しなければなりません。 PTPRCを標的とするsiRNAプールが2日目に、ヒトTh17細胞のトランスフェクションは、強く化学と比較して、CD45の発現を減少させた対照siRNA（ 図2A）と一致しました。 CD45発現のこの単峰人口シフトは低分子RNAのためのこのプロトコルの典型的な、100％のトランスフェクション効率の近傍を示しています。したがって、これは、トランスフェクションを評価するために使用することができる重要なツールであるEFFプロトコルの最適化中にiciency。 RORCはのRORγt、直接IL-17A産生を調節するヒトTh17細胞の優勢な転写因子をコードします。 （ 図2B）予想通りRORCに対するsiRNAプールに現像ヒトTh17細胞をトランスフェクトするが強くのRORγtの発現を減少させました。示したこれらの細胞は、対照siRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、IL-17A産生（ 図2C）の低下としてRNAiによる還元のRORγtの発現は、機能的な効果を有していました。非偏CD4 + T細胞は、任意のRORγt又はIL-17Aを発現しないはずであり、この図では、陰性対照として示されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55546/55546fig1.jpg" /> 図1： インビトロで分化したヒトTh17細胞エクスプレスCCR6、のRORγt、及びIL-17A に 。臍帯血から単離されたヒトCD4 + T細胞を培養したアンクルRのTh17条件（IL-1β、IL-23、IL-6、およびTGFβ）又は非偏光（THN）条件下で（媒体のみ、いかなる偏サイトカインまたはブロッキング抗体を添加しない）、インビトロおよびTh17細胞マーカーについて4日目に分析しましたフローサイトメトリーによる式：（A）代表的な等高線プロット表示面CCR6およびCD4 + T細胞の細胞内のRORγt共染色。象限の数字はパーセントCCR6及び/又はのRORγt陽性生シングレットCD4 +細胞を示します。 （B）PMA /イオノマイシンによる再刺激後のIL-17AおよびIFNγ生産。象限の数字はパーセントIL-17Aおよび/またはIFNγ陽性生シングレットCD4 +細胞を示します。 （C）代表的な等高線図が表示されCCR6と小さなRNA制御を有するCD4 + T細胞をトランスフェクション後の細胞内のRORγt共染色表面。象限の数字はパーセントCCR6及び/又はのRORγt陽性生シングレットCD4 +細胞（左）を示します。 RepresentaTIVE輪郭プロットは、PMA /小RNAコントロールとイオノマイシントランスフェクションによる再刺激後のIL-17AおよびIFNγ産生を表示します。象限の数字はパーセントIL-17Aおよび/またはIFNγ陽性生シングレットCD4 +細胞（右）を示します。 （D）代表輪郭プロットは、CD4 +細胞の生存率は、小さなRNAコントロールでトランスフェクション後表示します。数パーセントCD4 +生一重の細胞を示します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55546/55546fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55546/55546fig2.jpg" /> 図2：初代ヒトTh17細胞におけるRNA干渉。 Th17条件下で培養臍帯血由来のヒトCD4 + T細胞は、siRNA非ターゲティングコントロール（siNeg CTL）またはターゲティングプールに対してで2日目にトランスフェクトしました<html> 4つの個々のsiRNAを含むPTPRC（SI PTPRC）またはRORC（SI RORC）。 SI PTPRC（グレーの色合い）またはsiNegのCtlによるトランスフェクション後の代表的なヒストグラムに示す（A）表面CD45発現（黒線）：次いで、細胞を4日目にフローサイトメトリーにより分析しました。 （B）細胞内のRORγt式がSi RORC（グレーの色合い）またはsiNegのCtl（黒線）を用いたトランスフェクション後の代表的なヒストグラムに示されています。 （C）代表的な等高線プロットは、PMA /イオノマイシン（下のパネル）での再刺激後の表面CD4およびCD4 + T細胞の細胞内のRORγt共染色（上のパネル）またはIL-17AおよびIFNγ産生を示します。象限の数字はsiNegのCtlまたはSi RORCでトランスフェクトTHN又はTh17の条件下パーセントCD4 +のRORγt+またはIL-17Aおよび/またはIFNγ陽性生シングレット細胞を示します。fig2large.jpg」ターゲット= 『_空白』&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

small-rna-transfection-primary-human-th17-cells-next-generation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K ビュー.  University of California, San Francisco. Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

ビデオ: Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

免疫・感染学

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

生物工学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

生物学

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately understood, thus impeding the establishment of defined treatments. Cell-based additive gene therapies for the increased expression of a protective factor are considered as a promising option to medicate neurodegenerative diseases, such as age-related macular degeneration (AMD). We have developed a method for the stable expression of the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF), which is characterized as a neuroprotective and anti-angiogenic protein in the nervous system, into the genome of primary human pigment epithelial (PE) cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Primary PE cells were isolated from human donor eyes and maintained in culture. After reaching confluence, 1 x 104 cells were suspended in 11 &#181;L of resuspension buffer and combined with 2 &#181;L of a purified solution containing 30 ng of hyperactive SB (SB100X) transposase plasmid and 470 ng of PEDF transposon plasmid. Genetic modification was carried out with a capillary electroporation system using the following parameters: two pulses with a voltage of 1,100 V and a width of 20 ms. Transfected cells were transferred into culture plates containing medium supplemented with fetal bovine serum; antibiotics and antimycotics were added with the first medium exchange. Successful transfection was demonstrated in independently performed experiments. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) showed the increased expression of the PEDF transgene. PEDF secretion was significantly elevated and remained stable, as evaluated by immunoblotting, and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-mediated transfer allowed for a stable PEDF gene integration into the genome of PE cells and ensured the continuous secretion of PEDF, which is critical for the development of a cell-based gene addition therapy to treat AMD or other retinal degenerative diseases. Moreover, analysis of the integration profile of the PEDF transposon into human PE cells indicated an almost random genomic distribution.

We have developed a protocol to transfect primary human pigment epithelial cells by electroporation with the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF) using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Successful transfection was demonstrated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), immunoblotting, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションに基づく遺伝子改変

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

医学

<meta charset="utf8"></head><body>フローサイトメトリーを用いたナイーブCD4+ T細胞からのTh17細胞分化

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:サイトカイン濃度調節を用いたTh17細胞の高純度In vitro分化の達成

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

<meta charset="utf8"></head><body>Th17分化における遺伝子編集のためのガイドRNAのレトロウイルス形質導入

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

要約

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細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウトプライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションに基づく遺伝子改変

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

要約

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細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションに基づく遺伝子改変

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウトプライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化