Name: two algorithms for high-throughput and multi-parametric quantification of drosophila neuromuscular junction morphology
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology at JoVE.com

우리는 초파리 균주를 제공하기 위해 비엔나 초파리 리소스 센터 및 블루밍턴 초파리 재고 센터 (NIH P40OD018537)을 인정합니다. 우리는 영상 전문가 지원을 위해 대한 현미경 이미징 센터에서 잭 프랜슨합니다. 이 연구는 독일의 정신 지체 네트워크에 의해, 두 DCN / Radboud 대학 의료 센터의 박사 장학금으로, VIDI 및 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)에서 TOP 보조금 (917-96-346, 912-12-109)에 의해 지원되었다 교육 및 연구 (BMBF)의 독일 연방 정부의 NGFN + 프로그램 및 AS에 대한 유럽 연합의 FP7 대규모 통합 네트워크 Gencodys (건강-241995)에 의해 투자. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.

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&quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;와 &quot;초파리 NMJ 부통 Morphometrics은&quot;시냅스 형태의 평가에 관심이 연구자를위한 강력한 도구입니다. NMJ 매개 변수의 수동 평가는 힘든 것입니다; 이 매크로는 15 분에 숙련 된 연구원을 절약 할 것으로 추정된다 / NMJ 수동 영상 분할에 보냈다. 조건 또는 유전자형에 따라 평가 시냅스 1 ~ 2 수십, 이것은 신속하게 아주 작은 규모의 연구에서, 저장 시간의 상당한 양을 요약한다. 대형 화면을 수행 할 때, 수동 평가 및 정량화에 비해 높은 처리량 분석을 사용할 때의 이득은 엄청난 수있다. 증가 된 처리량에 더하여, 매크로 용이 객관적인 분석을 제공한다; 그들은 그렇지 않으면 눈을 멀게 실험뿐만 아니라 여러 연구자가 분석에 관여 할 때 발생하는 대인 관계의 차이를 필요로 개인 편견을 제외 할 수 있습니다. 마지막으로, 매크로는 민감하고 정확한을 제공극적인 NMJ 결함보다는 미묘한 원인이 지금까지 연구자의 눈에 의해 진가를 인정받지 못한 남아있는 시냅스 규제의 식별을 허용 NMJ 기능 alysis. 검증 절차 및 매크로에 사용되는 알고리즘에 대한 자세한 정보는 게시 Nijhof 등의 알에서 발견된다. (17). 매크로의 기능을 적절하게 근육이어서 4에 초파리 melanogaster의 NMJs의 형태 적 특징을 측정하기 위해 확인 된, 상기 매크로이 유기체의 다른 근육에 시냅스를 분석하기에 적합 있다고 입증되었다. 이 매크로는 다른 초파리 종과 더 곤충을 포함한 다른 종의 유사한 구조와 NMJ의 형태 학적 매개 변수를 측정 할 수있는 가능성이 높습니다. 진화에 매우 먼 심지어 NMJs는, 예를 들면, 마우스의 NMJs는 매우 유사한 구조 형태를 보여 (29). 매크로는 다른 종에서 NMJ 준비에 테스트하지 않은 있지만, 잠재적 인 사용자는 이러한 목적으로 매크로를 테스트하는 것이 좋습니다. 사용자가 / 정의 이미지에 가장 적합한 매크로 설정을 선택할 수있는 다양한 자동 임계 값 및 알고리즘을 탐구하는 것이 매우 중요합니다. 매크로 평가는 수동 평가 비교할 때 이러한 설정으로, 약 95 %의 정확도가 얻어진다. 매크로 설정을 조정하면 제대로 세그먼트는 이미지의 100 %가 매우 힘든 또는 불가능 절차가 될 수 있습니다. 그들의 수는 5 % 이하 경우에 따라서 적절하게 분할되지 이미지를 배제하는 것이 좋습니다. 이미지의 품질이 낮 으면 분명히, 매크로는 만족스럽지 못한 영상 분할의 높은 비율을 생성합니다. 낮은 품질의 이미지는 유사하게 수동 평가에 영향을 미칠 것이다, 따라서 매크로의 성능에 링크 할 수 없습니다. 그들은 이미지 설계된대로 그럼에도 불구하고 매크로 오히려 견고높은 함량 현미경 (17) (샘플의 다수의 이미지를 허용하는 자동 형광 현미경) s의 생성. 중요한 점은 사용자가 시각적으로 매크로에 의해 생성 된 모든 결과의 이미지를 검사한다는 것이다. 이것은 감지하고 만족스럽지 분할로 사진을 제외 할 수 있습니다. 이 프로토콜 (6)에서, 사용자는 &quot;분석&quot;서브 매크로 실행시 정확한 이미지 분할의 설정을 조정하는 방법에 대해 안내된다. 빠르게 매크로의 요구 사항 및 방법 매크로 설정 &quot;매크로 설정을 Examples_adjusting&quot;라는 폴더를 조정하는 방법에 익숙해 매크로 저장소 https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a에 포함되어 있습니다. 예제 (고 함량 / 촛점 / 형광 현미경) 다른 현미경 플랫폼에서 얻어진 화상과 다른 immunostainings 열세 하위 각각이 제공된다. PDF 파일 권리 &quot;예 가이드는&quot;동일한에 포함되어 있습니다각 예제에 필요한 설정이 예상 결과와 결과 이미지를 제공하는 텍스트 문서와 함께 제공되는 폴더. 매크로는 티파니 파일을 분리로 저장된 이미지를 처리하도록 설계되었습니다, 그럼에도 불구하고 일부 사용자는 다른 형식으로 자신의 이미지를 저장 한 수 있습니다. 상세한 지침 문서 &quot;예 안내서&quot;어떻게 매크로로 이미지를 가져 - 다음 웹 사이트 https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a (21)는 세 개의 예제 파일 (3 예 1) &quot;초파리 NMJ&quot;라는 이름의 폴더가 티파니 분리 된 파일로 저장되지 않은 경우도 같은 폴더에서 찾을 수 있습니다. NMJ 지역, NMJ 주변, 튼스의 수, NMJ의 부통 지역, NMJ 길이, NMJ 긴 지점의 길이, 이슬라 번호 : 함께 &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;와 &quot;초파리 NMJ 부통 Morphometrics&quot;매크로는 10 개 개의 다른 NMJ 기능을 정량화NDS, 지점의 수, 분기점의 수 및 활성 영역의 수. 이것은 단지 하나 또는 몇 시냅스 기능 (30), (31)을 평가할 수 있습니다 지금까지 사용 가능한 도구를 통해 큰 장점을 제공한다. Multiparametric 정량 분석은 시냅스 생물학의 여러 측면까지를 제어하는 새로운 규제를 식별하기 위해 새로운 발견, 예를 들어,에 대한 큰 잠재력을 맺는다. 또한 동일 또는 중복 NMJ 기능을 coregulate 따라서 일반적인 분자 경로에서 작동 할 가능성이 유전자를 결정하는 데 필요한 해상도를 제공합니다. 마지막으로, 유전자 시냅스 파라미터는 조정 된 형태 학적 상관 관계를 확인 교란 조건 (17)으로 서로 상호 얼마나 다른지 조사 할 수있는 가능성을 연다. 함께 찍은,이 프로토콜은 &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;두 매크로를 사용하는 방법을 보여줍니다 및고 처리량 방법으로 열 개 형태 NMJ 기능 대물 민감한 정량화를 수행 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics&quot;.

이러한 지적 장애, 자폐증 스펙트럼 장애와 같은인지 장애, 정신 분열증은 종종 비정상적인 시냅스 기능 1, 2, 3을 특징으로한다. 시냅스의 형태와 기능은 밀접하게 얽혀있다; 형태 적 결함이 시냅스 오작동을 일으킬 수 있고, 역으로, 비정상적인 시냅스 전달은 시냅스 성숙 및 형태 4, 5, 6에 영향을 미칠 것이다. 모델 생물의 수는 더 나은 시냅스 생물학을 이해하고 시냅스 변화가 건강과 질병 7, 8, 9의 뇌 기능에 미치는 영향을 밝혀하기 위해 사용되어왔다. 초파리 NMJ은 광범위하게 연구하고 글루타메이트 SY에 대한 생체 내 모델에서 잘 확립napse 생물학 10, 11. 지난 수십 년 동안,이 모델은 NMJs 사이의 형태 학적 차이를 감지 할 목적으로,뿐만 아니라 대규모 유전 화면에 대한 생리 학적 유전자에 초점을 맞춘 연구에 사용되어왔다. 특히, 순방향 유전자 스크린 시냅스 개발 기초 많은 중요한 레귤레이터 및 메커니즘을 식별하여 12, 13, 14, 15, 16를 작동 하였다. 그러나, 이러한 화면의 대부분 NMJ 단말기 형태의 시각적 평가 및 정성 시냅스 이상 검출 또는 몇몇 형태 적 특징의 반 정량적 점수에 의존. 결과적으로, 인간의 눈에 비 명백하다 오히려 미묘한 시냅스 형태 학적 이상이 간과하기 쉬운. 위해서하는 것은 포괄적으로 양적 차이는 감지 할 수 있어야합니다NMJ 정확하게 관심의 형태 학적 매개 변수의 체계적인 정량화에 의해 평가되어야한다. 수동으로 NMJ 기능을 측정하는 것은 여러 NMJ 관심의 기능 및 / 또는 대규모 유전 검사를 수행 할 때이있다, 특히 힘든입니다. multiparametric 높은 처리량 형태소 해석을 지원하기 위해 객관적 정량을 달성하기 위해, 두 매크로 &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;및 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics는&quot;17 개발되었다. 두 매크로는 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 피지 (18)에서 실행, 모두 공 초점 및 nonconfocal 이미지를 정량화 할 수 있습니다. &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;방안은 큰 1 시냅스 마커 디스크 (굴림-1) 또는 연접 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)로 면역 염색 NMJ 단자는 활성 영역 마커 bruchpilot (BRP)와 CO는 표지. 그것은 구 형태 parame을 정량화TERS (이하에서 설명) NMJ 영역 NMJ 경계, 튼스 수, NMJ 길이 NMJ 긴 분기 길이, 섬의 수, 지점의 수, 분기점 및 시냅스 말단 활성 영역 번호의 수 (도 1) . 튼스의 수를 결정하는 알고리즘이 매크로에 존재하지만, 정확성 (17)에 대한 기준을 충족하지 않았다. 적절 튼스의 수를 평가하기 위해, 특별히 반대 Synaptotagmin (SYT를) 또는 항 시스테인 문자열 단백질 (CSP)으로 면역 염색 NMJ 제제를 사용 튼스 정량화하도록 설계된 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics&quot;매크로를 사용할 필요가있다, 및 BRP와 공동 immunolabeled. 은 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics&quot;매크로는 다음과 같은 매개 변수를 정량화 : 활성 ZO의 튼스의 수, NMJ의 부통 지역, NMJ 길이, NMJ 긴 지점의 길이, 섬의 수, 지점 수, 분기 지점의 수와 수를NES (도 2). 매크로 3 서브 매크로 구성 : (I)는 &quot;스택 변환&quot;모든 가능한 이미지 파일을 식별하고, Z-hyperstacks 두 채널의 최대 강도 예측을 생성한다. 출력으로,이 매크로는 &quot;stack_image_name&quot;와 &quot;flatstack_image_name&quot;라고 시냅스 당 두 개의 새로운 파일을 생성합니다. II) &quot;ROI 정의&quot;를 연속하여 모두 최대 투영 화상 &quot;flatstack_image_name을&quot;수동으로 열어 관심의 특정 시냅스 단말이 존재하는 관심 (ROI)의 영역을 정의하는 요청들을 제공한다. 이것은 이미지 (11)에 존재할 수있는 인접한 근육 및 / 또는 (예를 들면 1 초 등) 시냅스 말단 다른 유형의 시냅스 연결의 배제를 허용하도록 구현 하였다. (III) &quot;분석&quot;완전히 ROI의 경계 내에서 이미지의 모든 지역에 분석을 자동으로 적용합니다. 같이모든 측정 수치가 주석 될 &quot;RESULTS.TXT&quot;및 매크로에 의해 생성 된 원본 영상 분할이 설명 될 것이다 &quot;res_image_name.tif&quot;이 단계의 결과, 사용자는 두 개의 새로운 파일을 구하는 것이다. NMJ 윤곽은 NMJ 골격과 BRP-양극 활성 영역의 수 : 화상 분석 중에 세 구조는 각각의 시냅스 말단으로부터 유도된다. NMJ 개요는 NMJ 영역과 경계를 결정하기 위해 사용되며, 후속 유역 분리 튼스의 수를 제공한다. 골격에서 다섯 개 NMJ 기능이 도출된다 : 총 NMJ 길이, 두 끝점을 연결하는 가장 긴 연속 경로의 길이의 합 (긴 가지 길이), NMJ 당 연결되지 않은 구획의 수를 ( &quot;섬&quot;이라 ), 브랜치 수 및 분기점 (하나 개의 분기점이 세 개 이상의 분기 접속)의 수. 활성 영역의 수를 카운트하여 BRP 채널의 판단BRP 양성 명소. (주석 NMJ 윤곽 (황색 선)은 NMJ 골격 (청색 라인) 및 (백색 병소로 표시) BRP-양극 활성 영역의 개수는 결과 영상에 표시되는 상기 파라미터의 측정은로 처리된다. TXT) 출력 파일 (도 3). 초파리 NMJ Morphometrics &quot;및&quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics 초파리 NMJ Morphometrics &quot;및&quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics &quot;&quot;제 설명 광범위 Nijhof 외. (17)에 의해 확인되었다.이 논문은 매크로를 사용 NMJ 형태를 분석하는 방법에 초점을 맞추고있다. &quot; 그럼에도 불구하고, 매크로를 이용한 분석에 앞서, NMJ 해부 및 immunostainings은 이러한 중요한 단계이다. 수행해야하고, 면역 조직 화학에 사용되는 마커의 조합은 매크로 분석에 적합 할 필요가있다. 이러한 단계를 간략하게 언급되어있는 SE이 프로토콜 ction 1, 이러한 절차를 실행하도록 상세히 설명 프로토콜을 참조로 사용자를 안내.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Immunostaining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Dilution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mouse anti-discs large 1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AFFN-DLG1-4D6</td><td>1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)</td></tr><tr><td>Rabbit anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson IR</td><td>323-005-021</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Synaptotagmin</td><td>Gift from Hugo Bellen</td><td></td><td>Jan-00</td></tr><tr><td>Mouse anti-Cysteine string protein</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>DCSP-1(ab49)</td><td>1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-Bruchpilot</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Jan-50</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td><td>Life technologies</td><td>A11029</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td><td>Life technologies</td><td>A11011</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Z25006</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope or fluorescence microscope</td><td>Leica SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Mac or Pc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two algorithms for high-throughput and multi-parametric quantification of drosophila neuromuscular junction morphology

시냅틱 형태는 시냅스 효능에 밀접하게 관련되어, 많은 경우에 형태 학적 시냅스 결함은 궁극적으로 시냅스 오작동을 초래할. 초파리 애벌레 신경 근육 접합부 (NMJ), 글루타메이트 시냅스에 대한 잘 확립 된 모델은 광범위하게 수십 년 동안 연구되어왔다. NMJ 형태 학적 결함을 일으키는 돌연변이의 식별 시냅스 개발 및 기능을 조절하는 유전자의 레퍼토리를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이들의 대부분은 초파리 NMJ의 형태 학적 이상을 감지하는 질적 접근 방식에 초점을 맞춘 대규모 연구에서 확인되었다. 질적 분석의 단점은 NMJ 형태에 기여 미묘한 플레이어 가능성이 주목 남아 있다는 것입니다. 정량 분석은 형태 학적 미묘한 차이를 검출하는 데 필요한 반면, 수고가 있기 때문에, 이러한 분석은 일반적으로 아직 수행되지 않는다. 이 프로토콜은 두 상세 이미지 분석 알고리즘의 설명 &quot;초파리 </em초파리 NMJ의 정량적 정확하고 객관적인 형태 학적 분석을 위해 피지 대응 매크로로서 사용할&gt; NMJ Morphometrics &quot;및&quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics &quot;이.이 방법은 일반적으로 사용되는 마커 immunolabeled NMJ 단자를 분석하기 위해 개발 굴림-1 . BRP는 또한, 같은 HRP CSP의 및 SYT를 다른 마커의 폭 넓은 응용 프로그램이 프로토콜에 표시되는 매크로는 구 개 형태 NMJ 기능을 평가할 수 있습니다. NMJ 지역, NMJ 주변, 튼스의 수, NMJ 길이를 NMJ 긴 지점 길이, 섬의 수, 지점의 수 및 분기점 NMJ 단말의 활성 영역의 수의 수.

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Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

두 이미지 분석 알고리즘, &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;및 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics&quot;가 자동 초파리 신경근 접합부 (NMJ)의 구 개 형태 적 특징을 정량화하기 위해 만들어졌다.

높은 처리량 및 다중 파라 메트릭 정량화를위한 ​​두 알고리즘<em&gt; 초파리</em&gt; 신경 근육 접합 형태학

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

two-algorithms-for-high-throughput-multi-parametric-quantification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

9.7K 조회수.  Radboud University Medical Center.  두 이미지 분석 알고리즘, "초파리 NMJ Morphometrics"및 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"가 자동 초파리 신경근 접합부 (NMJ)의 구 개 형태 적 특징을 정량화하기 위해 만들어졌다. 

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

연구

신경과학

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

생물학

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 뉴런 변성

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Observation Microtubule networks in Drosophila Neuromuscular junctions and muscle cells(초파리 신경근 접합부 및 근육 세포의 미세소관 네트워크 관찰)

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

저자 스포트라이트: Understanding Microtubule Network in Drosophila Neuromuscular Junctions 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

높은 처리량 및 다중 파라 메트릭 정량화를위한 두 알고리즘

요약

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이 비디오의 챕터

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

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