이 작품은 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회, 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 프로젝트 번호 30381)에서 CDCB에 존 R. 에반스 지도자 기금 연구 인프라 보조금, 그리고에 의해에서 CDCB에 발견 그랜트에 의해 지원되었다 NSERC에서 NJM에 발견 그랜트. ELL는 온타리오 대학원 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다. CDS는 NSERC에서 학부 학생 연구 조교에 의해 지원되었다. ALM은 NSERC에서 알렉산더 그레이엄 벨 (Alexander Graham Bell) 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다.

성인 여성 CD1 - 변형 마우스는이 연구에 사용되었다. 유사 염색은 다양한 연령층에서 남녀 모두를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험 동물은 원칙과 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침에 따라 마음에 든다고하고, 실험 프로토콜은 구 엘프 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었다. 1. 골지 - 콕스 염색 <ol><li> 두뇌의 골지 - 콕스 함침 <ol><li> 별도로 고품질 물로 칼륨 중크롬산 및 크롬산 칼륨을 용해시켜 1 %의 골지 - 콕스 용액 (w / v)의 중크롬산 칼륨 0.8 % (w / v)의 크롬산 칼륨 1 % (w / v)의 염화 수은 만들기 . 상기 혼합 용액을 염화 수은을 추가 등급 1 여과지를 이용하여 최종 용액을 필터. 최대 1 개월 어둠 속에서 솔루션을 저장합니다. </li><li> 5 %의 이소 플루 란을 사용하여 마우스를 마취. </li><li> 잘린 마우스를 안락사 빠르게 두뇌를 제거합니다. </li><li> 골지 - 콕스 용액 17 mL를 함유하는 20 ML 글래스 섬광 바이알로 뇌를 놓고 25 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다. </li><li> 24 시간 동안 4 ℃의 어두운 곳에서 (0.1 M 인산 완충액, pH가 7.4 / V) 슈 크로스 W (30 %) 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌 Cryoprotect. 주 : 다음 옵션 세 단계가 장기 저장이 단계에서 뇌를 고정하기 위해, 주요 프로토콜의 대안으로 사용될 수있다. </li><li> 드라이 아이스에 미리 냉각 된 200 ㎖의 이소 펜탄에 침지하여 뇌 전체를 고정. </li><li> -80 ℃에서 어둠 속에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 저장 동결 뇌 놓는다. </li><li> 준비가 진행하면, 24 시간 동안 4 ℃에서 어둠 속에서 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌를 해동. </li></ol></li><li> 뇌 단면 <ol><li> 자당 및 블록에서 뇌를 제거면도날을 사용하여 소뇌를 차단하고, 뇌의 나머지 꼬리 단부에 평탄한 가장자리를 남겨 절편 대 케이. </li><li> 열 한천 (3 % (w / v)의 물)가 용융 그것의 녹는 점보다 약간 때까지 식지 때까지. </li><li> 그 꼬리 끝면이 아래로 작은 일회용 무게 접시에 두뇌를 놓고 두뇌를 포함 용융 한천의 충분한 양을 추가합니다. </li><li> 한천은 고형화되면, 약 2 이탈 초과 한천 트림 - 뇌를 둘러싸고 4mm 및 에틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 사용하여 꼬리 단면 다운 가진에 vibratome의 스테이지 뇌 접착제. </li><li> 400, 슬라이스 두께 뇌 및 단면 뇌 다루 자당 동결 방지제의 충분한 양을 가진에 vibratome의 스테이지 영역 채움 - 86 Hz의 진동 주파수를 사용하여 (피검 뇌 영역에 따라) 500 ㎛ 또는 0.125 mm / s의 블레이드 발전 속도. </li><li> 작은 페인트 브러시를 사용하여상업적으로 이용 가능한 메쉬 바닥 인서트와를 함유하는 6- 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 위치 뇌 부분 미리 작성된 6 % 10 ㎖의 0.1 M 인산 완충액, pH를 7.4 (w / v)의 자당. </li><li> CO 4 ° / N의 어두운 부분을 부화. </li></ol></li><li> 뇌 섹션 개발 <ol><li> 메쉬 바닥 인서트를 사용하여 0.1 M 인산 완충액, pH 7.4의 웰에 2 %의 파라 포름 알데히드 5 ㎖ (/ V w) (PBD)를 포함하는 신규로 뇌 단면을 옮긴다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 저속으로 이동하는 로커 인큐베이션. </li><li> 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다. </li><li> 2.7 % (V / V) 수산화 암모늄을 함유하는 5 ㎖의 새로운 웰로 수수 부. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 느린 속도로 이동 로커에 부화. </li><li> 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 오 세척5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동 NA 로커. </li><li> 또한 정착액 (A)의 5 ㎖을 함유하는 신규로 수수 부 원래 구입 농도에서 물에 10 배 희석 한 것 (재료 표 참조). 25 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 느린 속도로 이동 로커에 부화. </li><li> 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다. </li></ol></li><li> 뇌 섹션을 장착 <ol><li> 작은 페인트 브러시를 사용하여, 현미경 슬라이드 위에 섹션을 탑재합니다. 여분의 물을 제거하고 핀셋과 작은 조직을 사용하여 한천. 모든 한천 탈수를 진행하기 전에 제거되었는지 확인합니다. </li><li> 약 45 분 (400 개 ㎛의 부분) 또는 90 분 (500 개 ㎛의 부분)을 실온에서 공기 건조시킨 부분을 허용한다. 주 : 건조시기 적절한 수준은 중요하고, 각 결정해야기관 주위 온도 및 습도 수준에 따라. 너무 짧은 건조 시간 이후 탈수 단계에서 슬라이드 탈락 섹션에 이르게, 너무 긴 건조 시간이 균열 부분에 연결됩니다. 섹션은 여전히 ​​건조의 적절한 수준에서 반짝 것으로 나타납니다. </li><li> 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 크레 실 바이올렛 염색 섹션. 참고 :이 옵션 단계는 크레 실 바이올렛 신경 세포 핵을 염색하기 위해, 동결 된 적이 섹션을 위해 사용될 수있다. 우리는 지우고 크레 실 바이올렛 부화하기 전에 섹션을 재수하는 경우에도 염색 및 섹션에서 저 배경에 이르게 것으로 나타났습니다. <ol><li> 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li><li> 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li><li> 물에이어서, 물에 95 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 물에이어서 50 % 에탄올. </li><li> 5 분 동안 물에 놓는다. </li><li> 0.5 %에서 발생 CRE (/ V w)7 분 동안 물 SYL 보라. </li><li> 2 분 동안 물에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li></ol></li><li> 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 부 탈수. <ol><li> 물 다음, 물 50 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 수중 후 95 % 에탄올. </li><li> 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li><li> 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다. 참고 :이 탈수 및 청소 시간이 원고에 설명 된대로 마우스의 뇌를 처리하기에 충분합니다. 그러나, 우리는 최종 청산 단계는 15 분 총까지 연장해야 할 수도, 쥐 cowbird을 포함한 다른 종에서 관찰했다. </li></ol></li><li> 무수 장착 매체를 이용하여 커버 슬립 구간. </li><li> 슬라이드는 적어도 5 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 수평으로 건조 할 수있다. </li></ol></li></ol> 두꺼운 뇌 섹션 내에서 2 이미징 스테인드 뉴런 <ol><li> 이미지 스택을 캡처 </강한&gt; <ol><li> 현미경 전구, 카메라, 무대 컨트롤러를 켭니다. </li><li> 현미경 소프트웨어 (예를 들어, Neurolucida)를 엽니 다. </li><li> 현미경 무대에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 예컨대 1.25 0.4 NA PlanAPO 또는 4X 0.16 NA로 저배율 대물 렌즈를 이용하여 뇌 단면의 2D 시야각 이미지를 캡처 <ol><li> 이미지 초점 및 노출 시간 및 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다. </li><li> 섹션의 아무 곳이나 왼쪽 버튼으로 클릭하여 기준점 만들기 </li><li> 이미지 획득 창에서 &quot;하나의 이미지를 획득&quot;을 선택하여 이미지를 캡처합니다. </li></ol></li><li> 10 배 NA 0.3 UPlan FL N 목적을 사용하여 관심의 뉴런 (들)를 함유하는 영역의 중간 해상도 이미지를 캡처 스택. <ol><li> 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다. </li><li> 섹션 A의 정상에 초점을 맞춤으로써 이미지 스택의 상단 및 하단 경계를 설정ND 선택 화상 획득 창에서 &quot;스택 상단 &#39;옆 다음 섹션의 바닥에 집중하고, 화상 획득 윈도우 내에 다음에&quot;바닥 스택 &quot;,&quot;설정 &quot;을 선택&quot;설정 &quot;. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 사이의 거리를&quot;다음 &quot;5 μm의&quot;을 입력하여 5 ㎛ 인 스텝 거리를 설정한다. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 획득 스택&quot;을 선택하여 이미지 캡처 스택. </li><li> 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 30 배 NA 1.05 실리콘 오일 액침 대물를 사용 관심 뉴런을 포함하는 영역의 높은 해상도 이미지를 캡처 스택. <ol><li> 대물과 OI과 접촉하도록 보장 슬라이드 침지 실리콘 오일 4 방울 슬라이드 위에 대물 배치 - 3 적용엘. </li><li> 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다. </li><li> 섹션 상단에 포커싱 &quot;설정&quot;을 선택하여 이미지 스택 상위 및 하위 경계를 설정 다음 다음 이미지 획득 창에서, 및 &quot;스택의 상단&quot;부분의 바닥에 집중하고 선택하는 「설정」 이미지 획득 창에서 &quot;스택의 하단에&quot;옆에. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 사이의 거리를&quot;다음에 &quot;1 ㎛&quot;을 입력하여 1 ㎛의 단계의 거리를 설정한다. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 획득 스택&quot;을 선택하여 이미지 캡처 스택. </li><li> 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 데이터 파일을 저장하고 외부 처리를 위해 TIFF 형식의 모든 이미지 파일을 저장합니다. </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> Z 프로젝션 이미지와 이미지 몽타주 만들기 <ol><li> ImageJ에있는 Z-투사 이미지 만들기 <ol><li> 바이오 형식 플러그인이 설치되어 열기 ImageJ에 소프트웨어. </li><li> &quot;플러그인&quot;을 선택 -&gt; &quot;바이오 형식&quot;-&gt; &quot;바이오 형식 가져 오기&quot;. </li><li> 이미지 스택 파일을 선택 열 수 있습니다. </li><li> &gt; &quot;유형&quot;- -&gt; &quot;RGB 색상&quot;파일이 열리면, &quot;이미지&quot;를 선택하여 RGB의 형식을 변경합니다. </li><li> &quot;이미지&quot;를 선택하여 Z 프로젝션 만들기 -&gt; &quot;스택&quot;-&gt; &quot;Z 프로젝트 ...&quot;. </li><li> TIFF 파일로 두 개의 차원 Z 프로젝션 이미지를 저장합니다. </li></ol></li><li> 관심의 전체 영역의 2 차원 이미지의 몽타주를 작성합니다. <ol><li> (예를 들어, 어도비 포토샵) 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> &quot;파일&quot;을 선택 -&gt; &quot;자동화&quot;-&gt; &quot;진 Photomerge를&quot;. </li><li> 선택 &quot;찾아보기&quot;및 모든 IMAG을 추가ES 파일을 병합 할 수 있습니다. </li><li> &quot;함께 이미지를 혼합&quot;을 선택하고 &quot;확인&quot;을 선택해야합니다. </li><li> TIFF 파일로 관심의 전체 영역의 결과 몽타주 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

우리는 두께 뇌 부분에서 신경을 시각화 여기 골지 - 콕스 염색 프로토콜이 유용한 변종과 함께 설명합니다. 대표 결과에 나타낸 바와 같이, 긴 800 μm의 작동 거리가있는 고해상도 목적의 사용은 500 μm의 절단 뇌 부분의 깊이에 걸쳐 전체 뉴런의 신뢰성 시각화 수 있습니다. 비교적 두꺼운 뇌 섹션의이 연구는 모든 유형의 스테인드 신경 세포가 완전히 길고 복잡한 꼭대기 수지상 나무와 피라미드 뉴런에 특히 중요하다 슬라이스에 포함되는 확률을 증가시킨다. 예를 들어, 설치류 뇌의 관상 부에, 이는 입쪽 또는 꼬리 방향으로 멀리 연장 뉴런의 포함을 가능하게하고, 절편 단계 정면 뇌 차단시에도 오차 자유도를 증가시킨다. 우리는,이 프로토콜은 다른 PL에 절편을 위해 적용 할 수있는 관상면에서 절편의 뇌를 설명하지만필요에 따라 anes 완전히 하나의 섹션 내에서 신경 세포를 표지 포함합니다. 고용 단면의 평면은 조사중인 신경 세포 인구의 형태 학적 특성에 따라 달라집니다. 돌기 쪽이 시각과 높은 배율의 대물 렌즈가 척추 입력 / 그림 2의 현미경 사진을 생성하는데 사용 된 60X 오일 액침 대물 같은 형태 평가해야하지만,이 프로토콜을 이용하여 정량화 될 수있다 : A3 - C3한다. 이 두꺼운 부분에서 이용 될 수 있지만 목적의 작동 거리 내에 슬라이스의 선두에 제한된다. 우리는 여분의 비특이적 염색 또는 배경으로 이어지는없이 표준 25 일 함침 기간이 완전히 마우스, 쥐 cowbird 뇌 전체에 신경을 얼룩 것을 발견으로이 프로토콜은 또한 유사한 뇌 크기의 다른 종에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다 그 한 달 이상 함침 기간 발생할 수 있습니다. 짧은 함침 기간이 s의 종 충분할 수있다말러 뇌 또는 개별 연구자에 의해 최적화 될 수있는 상기 언급 한 종으로부터 뇌 해부를 샘플한다. 이 얼룩 프로토콜 제시 한 세 가지 변종 중, 대조되지 않은 신선한 뇌 샘플을 사용하여 주요 프로토콜은 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 도 2의 현미경 사진이 기본 프로토콜 쉽게 상단과 탑재 두꺼운 부분의 아래쪽에 잘 볼 수 표지 수지상과 등뼈를 생성 함을 입증. 크레 실 바이올렛 Counterstain과를 추가하면 뇌 영역과 대뇌 피질 층의 정의를 용이하게하는 장점을 가지고 있지만, 두꺼운 부분으로 깊은 시각화하는 경우에도 확산 보라색 배경을 추가했습니다. 이 프로토콜의 변형 만 얼룩 때문에, 크레 실 바이올렛, 수지상 그들의 등뼈 장착 두꺼운 부분의 표면 부분의 저부 (도 2 B) 근처 명확하게 볼이었다. 이것은 또한 PRODU 보인다이전에 더 얇은 부분 19, 20, 21를 사용하는 경우에도,보고에 도시보다 두꺼운 부분의 표면 근방 Nissl 염색 선명한 패턴 CE. 동결 단계를 포함하는 프로토콜 변형 수지상 트리 형태의 분석을위한 수용 가능한 결과를 산출한다. 그러나, 배경 얼룩이 더욱 어렵게 시각화 수지상 쪽 (도 2 C)를 정량화하기 따라서 슬라이스로 촬상 깊이 때 가장 두드러 신선한 조직에서보다 훨씬 더 어둡다. 우리는 냉동되었던 뇌에서 섹션의 크레 실 바이올렛 Counterstain과 시도,이 그것이 매우 어려운 섹션의 하단 쪽을 시각화하고 정량화하기 위해 만든 짝수 어두운 보라색 배경 안개를 생성 (데이터가 표시되지 않음). 골지 - 콕스 수태하기 전에 마우스의 뇌를 동결 포함 평가했다 또 다른 실패 프로토콜 변형ATION. 이되어있을 수 신경교 세포 개체의 염색 결과이지만 뉴런 어떤 종류의 얼룩하지 않았다 (데이터 미기재). 성공적인 결과를 얻기위한 내용이 프로토콜에서 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 온도, 습도에 매우 의존적이기 때문에 (1)는, 각각의 실험실 내의 부분의 건조 시간을 확인하는 것이 중요하다. 건조 시간이 너무 짧은 경우, 섹션은 탈수 과정에서 슬라이드 떨어져 떨어질 것이다; 건조 시간이 너무 긴 경우, 섹션은 균열 것입니다. 이것은 심지어 같은 실험실과 계절에 따라 다를 수 있기 때문에 연구 조사를 예비 성형 직전에 &quot;테스트&quot;뇌의 세트로 건조 시간을 확인하는 것이 유리하다. (2) 모든 초과 한천은 탈수 단계 전에 섹션과 현미경 슬라이드에서 제거해야합니다. 이렇게하지 않으면, 한천은 변형되고 슬라이드 떨어져 섹션을 풀 수 있습니다. 조직 학적 또 다른 중요한 요소생물학적 시료의 분석 등의 조직 수축이다. 우리는 처리 후, 탈수 및 최종 섹션 두께 일본어 절단 값의 약 절반으로 감소 하였다 메인 골지 - 콕스 프로토콜 (도 4)을 이용하여 뇌 섹션 coverslipping 장착하였습니다. 또한 동결 단계를 포함하는 프로토콜의 변형을 이용하여 처리 섹션 메인 프로토콜 (도 4)를 통하여 처리 된 신선한 부분보다 상당히 두꺼운 하였다 참고. 두 프로토콜이 같은 cryoprotection 및 처리 단계를 포함하고, 단지 뇌의 실제 동결에 의해 차이가 있기 때문에 재미 있고 예상치 못한 양이었다. 따라서 서로 다른 연구 또는 다른 실험실에서 골지 - 콕스 염색을 사용하여 생성 된 신경 세포의 형태의 데이터를 비교할 때 프로토콜의 잠재적 인 차이를 고려하는 것이 중요합니다. 우리는 문학의 마지막 부분 두께에 대한 데이터를 찾을 수 없습니다했지만, 그것은 도움이 될 것입니다신경 세포 형태의 대책을보고 할 때 연구자들은 조직의 수축 및 / 또는 정확한 데이터를보고하기 위해. 또한, 500 ㎛의 절단 부분에 대한&gt; 200 ㎛의 최종 막 두께는 가장 높은 배율의 대물 렌즈의 작동 거리보다 클지라도, 이는 실험실에서 사용 30X 대물 렌즈의 작동 거리 내에도 여전히 있음을 주목해야한다. 덴 드라이트 및 등뼈 메인 골지 - 콕스 프로토콜을 이용하여 이들 분할 영역의 하단 분명히 볼 수 있기 때문에, 행 및 1mm의 범위를 포함한 더 큰 두께로 절단 섹션 내에 포함 된 신경 세포를 시각화시킬 수있다. 이 프로토콜은 하나의 섹션 내에서 긴 돌기 아버를 추적하는 기능을 포함하여 많은 장점을 제공하지만, 옵션이 슬라이스 함침 두뇌의 처리, 그리고 더 나은 뇌 구조를 식별하는 데 크레 실 바이올렛으로 대조하는 옵션을 지연, 몇 가지 단점이있다 그 할까요고려. 25 일간의 잠복기는 일부 연구자 너무 긴 고려 될 수있다. 깊은 장착 섹션으로 이미지 능력은 상대적으로 비싼 긴 작동 거리와 고해상도 침수 목표에 액세스 할 수에 따라 달라집니다. 또한, 고해상도의 미세 구조를 시각화 할 수있는 기능이 탑재 슬라이스의 아래쪽에 하나 개의 이미지로 감소한다. 이 프로토콜의 구현 때문에 공부하는 뉴런과 뇌 영역의 형태 학적 특성에 의존하며, 연구자가 사용할 수있는 장비. 우리는 이전과 같은 뇌와 관심의 영역의 크기에 대한 골지 - 콕스 함침 시간 등의 조사 연구를 실행하는 프로토콜 변수를 최적화 할 수있는 &quot;테스트&quot;샘플의 사용,에 돌기 아버에 대한 절편의 평면 및 두께를 추천합니다 시각화.

조직 샘플 내의 개별 뉴런의 시각화는 뇌에 대한 우리의 이해를 전진 크게하고이 내인성 질환이나 외생 적 환경 적 요인에 의해 영향을받을 수있는 방법 신경 세포의 형태 학적 특성의 현장에서 분석이 가능합니다. 골지 - 콕스 염색법은 뇌에서 뉴런의 무작위 샘플을 염색하는 비용 효율적인 상대적으로 단순한 방법이다. 먼저 1800 년대에 골지 (1)에 의해 개발 콕스 2에 의해 수정, 연구자들은 또한, 시각화 및 수지상 트리 형태와 척추 밀도 3, 4 모두 정량화하는 데 사용할 수있는 명확하고 잘 스테인드 뉴런을 생산하기 위해 수년에 걸쳐이 기술을 세련했다 5, 6, 7, 8, 9,. 뇌 섹션 내에서 스테인드 뉴런의 시각화를위한 주요 기술적 인 고려 사항은 가능한 고배율 / 고해상도 현미경 목표의 작동 거리에 의해 제한되는 최대 슬라이스 두께입니다. 60 공통 오일 침지 목표 - 100X는 뛰어난 해상도를 제공 범위하지만, 일반적으로 200 μm의보다 크지 않습니다 자신의 작업 거리에 의해 제한됩니다. 200 ㎛의 범위로 잘라 뇌 절편 대뇌 피질 (10),의 CA1 영역 11, 12, 피라미드 신경의 얕은 층에서의 예시적인 피라미드 신경이 슬라이스 두께 내에 포함될 수있는 소정의 신경 세포 유형을 시각화하기 적합 할 수 해마 (15)의 치아 이랑에서 해마 13, 14, 및 과립 세포. 상대적으로 이상과 뉴런이러한 뇌 전체 수지상 트리를 포함하는 완벽한 각도로 구분 될 필요가 있기 때문에 셀 본체 (16)에서 800 μm의를 확장 할 수 있습니다 마우스, 더 큰 도전을 제공하는 대뇌 피질의 깊은 층에서 피라미드 신경 세포로 수지상 나무, 200 개 μm의 슬라이스 내의. 수지상 또는 분기 중 입쪽 또는 꼬리 방향으로 연장되는 경우에도 실현 될 수 없다. 그것은 다수의 뇌에 인접 섹션에 걸쳐 신경을 추적하여 이러한 제약을 해결하는 것이 가능하지만,이 방식은 17 정확하게 추적하는 섹션을 정렬하는 데 중요한 기술적 도전을 소개한다. 더 실용적인 접근 방식은 더 큰 두께로 잘라 뇌 섹션에 포함 된 전체 뉴런을 시각화하는 것입니다. 골지 - 콕스 방법을 사용하여 마우스의 500 μm의 두께 뇌 부분, 그들의 개월을 시각화 - 우리는 여기에 (400) 내에서 신경 세포를 염색하는 기술을보고rphology 800 μm의 작동 거리를 갖는 고해상도 실리콘 오일 침지 목적을 사용. 우리가 설명하는 골지 - 콕스 함침 처리 프로토콜은 문헌 (6)에 가장 많이 인용 된 현대 프로토콜 중 하나에서 수정됩니다. 두꺼운 뇌 섹션 우리의 접근 방식은 완전히 섹션에 포함 된 모든 유형의 뉴런을 식별의 가능성을 증가시키는 장점을 제공한다. 기본 프로토콜뿐만 아니라, 또한 독특한 장점 제공 본 개의 변형 : 위해 장착 섹션의 표면 상 크레 실 바이올렛 Counterstain과 함께 (1) 골지 - 콕스 염색 뇌 영역의 경계를 정의하고, 레이어를 식별 할 단면 처리 및 최종 처리 이전에 함침 전체 뇌의 장기 저장을위한 중간 제빙 단계와 대뇌 피질, (2) - 골지 콕스 염색.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium dichromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P188-100</td>
			<td style="width:167px;">Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium chromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P220-100</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mercuric chloride</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">S25423</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Whatman grade 1 filter paper</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">1001-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">isoflurane</td>
			<td style="width:147px;">Pharmaceutical Partners of Canada</td>
			<td style="width:175px;">CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">20 mL scintillation vial</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">03-337-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Bioshop Canada</td>
			<td style="width:175px;">SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S5011-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S9390-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-565-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">isopentane</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AC126470010</td>
			<td>also known as 2-methylbutane. Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">agar</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A1296-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">small weigh dish</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">vibratome</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:175px;">VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">6 well tissue culture plates</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">08-772-1b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mesh bottom tissue culture inserts</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">07-200-214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:288px;">paraformadelhyde, 16%</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscope Sciences</td>
			<td style="width:175px;">15710-S</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">A669S-500</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Kodak Fixative A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">P7542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">superfrost plus slides</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">CitroSolv clearing agent</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">22-143-975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">anhydrous ethyl alcohol</td>
			<td style="width:147px;">Commercial Alcohols</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">cresyl violet</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">permount</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">upright microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">BX53 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">colour camera, 12 bit</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">DV-47d</td>
			<td style="width:167px;">QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:288px;">three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td>Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">4x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">4x 0.16 N.A. UplanSApo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">10x 0.3 N.A. UPlan FL N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">30x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">60x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">silicone immersion oil</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">Z-81114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Neurolucida software</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">Version 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:147px;">U. S. National Institutes of Health</td>
			<td style="width:175px;">Current version</td>
			<td>With the OME Bio-Formats plugin installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:147px;">Adobe</td>
			<td style="width:175px;">version CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neurons within thick brain sections using the golgi-cox method

신경 세포 염색의 골지 - 콕스 방법은 조직 학적 뇌 샘플 내에서 신경 세포의 형태에 대한 우리의 이해를 사전에 200 개 이상의 년 동안 사용되어왔다. 완전히 단일 구역 내에 포함 된 스테인드 뉴런을 식별하는 가능성을 증가시키기 위해, 가능한 한 최대 두께 뇌 부분을 제조 실용적인 관점에서 바람직하지만,이 방법은 높은 작업 거리만큼 기술적 인 관점에서 제한 -magnification 현미경 목표. 우리는 여기에 500 개 μm의 두께로 절단 마우스 뇌 섹션의 골지 - 콕스 방법을 사용하여 신경 세포를 염색하고, 고해상도 30 배 1.05 NA 실리콘 장착 직립 현미경을 사용하여이 부분의 깊이를 통해 뉴런을 시각화하기 위해 프로토콜을보고 800 μm의 작동 거리를 갖는 오일 액침 대물. 우리는 또한의 표면을 Counterstain과에 이용 될 수있다이 프로토콜의 두 가지 유용한 변종을보고크레 실 바이올렛 니슬 뇌 부분을 장착하기 전이나 절편 및 최종 처리에 장기 저장을위한 전체 뇌 동결. 주요 프로토콜과의 두 가지 변종은 전체 신경 세포의 수지상 나무와 수상 돌기 가시가 안정적으로 시각화 및 정량화 할 수있는 전체에 스테인드 두께 뇌 부분을 생산하고 있습니다.

500 μm의 두께 뇌 구역 -이 골지체 콕스 - 염색 프로토콜과 두 바와 선택적 변이체 (400) 내의 개별 뉴런을 시각화하는데 이용 될 수있다. 10 배의 대물 렌즈와 Z 축에서 5 ㎛의 단계를 사용하여 캡처 이차원 Z-돌기 대표 화상 몽타주는도 1에 도시된다 : A1 - 전방 피질 영역 (1)과를 포함하는 코로나 뇌 부분의 넓은 영역에 대한 C1 이차 운동 피질 (18). 섹션 500 μm의 절단했다. 도 1B1의 부분의 표면을 따라 피질 pial 레이어 1 본 크레 실 바이올렛 염색 프로토콜을 포함하는 변형, 예를 들어 피질 세포층의 식별이 가능합니다. 모든 신선한 조직 (그림 1A1)과 프로토콜의 변형을 사용하여 주요 프로토콜을 사용하는 경우도 스테인드 섹션의 유사한 모양을 참고하는뇌는 장기 저장 (그림 1C1)을위한 과정에서 부분적으로 동결된다. 고해상도 30X 1.05 NA 실리콘 오일 침지 목적의 사용은 따라서 주어진 화상을 적은 전체 스택을 요하는 X 커진 및 Y는 더 높은 배율의 대물 렌즈를 사용하여 캡처 비해 축 상 스택의 포착을 허용 관심 분야. 사용되는 특정 목적은 화상 두꺼운 뇌 섹션보다 충분 800 μm의 작동 거리를 가진다. 이차원 Z-돌기 이미지 몽타주는 전방 피질 영역 (1)의 내부에도 1 (A2-C2)에 도시되는 이러한 목적 및 Z 축에서 1 μm의 단계를 사용하여 캡쳐하고 트레이싱의 이차원 Z-돌기위한 C3 - A3 : 표시 뉴런은도 1에 도시된다. 스루 높은 해상도 뉴런의 시각화를 허용 이미지와 자신의 수상 돌기를 참고각 이미지 스택의 깊이. 크레 실 바이올렛를 사용하여 프로토콜의 변형은 파라미터가이 세포의 염색은 슬라이스의 상단 관찰 고용 그러나 함께, 슬라이스에 걸쳐 보라색 Nissl 염색을 추가합니다. 선택적 동결 단계를 포함하는 프로토콜 변형 그러나 그것은 또한 슬라이스의 표면 아래로 광을 회절에 의한 헤이즈의 모양을 생성하는 확산 배경 염색 도입 기본 프로토콜과 유사한 신경 세포 염색을 생성한다. 이 헤이즈 슬라이스로 촬상 깊이 때 가장 분명한도 1C2에 Z-투사 화상에서 명백하다. 30X 대물 렌즈를 이용하여 촬영 된 이미지들은 시각화 및 미세 돌기 쪽의 연결 구조를 정량화하는데 사용될 수있다. 단일 평면의 이미지 부분의 상단에 촬영 한 영상과 부 하단에서 촬영 한 화상과, 기본 프로토콜의 두 가지 변종을 사용하여 염색 수지상위한도 2에 도시되어있다. purpl 참고도 2B2의 부 하단으로서 확산 보라색 배경 / 산란광을 보이는도 2B1에 단면의 상단 개별 핵 내의 신경 Nissl 물질의 전자 크레 실 바이올렛 염색. 참고 또한 덴 드라이트 및 그 쪽이 동결 단계,도 2C2의 슬라이스 하단 명백한 더 어렵게 간의 대비를 제한하여 척추를 시각화 할 수 앞서 언급 한 배경 연무와 프로토콜을 사용하여 잘 염색되지만 그들과 인접한 배경. 높은 배율의 목표는 그림 2에서 쇼로, 돌기 척추의 형태를 특징 짓는 데에 이용 될 수있다 : A3 - C3 종류의 서로 다른의 쪽은 세 개의 각 프로토콜을 사용하여 스테인드 섹션에서 명확하게 볼 수있는 곳. 여기서, NA 1.42 60X 오일 액침 대물 사용 하였다. 우리는 또한 hippoc 내에서 신경 세포를 염색이 염색 프로토콜과 그 변종을 고용섹션 ampus 400 μm의 절단. 상기 섹션의 더 측방 영역 (예 : -도 3에 도시 된 바와 같이, 신경 세포 수지상과 등뼈는 섹션의 더 - 중간 영역 (C2 A2 예,도 3의 해마 치아 이랑 영역)를 향해 동시에 가시화 될 수있다 도 3에서 해마 CA3 영역 : A3 - C3). 또한, 각각의 염색 상태가 대뇌 피질도 1 및 2에 도시 된 것과 유사한 결과 장단점을 생성하는 것이 주목되어야한다. 뇌 처리 섹션의 최종 두께는 사용 된 특정 프로토콜 변형에 의존한다. 대뇌 피질을 포함하는 부분에 대해도 4a에 도시 500 μm의 절단으로 0.000 &lt;도 가공의 측정 두께 프로토콜 변형의 중요한 효과이고 / coverslipped 부 (일방향 ANOVA, P 마운트1). 여기서, 섹션의 두께 ((N = 6) 251.0 ± 12.5 (SEM) μm의) 및 크레 실 바이올렛 관련된 프로토콜 변이체 ((N = 6) 219.3 ± 8.5 μm의) 부분의 두께보다도 작았 기본 프로토콜을 사용하여 제조 동결 단계 (340.6 ± 17.1 μm의 (N = 6)) (페로 니 사후 시험 0.0006 ≤ 각 비교 P)를 포함하는 프로토콜의 변형을 사용 하였다. 프로토콜 변형 매우 유사한 효과 해마를 포함한 단면 관찰 및 400 ㎛의 (도 4B, 일방향 ANOVA, p &lt;0.0001)으로 절단 하였다. 여기서, 부분의 두께는 기본 프로토콜을 사용했다 (217.6 ± 19.2 μm의 (N = 6))과, 상기 프로토콜 변형 포함 크레 실 바이올렛 (198.0가 ± 14.8 μm의 (N = 6)) 부분의 두께보다도 작았 다 사용하여 제조 동결 단계 (313.5 ± 8.4 μm의 (N = 6)) (페로 니 사후 시험 0.001 ≤ 각 비교 P)를 포함하는 프로토콜의 변형. 도 1 앞쪽에 cingulate 영역에서 스테인드 뉴런의 예시 현미경 사진 (1) A1 - C1, 10 배 대물 렌즈를 사용하여 획득 된 화상 스택 병합 Z-돌기 전방 피질 영역 (1)과 2 차 코일을 갖는다 대뇌 피질의 한 반구 나타낸다 운동 피질 정수리 약 1.18 mm (18). 이 섹션은 500 μm의 절단했다. 현미경 사진 크레 실 바이올렛 염색 (B1)와 신선한 프로토콜 변형과 뇌는 골지체-콕스 함침 (C1) 아래 고정되는 프로토콜 변이체 메인 모든 새로운 프로토콜 (A1)를 사용하여 나타내었다. 스케일 바는 500 μm의 수 있습니다. 적색 제곱으로 나타낸 각 영역 C2 - 고해상도 Z는 프로젝션 이미지 A2에 도시되는 30X 실리콘 오일 액침 대물 렌즈를 사용하여 획득 된 스택을 병합A1의 현미경 사진에 uare - C1. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. 신경 트레이싱 차원의 Z-돌기 A3에 나타낸다 - C2 - A2의 현미경 사진에서 붉은 화살표로 표시된 뉴런 C3한다. 모든 수상 돌기의 직경은 설명의 편의를 위해 2 μm의 설정했다. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55358/55358fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55358/55358fig2.jpg" /> 도 2 스테인드 뉴런 돌기 쪽의 예시 현미경 사진. 30 배 실리콘 오일 액침 대물를 사용하여 캡처 현미경 사진이 섹션은 500 μm의 절단 된 전방 피질 영역 (1)의 제 1 층 내에 위치 신경 수지상 하나 개 초점면에 나타낸다. 뉴런은 F를 사용하여 염색 하였다<html> resh 프로토콜 (A1, A2), 크레 실 바이올렛 염색 (B1, B2)과 뇌는 골지체 콕스 - 함침 (C1, C2) 다음 동결되는 프로토콜에 대한 변형으로, 상기 프로토콜 변이체. 현미경 사진은 슬라이스의 상단 찍은 (A1 - C1) 및 다음 현미경 슬라이드 슬라이스 하단 (A2 - C2). A1-2, B1-2 및 C1-2에 대한 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다. 현미경 사진은 다른 척추 유형을 식별하기 위해, A3, 높은 배율 60X 오일 액침 대물를 사용하여 하나 개의 초점 평면 B3 및 C3에 나타낸다. A3, B3 및 C3에 대한 스케일 바 ~ 10㎛이다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55358/55358fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 55358 / 55358fig3.jpg &quot;/&gt; 도 3 해마 뉴런 스테인드 예시 현미경 사진. C1 (a 4X 목적을 사용하여 캡처 현미경 사진은 새로운 프로토콜 (A1), 크레 실 바이올렛 염색 (B1)와 상기 프로토콜의 변형을 이용하여 염색 뉴런 하나 개의 초점면에 도시되어 있으며, 상기 프로토콜 변이체되는 뇌 골지 - 콕스 함침 다음 동결 ). 섹션 400 μm의 절단 된 약 정수리 -2.18 mm 18에 도시된다. 스케일 바는 500 ㎛의 A1있다 - C1. 고배율 현미경이 30X 실리콘 오일 침지 목표로 촬영하고, 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 영역 내에 위치 수지상 뉴런 하나 개 초점면에 나타낸다 (A2 - C2) 및 해마의 CA3 영역 (A3 - C3). 스케일 바는 A2 50 μm의 아르 - C2및 A3 - C3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55358/55358fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55358/55358fig4.jpg" /> 장착 섹션 4. 두께 그림. 장착 부분의 측정 된 두께는 대략 대뇌 피질 정수리 1.18 mm (18)를 포함하는 부분에 대한에 도시 500 개 ㎛의 두께로 절단하고, 약 해마 정수리 -2.18 mm (18)를 포함하는 섹션의 B에서 400 μm의 절단 할 두께. 측정 섹션은 새로운 프로토콜, 크레 실 바이올렛 염색 프로토콜 변형, 또는 뇌는 골지 - 콕스 함침 다음 동결되는 프로토콜의 변형을 사용하여 염색 하였다. 모두 뇌 영역의 경우, 처리 프로토콜의 큰 영향이 있었다(일방향 ANOVA, p &lt;0.0001) 프로토콜을 통해 냉동 가공 방법이었다 뇌로부터 부분 냉동되지 않은 것보다 상당히 두꺼운 어디 (페로 니 사후 시험 모두 p &lt;0.001). 데이터는 각 그룹의 여섯 개 섹션의 평균 ± SEM으로서 도시되고, 다른 문자 데이터 세트는 큰 차이를 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55358/55358fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K 조회수.  University of Guelph.  우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다. 

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A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

연구

신경과학

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

망막 섹션 Morphometric 분석

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

골지 콕스 염색과 돌기​​ 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

경고, 헤드 억제 쥐의 하위 대뇌 피질의 뇌 구조 내에서 Juxtacellular 모니터링 및 현지화 단일의 뉴런

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

아 밀 로이드-β42 독성 그리고 Zebrafish 두뇌에서 Neurodegeneration 모델링

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential for recovery based on clinical assessments alone. The functional integrity of the corticospinal tract is an important prognostic biomarker for recovery of UL function, particularly for those with severe initial UL impairment. This article presents a protocol for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. This protocol can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve UL motor recovery and outcomes after stroke. The protocol also forms part of the PREP2 algorithm, which predicts UL function for individual patients 3 months poststroke. The algorithm sequentially combines a UL strength assessment, age, transcranial magnetic stimulation, and stroke severity, within a few days of the stroke. The benefits of using PREP2 in clinical practice are described elsewhere. This article focuses on the use of a UL strength assessment and transcranial magnetic stimulation to evaluate corticospinal tract function.

This protocol is for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. It can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve upper limb motor recovery and outcomes and in clinical practice for predicting upper limb functional outcomes 3 months after stroke.

뇌졸중 1 주일 이내에 코르티코 척수의 기능 상태 결정

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...