이 작품은 VKW에 NSERC (캐나다) 부여에 의해 투자되었다.

1. Splat 장치 설정 <ol><li> 온도 조절이 가능한 순환 수 욕조에 에틸렌 글리콜 (물 50 % v / v)을 채우십시오. 참고 : 녹색 자동차 용 에틸렌 글리콜을 사용할 수 있습니다. </li><li> 외부 챔버를 조립하려면 단열 플라스틱 튜브를 사용하여 수조를 이중벽 유리 그릇에 부착하십시오. 유리 그릇을 폴리스티렌 폼으로 절연시키고 플라스틱 페트리 접시 뚜껑으로 덮으십시오. 광원이 유리 챔버를 통해 볼 수 있도록 폴리스티렌 챔버의 바닥에 3-4 인치 구멍을 자르십시오. </li><li> 카메라 포트와 10X 안구 렌즈와 4X 편광 객관적인 렌즈가 장착되어 해부 현미경에 외부 챔버를 탑재하십시오. 외부 챔버 바닥에 편광 필름을 추가로 놓습니다. </li><li> 레토르트 스탠드 위에 1-1.5m 튜브 (직경 ~ 5cm)를 클램핑하고 레토르트 스탠드의 바닥에있는 튜브 아래에 위치한 냉각 블록과 함께 대형 폴리스티렌 컨테이너 안에 넣으십시오. </li></ol> 기본 단백질 2. 준비 IRI 분석을위한 추출 <ol><li> 낮은 조명 조건 (6 시간 광 / 18 시간 어둠)에 따라, 4 ° C에서 최대 1 주 동안 동결 내성 잔디 나 기타 동결 - 내성 식물 종, 저온 적응 식물 IBPS의 발현을 유도한다. 이것은 이미 낮은 온도 조건 및 적응 기간에 노출 된 현장에서 수집 된 샘플에 적용되지 않습니다. </li><li> 스템의 바닥에 절단 잎 조직의 대략 0.1 g을 수득 한 후, 1.5 ㎖의 튜브에 배치했다. 즉시 사용할 때까지 -80 ℃에서 액체 질소에 저장 샘플을 동결 플래시. </li><li> 세포 용균을 액체 질소하에 막자 사발을 사용하여 미세한 분말로 조직 샘플을 분쇄한다. 액체 질소는 균질화 과정에서 증발하지 않도록하십시오. </li><li> 즉시 얼음에 지상 샘플을 배치하고 액체 질소가 완전히 증발 할 수 있습니다. 네이티브 단백질 extracti의 1 ML을 추가합니다사용 직전에 첨가 두 EDTA 프리 프로테아제 억제제 정제와 10 mM의 트리스 -HCl, 25 mM의 염화나트륨 (PH 7.5) 완충액에 함유. 피펫 섞어; 소용돌이하지 않습니다. 참고 : 해물 이차 대사 산물 (토론 참조)이 포함 된 경우 추가 첨가제를 사용할 필요가있다. </li><li> 천천히 4 ℃에서 밤새 샘플 (18-24 시간)을 흔들어. 4 ℃에서의 나머지 단계를 실시한다. </li><li> 5 분 ~ 16,000 XG에 샘플을 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 세포 파편이 지속되면 추가로 5 분 동안 원심 분리하고 수용성 분획을 유지한다. 분명 샘플을 사용할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 경고등 분석 사전 실험 설정 <ol><li> 편광 필름 설정된 외부 챔버에 헥산 100 ㎖를 붓고 수분이 슬라이드 구축 방지 5-6 탈수 비드를 추가한다. 수조를 덮는 플레이트 진공 그리스를 소량 첨가하고 타이트한 밀봉을 보장하고, 헥산을 증발을 방지하기 위해 트위스트. </lI&gt; <li> 실험을 시작하기 전에 27 ° C 사이 및 31 ° C 프로그래밍 수조를 사용하여 약 2-3 시간 헥산 욕 쿨. 실험을 시작하기 전에 온도계 헥산의 온도를 확인해야합니다. </li><li> 바로 아래의 플라스틱 튜브 폴리스티렌 상자 냉각 블록을 넣고, 드라이 아이스와 완전히 실험 시작 40 분 전에 커버. </li><li> 분석을 시작하기 전에, 튜브 레벨인지 확인하십시오. 샘플이 떨어질 냉각 블록, 첫 번째 테스트에서 어디 물로 순서를 결정하고 (후술) 샘플 마커 삭제 위치를 표시한다. </li><li> 냉각 블록의 상단에서 드라이 아이스를 제거하고, 물로 결정된 강하 마크에 유리 현미경 슬라이드 커버를 배치했다. </li><li> 즉시 분석을 시작하기 전에, 광원 켜고 유리 챔버의 바닥에 형성 한 모든 얼음을 긁어. 얼음 결정하지 않는 한에 광원을 유지하지 마십시오헥산 가열 방지 가시화되고있다. </li></ol> 4. 플랫 분석을 실시 <ol><li> 종이 타월이 과잉 오일을 제거하여, 침지 오일 자동 피펫 (1-20 μL)에 부착 된 일회용 팁을 찍어. 이 단계는 샘플 가을보다는 피펫의 외부에 부착 할 수 있습니다. 참고 : 피펫에서 여분의 기름 제거 기름 방울이 시각화 어렵게 얼음 결정에 형성하지 않도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 직접 시료를 방출 전에 플라스틱 배관을 통해 표본 장소 피펫 피펫 10 μL. 샘플은 얼음 결정의 단일 층을 생성, 유리 커버 슬라이드를 칠 때 뚜렷한 &#39;플랫&#39;소리가되어야한다. </li><li> 신속하고 신중하게 편광 필름의 상단에 헥산 욕조에 핀셋과 장소를 사용하여 추위 블록에서 현미경 슬라이드를 제거합니다. </li><li> 현미경으로 보면,보기 및 광고 분야에 현미경 슬라이드를 넣어다만, 대물 렌즈가되도록 교차 편광 높은 콘트라스트 얼음 결정의 시각화를 허용한다. 40 배에 배율을 조정합니다. </li><li> 현미경에 카메라를 부착하고 얼음 결정의 명확한 시각화를 허용하고 이미지를 캡처하는 &quot;매크로&quot;로 설정을 조정합니다. 참고 : 1 시간까지 대기하는 얼음 결정이 명확한 그림을 제공 할 수 있습니다 성장 할 수 있도록합니다. </li><li> 반복 모든 샘플에 대한 4.1-4.5 단계를 반복합니다. 전형적으로, 헥산 챔버 내의 다른 샘플 6 개 슬라이드까지 게재. </li><li> 타이트 밀봉을 보장 광원을 끄고 헥산 욕 위에 플라스틱 판을 놓는다. (특정 분석에서 일관된 어닐링 기간 유지 12-24 시간)을 얼음 결정이 밤새 어닐링 할 수있다. 배양 후, 얼음 영화의 이미지를 캡처 전술 한 바와 같이. 참고 : 일부 샘플은 다른 사람보다 더 빠르게 재결정 할 수있다. 더 재결정 12 시간 후에 명확하지 않는 경우 24 시간까지없는 recrystalli되도록하는 결정이 어닐링 허용zation가 발생합니다. </li></ol> 5. 경고등 분석 데이터 분석 <ol><li> 컴퓨터에 사진을 업로드하고 직접 전 열처리 후 얼음 결정의 크기를 비교합니다. IRI없이 활동이없는 샘플들이 눈에 띄게 더 큰 얼음 결정을 형성하는 반면 재결정 얼음 재결정 활성을 갖는 샘플은 증가하지 않을 것이다. 빛 간섭은 큰 얼음 결정은 약간 다른 색상으로 표시되므로 쉽게 볼 수있다 할 것입니다. </li></ol> 6. 얼음 친화력 정화 장비 설치 <ol><li> 에틸렌 글리콜 온도 프로그래밍 순환 수조를 채운다. 녹색 자동차 에틸렌 글리콜을 사용할 수있다. </li><li> 절연 플라스틱 튜브 (15)를 사용하여 중공, 황동 프로브에 목욕을 연결합니다. </li><li> 150 ㎖의 비이커에 snuggly 들어갈 수있는 폴리스티렌 용기를 구축. 황동 차가운 손가락의 중심에 구멍 용기의 뚜껑을 만듭니다. </li></ol> 7.아이스 친화 정제를위한 시료의 준비 <ol><li> 콜드 적응의 식물 조직은 2.1 절에 설명. </li><li> 20 개 ㎖ 튜브에 접지 매스 (단계 2.3)의 ~ 100-150 g의 수집 즉시 동결 플래시. 샘플은 사용하기 전에 -80 ° C로 유지 될 수있다. </li><li> 2.3-2.5 부분에서 설명한 바와 같이 시료를 준비한다. 잎 조직의 부유를 들면 : 1 비율 (천연 단백질 추출 완충액 용액 mg의 조직 :) 1을 사용한다. 내인성 단백질 분해 효소에 의해 IBPS의 저하를 방지하기 위해 추가 프로테아제 억제제 정제를 사용합니다. 주 : 2 또는 1 : 3 (mg의 조직 : 천연 단백질 추출 완충액 ㎖) 조직 샘플이 지나치게 집중하면 1 비율을 조정한다. </li><li> 세포 파편을 제거하고, 무명천 2 층, 3 회 통하여 분해물 체. 4 ℃에서 40 분 동안 30,000 XG에서 원심 분리하여 파편 펠렛. </li><li> 천연 단백질 추출 완충액을 사용하여 120 mL의 행 샘플의 부피를 증가시킨다. 얼음 친화 정제 즉시에 해물을 사용하여얼음 바인딩 활동의 손실을 피할 수 있습니다. </li></ol> 8. 실시 얼음 화성 정제 <ol><li> 정제하기 전에, -0.04 ° C / H의 속도 C -3 ° -0.5 ° C로 냉각 프로그래머블 수조 세트. 참고 : 냉각 속도는 샘플의 초기 볼륨에 따라 조정할 수 있습니다. </li><li> -0.5 ° C로 얼음 손가락을 냉각시키고,이어서 초기 증류 물을 함유하는 50 ㎖ 튜브로를 잠수하다. 손가락에 형성하는 얼음의 얇은 층을 얼음 핵화를 촉진 할 수 있도록 약간의 얼음 칩을 추가한다. 이 프로세스는 일반적으로 20 내지 30 분 걸린다. 참고 : 얼음 코팅 손가락에 어떤 덩어리 전에 샘플 배치에 장갑을 낀 손으로 부드럽게해야한다. 빙 층은 -0.5 ° C에서 형성되지 않는 경우, -0.75 ° C의 온도를 낮추. </li><li> 자기 교반기 위에 폴리스티렌 용기에 작은 자기 교반 막대를 함유하는 150 ML 글래스 비이커에 넣어 샘플. 얼음 손가락이 있는지 확인중심 및 액체 시료에 적어도 반쯤 낮췄다. 용기를 밀봉합니다. </li><li> 24 시간마다 확인, 프로그램은 약 2 일 동안 실행할 수 있습니다. 샘플의 50 %가 동결되면, 프로그램을 중지합니다. 얼음 반구 IBPS 혼입 &quot;얼음 - 에칭&quot;을 초래할 것이다. 참고 : 정화 실험은 프로그램이 실행이 적절하게 조정하는 시간의 길이와 큰 샘플 볼륨을 사용하여 수행 할 수 있습니다. </li><li> 39 ° C에 프로브를 얼음 반구 가온 제거하기 위해, 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 증류수로 반구 린스 한 후 4 ℃에서 해동. 주 : 대부분 IBPS은 물 및 적절한 버퍼에 안정하지 않은 (즉, 50 mM 트리스 - 염산은 pH가 8의 50 mM 중탄산 암모늄 pH를 8) 해동 과정에서 주기적으로 첨가해야한다 (약 1 ㎖ / 2 시간) . 얼음 반구를 알루미늄 호일로 래핑하고, 종래 해동 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li><li> 얼음 반구가 여전히 포함되어있는 경우의 안료, 또는 샘플 정화 증가를 반복 8.1-8.5 2 ~ 3 번 단계를 반복합니다. 참고 : IBP의 농도가 낮은 정화의 여러 라운드를 다음 수 있지만, 순도 정제 된 샘플은 MS를 이용하여 분석 될 경우 얻을 수보다 더 가치가있다. 충분한 재료를 사용할 수있는 경우, 얼음 친화력 정화의 3 라운드 권장합니다. </li></ol> IBPS 9. 확인 <ol><li> IBPS가 얼음의 융해 반구 다음 다량 함유되어 있기 때문에, 샘플을 농축시킨다. 작은 단백질의 손실을 방지하기 위해 3000 다 분자량 컷오프 농도 원심 튜브를 사용 ~ 1-3 mL의 조직 ~ 100g을 함유하는 샘플을 농축시킨다. </li><li> MS에 대한 샘플을 보내기 전에 같은 BCA 또는 브래드 포드 분석으로 단백질 정량 분석법을 이용하여 단백질 농도를 결정한다. 예로서 SDS-PAGE 겔 전기 영동에 의해 시료의 순도를 추정한다. SE 이전 IRI 활동에 대한 정제 된 단백질을 테스트MS에 대해 웍하면 활성 단백질을 정제 및 농축 단계로 유지되어 있는지 확인한다. </li><li> 질량 분광 분석 (10) 직접 농축 된 시료를 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256 (2000).</li><li>Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+and+ice+nucleator+proteins+in+terrestrial+arthropods.">Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods.</a> Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).</li><li>Davies, P. L., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+fish+antifreeze+proteins.">Biochemistry of fish antifreeze proteins.</a> FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).</li><li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria.">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).</li><li>Yeh, Y., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins:+structures+and+mechanisms+of+function.">Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function.</a> Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).</li><li>Smolin, N., Daggett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+ice-like+water+structure+on+the+surface+of+an+antifreeze+protein.">Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).</li><li>Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-rich+antifreeze+proteins+from+snow+fleas.">Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas.</a> Science. 310 (5747), 461 (2005).</li><li>Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+in+the+Antarctic+springtail,+Gressittacantha+terranova.">Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova.</a> J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).</li><li>Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+expand+the+repertoire+of+protein+structures+that+bind+ice.">Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).</li><li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+a+Bacterial+Antifreeze+Protein+as+an+Adhesin+with+Ice-Binding+Activity.">Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity.</a> PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).</li><li>Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+antifreeze+protein+in+a+fish.">Hyperactive antifreeze protein in a fish.</a> Nature. 429 (6988), 153 (2004).</li><li>Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+antifreeze+activity+of+carrot+antifreeze+protein+and+its+mutants.">Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants.</a> Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).</li><li>Gupta, R., Dreswal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+stress+modulated+secretome+analysis+and+purification+of+antifreeze+protein+from+Hippophae+rhamnoides,+a+Himalayan+wonder+plant.">Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant.</a> Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).</li><li>Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+antifreeze+proteins+by+adsorption+to+ice.">Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice.</a> Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ice-binding+proteins+from+higher+plants.">Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants.</a> Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).</li><li>Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+confer+freezing+tolerance+in+transgenic+Arabidopsis+thaliana.">Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.</a> Plant Biotechnol. J. , (2016).</li><li>Olijve, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+rapid+ice+crystal+growth+through+nonbasal+plane+adsorption+of+antifreeze+proteins.">Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).</li><li>Zakharov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+Recrystallization+in+a+Solution+of+a+Cryoprotector+and+Its+inhibition+by+a+Protein:+Synchrotron+X-Ray+Diffraction+Study.">Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study.</a> J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).</li><li>Capicciotti, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+ice+recrystallization+inhibitors+enable+freezing+of+human+red+blood+cells+with+reduced+glycerol+concentrations.">Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations.</a> Sci. Rep. 5, 9692 (2015).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li><li>Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiourea:+the+antioxidant+of+choice+for+the+purification+of+proteins+from+phenol+rich+plant+tissues.">Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues.</a> Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).</li><li>Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-shell+purification+of+ice-binding+proteins.">Ice-shell purification of ice-binding proteins.</a> Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).</li><li>Basu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+ice-binding+planes+of+antifreeze+proteins+by+fluorescence-based+ice+plane+affinity.">Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity.</a> J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).</li><li>Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+a+cold+stress+associated+gene+family+in+cold+tolerant+grasses.">Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses.</a> BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).</li><li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein.">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

IBPS의 성공적인 분석 및 정제를 들어,이 단백질의 일부의 온도에 민감한 특성을 이해하는 것이 중요합니다. 특정 식물 IBPS는 전개, 침전 및 활동의 결과로, 0 ° C 이상의 온도에서 불안정해질. IBPS 활성을 얻기 위해서는 식물은 냉장실 (~ 4 ° C)에서 처리되고, 샘플은 실험하는 동안 얼음에서 유지되는 것이 종종 중요하다. 전체 셀 원유 해물을 사용하여 내생 단백질 분해 효소에 의한 단백질의 분해가있을 때 또 다른 요인은 고려해야합니다. 식물에서 IBPS의 표현은 일반적으로 낮고, 따라서 단백질 수율 손실은 향후 실험 또는 분석을위한 불충분 한 물질이 발생할 수 있습니다. 신뢰할 수있는 프로테아제 억제제 칵테일의 추가와 함께, 단백질 추출하는 동안 신속하게 작업 단백질의 손실을 줄일 수 있습니다. 또한,이 추위에 적응 기간이 실험실 성장의 IBPS의 가장 큰 축적에 최적화하는 것이 중요합니다식물. IBPS 작업 또 다른 일반적인 문제는 분석의 대부분은 온도와 습도에 민감하다는 것이다. IRI 분석에 관해서, 현미경 커버 슬라이드에 수분 축적 얼음 결정의 시각화 어렵게 얼음 층이 발생할 수 있습니다. 제습기를 사용하여 여분의 탈수 비즈는 이러한 어려움을 해결할 수 있습니다; 그러나, 기관의 상대 습도가 70 % 이상으로 할 때,이 시험이 수행되지 않는다는 것을 권장한다. 플랫 분석법은 제시된 질적이다. 분석 전에 희석 시리즈를 수행함으로써, IRI 끝점은 IBPS 더이상 얼음의 결정 성장을 제한 할 수있는 농도 범위를 판정하도록 수립 될 수있다. 다양한 Labs는 얼음 결정 입자 (18)의 평균 크기를 측정하기 위해 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하였다. 앞서 설명한 바와 같이, IRI 활성을 테스트하는 동안 효율적인 초기 화면의 확인은 결합 얼음TH 활성 수준을 결정함으로써, 직접 얼음 결정 (16)의 흡착 IBPS 시각화에 의해 확립한다. IRI 분석의 두드러진 제한은 여러 비 IBP 분자 모방 IRI 그 활성을 확인 된 점이다. 이러한 분자는 대형 단백질 페놀 배당체, 및 폴리 비닐 알콜 19, 20, 21 등의 합성 중합체를 포함 할 수있다. 그 결과, 버퍼 컨트롤은 항상 오염 물질이나 첨가제가 관찰 된 IRI 활동을 초래하지 않도록하기 위해 샘플을 실행해야합니다. 얼음 화성 정제를 용이하게 수행하는 동안 정확하게 수행하지 않을 때, 다른 단백질, 용질과 대사가 우세 할 수있다. 중요한 고려 사항은 얼음 결정 성장의 속도입니다; 냉각 속도를 낮추어 (예 : -0.02 ° C / H에), 아이스 반구보다 천천히 얼음 비 - 결합 성장 molecu레 얼음 결정 격자에 혼입 될 가능성이 적은. 오염 분자의 존재는 또한 분해물의 50 %가 반구 혼입되는 것을 보장함으로써 방지 될 수있다 (즉, 50:50, 얼음 비 액체). 이전에 언급 한 바와 같이, 얼음 친화력의 여러 라운드는 얼음 부분을 명확히하고 높은 순도의 샘플이 발생할 수 있습니다. 특히, 이차 대사 산물은 종종 식물 생물과 비 생물 적 스트레스 조건 하에서 과잉 생산된다. 어두운 갈색 안료 1.5 % (v / v)의 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP) 및 1.5 % polyvinylpolypyrrolidone를 유지하는 경우 페놀 풍부한 식물 조직의 정제 동안 (W / V) (PVPP) 추출 완충액에 첨가 할 수 있고, 이차 중화 대사 산물. 이러한 티오 우레아 (5-10 mM)을 항산화 첨가제도 21 19 사용될 수있다. 관심 IBP에 대한 정보는 같은 고압 리튬 등의 추가 정제 단계를 알고있는 경우파운드 크로마토 그래피 (HPLC)를 사용할 수도있다. 얼음 화성 정제 변형이 고려 될 수 있으며, 단백질 생산량을 최적화하고 빠른 얼음 쉘 정제 (23)와, 형광 기반 얼음 평면 선호도 (FIPA) (24)를 포함 IBP 특성에 추가 통찰력을 얻기 위해보고되었다. 최적의 경우, 전술 한 기술들은 IBPS의 식별을위한 정제 된 단백질 풀을 생성 할 수있다; 그러나, 다른 매우 풍부한 단백질의 비특이적 결합이 불가피 할 수있다. 때문에 다른 유기체에서 IBPS 사이의 높은 다양성에 포아풀 아과의 가족 공유의 상 동성 (25)에서 IBPS, 혼자 서열 유사성에 의해 IBP를 식별하기 위해 일반적으로 수는 없지만. IBPS의 일반적인 특징은 트레오닌, 세린, 발린 및 26 포함 얼음에 결합하는 것으로 알려진 아미노산의 존재이고; 펩티드를 식별하는 제 풍부 서열시퀀스 데이터 마이닝 때 ESE 잔기가 유용 할 수있다.

ICP (Ice-binding proteins)는 식물 1 , 곤충 2 , 어류 3 , 미생물 4 등 여러 유기체에서 발견 된 다양한 보호 단백질 군입니다. 이 단백질의 핵심 특징은 얼음 결정에 특이하고 효율적으로 흡착되어 성장을 수정하는 독특한 능력입니다. IBP는 몇 가지 문서화 된 성질을 가지고 있는데, 가장 잘 특징 지어지는 두 가지는 열 히스테리시스 (TH)와 얼음 재결정 억제 (IRI)입니다. TH 활성은 동결 - 내성이없는 동물에서 생산 된 IBP에서보다 쉽게 ​​관찰된다. 이 활동으로 인해 동결을 방지하기 위해 유기체의 순환 또는 간질 유체의 응고점이 낮아집니다. 대조적으로, 영하의 온도에서 필연적으로 동결 될 동결 내성 유기체에서, IBPs는 TH 활성이 낮게 나타난다. 낮은 TH 활동에도 불구하고, 얼음 울기를 제한하는 높은 IRI 활동STAL 성장은 종종 이러한 단백질과 관찰된다. 동결 내성 미생물의 경우,이 IRI의 활동은 아마도 세포 외 구획 얼음의 조절되지 않는 성장 세포를 보호하는 데 도움이됩니다. 은 &quot;매트리스 버튼&quot;모델 IBPS 얼음 결정 (5)의 성장을 방지하는 메커니즘을 설명하는 데 사용될 수있다. 이 모델에서는 IBPS 특히 물 분자에만 결합 IBPS 사이의 공간에 성장 얼음 결정 격자로 통합 할 수 있도록 간격으로 얼음 결정 표면에 흡착. 이 부가 물 분자의 결합이 불리하게 곡률, 깁스 - 톰슨 효과 (6)에 의해 설명 될 수있는 이벤트를 생성한다. 앵커 포접 물 가설 얼음 결정 표면에 IBPS의 특이 적 결합을위한 메커니즘을 제공 됨으로써 REO에 특이 단백질 결합 부위 얼음에 위치 대전 잔기의 존재는 결과물 분자가 얼음 결정 격자의 하나 이상의 평면과 일치하도록한다. TH 활성은 IBP의 존재하에 단일 빙 결정의 용융 및 응고 온도의 차이를 측정함으로써 정량화 될 수있다. TH 활성은 IBP의 활성을 평가하는 널리 받아 들여지는 방법이지만, 식물 IBP에 의해 생성되는 낮은 TH 갭 (일반적으로 단지 일부 정도)은 일반적으로 높은 단백질 농도, 특수 장비 및 조작자 경험을 필요로한다. 비 IBP는 얼음 결정 성장을 제한 할 수 있지만 모든 IBP가 공유하는 특성이므로 IRI 활동에 대한 테스트는 IBP의 존재에 대한 효과적인 초기 화면, 특히 TH 활동이 낮은 사람들을위한 효과적인 초기 화면입니다. 이 활동을 테스트하는 데 사용되는 방법론은 &#39;splat assay&#39;로 알려져 있으며, 단백질 샘플을 얼음으로 얼려서 작은 얼음 결정의 단일 층을 생성하고 일정 기간 동안 관찰하여얼음 결정 성장이 제한됩니다. IBPS 존재하는 소스 조직 샘플을 스크리닝하는데 사용하는 다른 방법과는 달리,이 기술은 10-100 ng의 범위의 낮은 단백질 농도에 적용 가능하다 쉽게 제작 된 장비를 이용하여, 신속하고 간편하게 해석 데이터를 생성한다. 그러나, 상기 분석은 TH 결정 얼음 결정 형성 와야 IBPS위한 초기 화면을 제공하는 것을 강조하는 것이 중요하다. 천연 단백질의 분리는 종종 관심의 단백질의 구조적, 생화학 적 특성에 관한 정보를 필요로 도전하고있다. 아이스 IBPS의 친화 정제 목적을 위해 기판으로서 아이스를 사용하여 이러한 단백질의 격리를 허용한다. 분자의 대부분이 얼음 결정 성장, 고도로 정제 된 샘플의 IBP 샘플 결과의 존재 하에서 얼음 반구 저성장 큰 quantit없는 동안에 앞서 빙수 경계 가압되므로단백질 및 용질을 오염 IES. 이 방법은 곤충, 8, 9, 10, 11 박테리아, 식물 및 어류 12 13 14 IBPS를 식별하는데 사용되었다. 또한,이 방법을 통해 달성 IBP - 풍부 분획은 또한 하류 생화학 적 분석에 이용 될 수있다. 이 논문은 IBPS 유도 추출 통해 식물 IBPS의 식별을 설명, IRI 활동 분석은 단백질의 존재 및 얼음 친 화성 정제를 사용하여 단백질의 분리를 확인한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1117">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL microcentrifugetubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td style="width:631px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adjustable lab jack</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S63080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Desaga MC2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brass probe</td>
			<td style="width:152px;">Custom built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera/ camera port</td>
			<td style="width:152px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:152px;">Purewipe/Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-665-25A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentration tubes (0.5 mL)</td>
			<td style="width:152px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentration tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:152px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cooling block</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13259</td>
			<td>Use a metal heating block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:152px;">Whirlpool</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dessciation beads</td>
			<td style="width:152px;">t.h.e. Dessicant/VWR</td>
			<td style="width:119px;">EM-DX0017-2</td>
			<td>6-8 mesh size; 100% indicating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:152px;">Olympus Tokyo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double walled glass bowl</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purchase from local lab glassware supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry ice</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Use local supplier; hazardous&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA-protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Roche cOmplete mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hexane</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">296090</td>
			<td>Anhydrous, 95%; hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JA10/20 centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Large plastic petri dish</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Use local supplier; hazardous&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:152px;">Hanna Instruments</td>
			<td style="width:119px;">HI190M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover slides</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic tube</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purchase PVC pipe from local hardware store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polarized film</td>
			<td style="width:152px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene foam</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Can be constructed from polystyrene shipping boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poreclain mortar and pestle</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVPP</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">77627</td>
			<td>110 &#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retort Stand</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small stir bar</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-513-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-programmable water bath</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13271-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vacuum grease</td>
			<td style="width:152px;">Dow Corning/Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinyl tubing</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plant ice-binding proteins through assessment of ice-recrystallization inhibition and isolation using ice-affinity purification

얼음 - 결합 단백질 (IBPS)이 영하의 온도에 노출 특정 미생물에 의해 합성되어 스트레스 - 유도 단백질의 패밀리에 속한다. 세포 외 얼음 결정이 성장하면 식물에서 동결 손상은 세포막 가능한 세포 죽음의 파열의 결과로 발생합니다. 얼음 결정으로 IBPS의 흡착되어 세포 손상을 감소 얼음 재결정 억제 (IRI)으로 알려진 공정에 의해 상기 성장을 제한한다. IBPS은 평형 융점 이하 용액, 열 이력 (TH) 활성 알려진 속성의 빙점을 누를 수있는 능력을 입증한다. 이러한 보호 특성으로 인해, 산업, 의료 및 농업 분야에서 자신의 잠재적 인 사용에 새로운 IBPS의 식별에 대한 관심을 제기했다. 이 논문은 1 내지 IBPS 공장의 식별) 유도 추출 IBPS의 식물 조직에서, 2) IRI 활성에 대한 스크리닝 추출물, 3)을 정제 및 분리를 설명IBPS의 가스화. 낮은 온도에 노출하여 IBPS 유도 후, 추출물을 표준 광학 현미경을 이용하여 얼음 결정 성장을 관찰 할 수있는 &#39;플랫 분석&#39;을 이용 IRI 활성에 대해 시험된다. 이 분석은 낮은 단백질 농도가 필요하며 빠르게 수득 쉽게 얼음 결합 활성의 초기 화면을 제공하고, 해석 결과를 생성한다. IBPS이어서 &#39;얼음 화성 정제&#39;이라는 기술을 통해 얼음을 흡착 IBPS의 속성을 이용하여 단백질을 오염으로부터 격리 될 수있다. 식물 추출물에서 수집 한 세포 용 해물을 사용하여, 얼음 반구 천천히 황동 프로브에 성장시킬 수있다. 이는 다결정 얼음의 결정 구조에 IBPS를 통합합니다. 아니오 IBP의 선험적 생화학 적 또는 구조적 기술을 요구하는이 방법은 단백질의 활성 회복을 허용한다. 아이스 정제 단백질 분획 격려의 식별을 포함하여 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다질량 분석 및 천연 단백질의 생화학 적 분석에 의한 조수 시퀀스.

셋업의 편의를 위해, 그림 1과 도 2는 각각 IRI 분석 얼음 화성 정제에 사용되는 장비의 시각적 표현을 포함한다. IBPS와없이 겨자 식물로부터 수집 된 추출물을 사용 IRI 분석 결과는도 3에 도시된다. 이러한 결과는 동결 허용되지 겨자 잡초에서 수집 추출물이 때문에 IBPS 존재의 부족으로 얼음 결정 성장을 제한 할 수 없습니다 것을 보여준다. 대조적으로, 작은 아이스 결정은 트랜스 제닉 식물은 실질적 얼음의 결정 성장을 제한 다년생 라이 그래스로부터 IBPS을 함유하는 볼. 도 4는 정제의 두 라운드 후에 IBPS 표현 다년생 라이 그라스 추출물을 이용하여 성장 된 얼음 반구를 나타낸다. 정제의 첫번째 라운드 고차 후 hemisphe 얼음 에칭표면 IBPS 얼음에 흡착하여 얼음 결정 (도 4a)의 성장을 변성 한 것을 나타낸다 재. 도 4b에 도시 된 정제의 두 번째 라운드는 오염 분자의 일부가 제외되었음을 나타내는 명확 얼음을 갖는다. 반구 표면 상에 얼음 - 에칭 IBPS 여전히 존재 함을 나타낸다. 도 5는 다년생 라이 그래스 수집 단백질 얼음 화성 정제에 후속하는 SDS-PAGE를 나타내며,이어서 실버 염색으로 염색. 수많은 단백질을 얼음에 흡착 가장 풍부한 단백질에 대응 일곱 개 뚜렷한 밴드로 확인되었다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55302/55302fig1.jpg" /> 도 1 : 플랫 장치 (16)의 개략도. 장비 우리를<html> 얼음 결정 (A)의 단층의 생성에 얼음의 결정 성장 (B)의 시각화를위한 ED. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55302/55302fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55302/55302fig2.jpg" /> 도 2 : 16 IBPS 얼음 화성 정제에 사용되는 장치. 프로그램 가능한 에틸렌 글리콜 조에 부착 황동 &quot;얼음 손가락&quot;천천히 얼음 - 반구를 성장하는 데 사용된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55302/55302fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> g3.jpg &quot;/&gt; 도 3 : IRI 분석 17을 사용하여 얻은 대표 데이터. 식물 추출물을 사용하여 형성되는 얼음 결정의 단일 층은 40 배 배율로 가시화된다. IBPS (-IBPs)를 포함하지 않는 야생형 애기 장대 추출물은 라이 그래스의 perenne (+ IBPS)에서 IBPS을 표현 형질 전환 A. 장대의 추출물에 비교 하였다. ° C, 얼음 결정은 버퍼 야생형 A. thaliana의 샘플에서 재결정했다 -4 18 시간의 배양 기간에 따라. 반면에 얼음의 결정 성장은 IBP를 발현 A. 장대 추출물 제한 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55302/55302fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55302/55302fig4.jpg" /><br/&gt; 그림 4 : 동결에 강한 잔디, L.의 perenne에서 수집 IBP 추출물을 사용하여 얼음 반구 성장. 잔디 추출물을 얼음 화성 정제 한 라운드를 실시시킨 후, 얼음 반구의 표면 얼음 에칭 IBPS (A)의 성공적인 도입을 나타낸다. 추가 용질, 안료 및 오염 단백질을 제거하고, 얼음 화성의 두 번째 라운드를 명확 얼음 반구 (B)의 결과를 사용 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55302/55302fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55302/55302fig5.jpg" /> 그림 5 : 다년생 라이 그래스에서 기본 IBPS의 정화를 모니터링. 얼음 화성 정제 원심 농도 두 차례에 따라,천연 잔디 추출물은 변성 폴리 아크릴 아마이드 젤 (SDS-PAGE)에 전기 영동 한 후 실버 얼룩을 사용하여 시각되었습니다. 레인 1 : 분자량 단백질 사다리; 레인 2 : 원액 추출물; 레인 3-5 : 2, 1 : 5, 1:10 (샘플 : 물)의 비율 전에 1 겔 로딩을 물에 희석 한 샘플. 특정 식물 종 IBPS들을 포함하기 때문에, 관찰 된 여러 밴드들이 상이한 IBP 이성체에 대응할 수있다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55302/55302fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification at JoVE.com

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

이 논문은 얼음 재결정 억제 활성과 얼음 화성 정제를 사용하여 원시 IBPS의 후속 분리의 평가를 통해 동결 내성 식물 얼음 - 결합 단백질의 동정을 설명합니다.

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

identification-plant-ice-binding-proteins-through-assessment-ice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.6K 조회수.  Queen's University.  이 논문은 얼음 재결정 억제 활성과 얼음 화성 정제를 사용하여 원시 IBPS의 후속 분리의 평가를 통해 동결 내성 식물 얼음 - 결합 단백질의 동정을 설명합니다. 

비디오: Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

연구

생화학

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The identification and characterization of these biomolecules can improve knowledge about their secretion pathways and help to manipulate them. Furthermore, some of these biomolecules are also interesting in terms of biotechnological applications. Described here are two protocols for easy and rapid isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins. The method for isolation of released carbohydrate polymers is based on conventional precipitation techniques of polysaccharides in aqueous solutions using organic solvents. This method preserves the characteristics of the polymer and simultaneously avoids the presence of contaminants from cell debris and culture medium. At the end of the process, the lyophilized polymer is ready to be used or characterized or can be subjected to further rounds of purification, depending on the final intended use. Regarding the isolation of the cyanobacterial exoproteome, the technique is based on the concentration of the cell-free medium after removal of the major contaminants by centrifugation and filtration. This strategy allows for reliable isolation of proteins that reach the extracellular milieu via membrane transporters or outer membrane vesicles. These proteins can be subsequently identified using standard mass spectrometry techniques. The protocols presented here can be applied not only to a wide range of cyanobacteria, but also to other bacterial strains. Furthermore, these procedures can be easily tailored according to the final use of the products, purity degree required, and bacterial strain.

Here, protocols for the isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and isolation of their exoproteomes are described. Both procedures embody key steps to obtain polymers or proteins with high purity degrees that can be used for further analysis or applications. They can also be easily adapted according to specific user needs.

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...