우리는 박사에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 이전 연구와 리비 Fairless 및 Shiyuan 리우의 연결 복원에 대한 도움말의 일환으로 준비 조직을 사용할 수 있도록하기위한 에드 캘러웨이와 마티 Usrey. 그리고 화이트 홀 재단 :이 작품은 NIH (EY018683 NEI)에 의해 투자되었다.

<ol>
	<li>Cajal, S. R. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , (1911).</li><li>Seung, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+functional+connectomics.">Toward functional connectomics.</a> Nature. 471, 170-172 (2011).</li><li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses.">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li><li>Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+neuronal+tracing+with+a+deletion-mutant+rabies+virus.">Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus.</a> Nature Methods. 4, 47-49 (2007).</li><li>Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. 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A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized,+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus.">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rabies+virus+varients+for+monitoring+and+manipulating+activity+and+gene+expression+in+defined+neural+circuits.">New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits.</a> Neuron. 71, 617-631 (2011).</li><li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+with+glycoprotein-deleted+rabies+viruses.">Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses.</a> Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).</li><li>Nhan, H. L., Callaway, E. 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저자는 공개 아무것도 없어.

신경 해부학 연구는 신경 과학 및 connectomics 및 구조 - 기능 관계에서 최근 관심의 기둥이 선택적 신경 인구의 상세한 형태 학적 특성에 대한 열정을 갱신했다 남아있다. 전통적으로, 신경 해부학 적 연구는 전문가 neuroanatomists에 의해 정의 된 신경 세포의 형태 학적으로 별개의 클래스로 신경 질적 분류에 의존하고있다. 신경 세포를 복원 및 형태 학적 데이터를 추출하는 기술의 진보에 의해,이 공평하게 뚜렷한 형태 학적 신경 클래스 분류 정교한 정량적 데이터 분석 방법을 활용하는 것이 가능하다. 본 연구에서는 단계별 방법 1에 설명되어있다) 바이러스 - 매개 역행 레이블링 방법을 이용하여 각각의 신경 세포를 선택적으로 라벨링 수백; 2) 개별 뉴런의 체계적 재구성 수백은 내 신경 세포의 포괄적 따라서 대표 샘플을 형성한다<html> 선택적 인구; 3) 독립 클러스터링 형태 메트릭에 기초하여 선택 뉴런 집단 내에 최적의 클러스터를 결정하기 위해 통계적으로 분석 평가. 이러한 분석 방법은 TRN 뉴런 기존 데이터 세트에 다른 클러스터링의 방법을 적용하여 검증 우리는 TRN 뉴런 최적 세 형태 학적으로 구별 개체군 클러스터 된 세 개의 분리 된 평가 방법에 기초하여 보여준다. 이 연구에서 설명 된 프로토콜의 가장 큰 장점은 유연성이다. G-삭제 광견병 바이러스는 대상 구조로 주입 다음 역행 레이블 뉴런의 수백 EGFP 발현을 유도하는 효과가있다. 같은 광견병 바이러스 균주는, 짧은 꼬리 원숭이 (개정에서 하세 &amp; 브릭스) 원숭이 5, 9, 흰 족제비, 및 설치류 (7)를 포함한 여러 종의 유사 효과&quot;&gt; 8. 따라서, 변형 된 광견병 바이러스는 선택적으로 표적 구조물에 주입 다음 뉴런의 어느 모집단의 완전한 수지상 arborization 패턴 라벨을 이용할 수있다. DAB / 과산화 반응시켰다 GFP에 대한 항체 염색이 영구적으로 염색이 발생하기 때문에 권장 뉴런을 표시합니다. 그러나, 다른 염색 방법을 사용할 수 있습니다 및 / 또는 형광을 직접 측정하는 원하는 경우. 장점을 시각화 할 수있는 조직 섹션 (이상 노출 형광 표지를 표백) 형광 현미경의 도움없이 현미경으로 시각화 할 수 있습니다 원시 형광 다른 형광 분자의 발현을 구동 다른 바이러스 뉴런 여러 대상 뇌 구조 돌출 여부를 결정하기 위해, 예를 들어 결합 될 수 있다는 것이다. 또한, 상기 설명 된 단계 (예 축삭 및 수상 돌기위한) 모든 이용 가능한 형태의 데이터에 적용될 수있다 점점 더 강력한 모토를 활성화뉴런의 논리적 분류. 또한 광견병 바이러스 소량 또한 돌기에 더하여 축삭 복원 유리할 수 성긴 역행 라벨을 생성하기 위해 주입 될 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 본 연구에 제시된 분석 방법의 또 다른 장점은 상이한 클러스터링 접근법들이 이용되고 비교 될 수 있다는 것이다. 클러스터 분석의 각 단계에서 다른 옵션은 클러스터를 생성하기 위해 간 신경 세포 매개 변수 공간에서 거리뿐만 아니라 다른 알고리즘을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 여러 평가 방법을 사용할 수 있습니다. 수단 최적의 클러스터링을 확인으로 대표 결과 섹션에 설명 된대로 후자는 특히 유용합니다. 의심 할 여지없이, 클러스터를 생성하고 필드 앞으로 이동하면서 사용할 수있게됩니다 최적의 클러스터링을 평가하기위한 추가 알고리즘. 함께, 이러한 분석 방법은 impro 계속신경 해부학 분야의 정량 방법을 발견했습니다과의 견고성을 향상시킨다. 개별 레이블 뉴런의 때문에별로 손 복원은 시간이 소요된다 훈련과 경험을 필요로하며, 여전히 다소 주관적 신경 복원의 자동화에 관심이 증가하고있다. 컴퓨터 기반의 자동 연결을 복원 여전히 오류가 발생하기 쉬운 때문에, 전자 현미경 기반의 신경 해부학 적 데이터는 여전히 (예 17 참조) 사람들에 의해 분석된다. 그러나, 자동화 된 신경 재구성 가까운 미래에 제공 될 가능성이 높다. 자동 신경 재구성 따라서 클러스터링 분석하고 필드는 기술적 발전을 계속하는 여기에 설명 된 평가 방법은 더 중요해질 것이며, 데이터 분석 끝에 더 조사를 필요로한다.

신경 해부학은 &quot;connectomics&quot;에서 신경 과학 (1) 최근 관심의 기초 중 하나가 신경 인구의 형태 학적 다양성과 특정 뉴런 (2) 사이의 연결을 이해하기위한 열정을 갱신했다입니다. 라벨링 방법 및 재구성 신경 세포는 크게 유전 및 바이러스 매개 회로 추적 등을 포함하여 혁신과 개선의 연결 인구 5의보다 포괄적 인 형태 설문 조사를 수 있도록, 3, 4에 접근한다. 개별 뉴런 라벨의 개선 이외에, 정량 데이터 분석 기술들은 그 데이터 형태 5, 6에 기초하여 별개의 개체군으로 뉴런의 독립적 인 편향 구분 가능 나왔다. 이러한 편견 기술은 더 traditiona의시 개선된다한 세기 넘게 분야에서 표준이되어왔다 L 질적 분류 방법. 이 연구의 목표는, 개요 단계별하는 것입니다, 선택적 인구 내에서 신경 세포의 바이러스 매개 라벨의 조합이하는 이러한 신경 세포의 포괄적 인 샘플 및 정량 데이터 분석의 대규모 복원은 독립적 인 클러스터링을 기반으로 통계 평가. 이러한 방법을 결합함으로써, 우리는 선택적 신경 인구 내에서 포괄적 인 샘플링과 형태 학적으로 독특한 신경 종류의 편견 분류를 용이하게하기 위해 수집 및 신경 해부학 데이터의 분석을 향한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이러한 방법의 예를 들어, 우리는 짧은 꼬리 원숭이의 시상 망상 핵 (TRN)의 단일 섹터 내에서 뉴런의 대규모 인구의 분석에 대해 설명합니다. 이 자료는 이전 연구 7에서 있습니다. 선택적 지느러미 latera에 돌출 TRN 뉴런을 라벨에 대한 방법EGFP 4, 8 인코딩 수정 광견병 바이러스의 수술 주입을 사용하여 시상 (dLGN)의 리터의 geniculate 핵이 설명되어 있습니다 (특정 자재 / 장비, 행 2의 표 참조). 이 변형 광견병 바이러스는 유전자 필수적인 코트 단백질을 코딩하는 바이러스 트랜스 - 시냅스 움직임을 제거 없다. 바이러스 주사 부위 엑손 단자 입사되면, 감염된 신경 5, 9, 10의 전체에 걸쳐 수상 arborization EGFP 발현을 구동하는 중요한 이점 전통적인 역행 트레이서처럼 작용한다. 따라서,이 G-삭제 광견병 바이러스는 선택적으로 감염 및 사출과 역행 전송 다음 모든 신경 인구 라벨을 사용할 수있다. 특정 신경 세포 집단의 포괄적 분석을 수행하기 위해, 샘플은 중요인구 내에서 뉴런의 광범위한 분포. 바이러스 - 매개 표지 기술은 완전한 세포를 생성하기 때문에, &quot;골지체 형상은&quot;바이러스 주사 부위 축삭 많은 뉴런 채우고, 그 뇌 구조의 전체 범위 내에서 신경 세포의 매우 큰 샘플을 재구성 할 수있다. 개질 광견병 바이러스 감염과 뉴런의 다수의 라벨에 있으므로 효과적이기 때문에 또한, 동물 당 수백 뉴런을 재구성 할 수있다. dLGN 투 TRN 뉴런의 광범위한 샘플을 생성하기 위해 TRN (11)의 영상 분야에 걸쳐 160 뉴런 샘플링 절차가 설명된다. 현미경, 카메라, 및 재구성 소프트웨어를 포함하는 신경 복원 시스템을 이용하여 각각의 신경 세포를 복원하는 과정을 설명한다. 또한 설명합니다 (TRN 내의이 경우) 뇌 구조 내의 개별 뉴런의 위치를 ​​결정하는 바이러스 주입 윗몸을 확인하는 방법이다체적 형상 복원을 사용합니다 (dLGN 내의 이러한 경우) 구조 내에서 전자 볼륨 및 위치. 각 신경 세포를 측정 형태 측정이 설명되어 있습니다에 형태 학적 데이터를 내보낼 독립적 인 클러스터를 수행하는 단계는 기반 분석. 클러스터링 방법에 제한이 있습니다 가능한 다른 클러스터링 알고리즘의 다양한도 있습니다. 따라서, 이러한 옵션과 더 일반적으로 사용되는 알고리즘의 몇 가지의 장점이 설명되어 있습니다. 클러스터 분석 클러스터의 고유성의 통계적 검증을 제공하지 않습니다. 따라서, 추가 단계가 최적의 클러스터뿐만 아니라 내부 및 클러스터에 걸쳐 형태 데이터 사이의 관계를 확인하기 위해 설명된다. 그 TRN 뉴런을 확인하기 위해 TRN 데이터 세트에 대한 클러스터를 평가하기위한 통계 방법이 설명되어 있습니다 (10) 독립적 인 형태 학적 지표에 따라 세 가지 고유 한 클러스터로 그룹화됩니다. 따라서, 선택적으로 표시하는 단계를 요약하여, 재구성, 특정 신경 세포 집단에서 형태 학적 자료를 분석, 우리는 인구 내에서 신경 세포 사이의 형태 학적 차이를 정량화하는 방법을 설명합니다. 짧은 꼬리 원숭이 원숭이 TRN의 시각적 부문 내에서 서로 다른 신경 세포 유형의 선행 연구 결과는 별도의 통계적인 평가 방법으로 확인된다. 함께, 우리는 이러한 기술은 신경 해부학 데이터 세트에 광범위하게 적용 할 수 뇌를 통해 신경 인구의 다양성의 정량적 분류를 확립 도움이되기를 바랍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="818">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">SAD&#916;G-EGFP</td>
			<td style="width:171px;">E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Recording electrode: platinum/iridium or tungsten</td>
			<td style="width:171px;">FHC</td>
			<td style="width:133px;">UEPSGGSE1N2M</td>
			<td style="width:281px;">Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:233px;">Nanoject II</td>
			<td style="width:171px;">Drummod Scientific</td>
			<td style="width:133px;">3-000-204, 110V</td>
			<td style="width:281px;">Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:233px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:233px;">DAB</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">D5905-50TAB</td>
			<td style="width:281px;">3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:233px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">C2037-100MG</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:233px;">Catalase</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldich</td>
			<td style="width:133px;">C9322-5G</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies/Thermo Fisher</td>
			<td style="width:133px;">#A-11122&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:233px;">Biotinylated goat anti-rabbit</td>
			<td style="width:171px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:133px;">#BA-1000</td>
			<td style="width:281px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Neurolucida System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">MicroBrightField</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:233px;">Neurolucida Explorer</td>
			<td style="width:171px;">MicroBrightField</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Data export software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Microfire Camera&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Optronics</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Nikon E800 Microscope</td>
			<td style="width:171px;">Nikon Instruments Inc.</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Matlab</td>
			<td style="width:171px;">The MathWorks Inc.&#160;</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Microsoft Office Excel</td>
			<td style="width:171px;">Microsoft</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Spreadsheet program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale reconstructions and independent, unbiased clustering based on morphological metrics to classify neurons in selective populations

이 프로토콜은 독립적 바이어스 클러스터링의 사용과 결합 된 신경 세포의 대규모 복원이 선택적 신경 세포 집단 중에서 관찰 학적 특성의 광범위한 조사를 만들 분석 요약. 이러한 기술들의 조합은 신경 해부학 정보의 수집 및 분석을위한 새로운 방법을 구성한다. 함께, 이러한 기술은 대규모을 활성화하고 선택적 신경 인구 때문에보다 포괄적 인 샘플링 및 인구 내에서 형태 학적으로 독특한 신경 클래스를 설명하는 편견 양적 방법을 설정합니다. 이 프로토콜은 선택적으로 신경 세포에 라벨을 수정 광견병 바이러스의 사용을 설명합니다. 관심의 대상 뇌 구조로 정위 주입 다음 역행 추적 등의 광견병 바이러스의 역할을 G는-삭제 및 신경 세포에서 EGFP의 전달과 표현을위한 수단으로 역할을합니다. 뉴런의 많은 수는이를 사용하여 감염기술과 개별 뉴런의 &quot;골지 같은&quot;전체 채우기를 생산, 자신의 수상 돌기에 걸쳐 GFP를 표현한다. 따라서, 바이러스 매개 역행 추적 방법은 완전한 세포 칠을 생성함으로써 기존의 염료 계 역행 추적 기술을 개선시킨다. 연구중인 뇌 영역의 모든 영역에 걸쳐 개별 잘 격리 뉴런은 신경 세포의 대표적인 샘플을 획득하기 위해 재 선정된다. 이 프로토콜은 세포 기관을 재구성하고 여러 조직 섹션에 걸쳐 표시 신경 세포의 수지상 arborization 패턴을 완료하는 절차를 설명합니다. 뇌 구조 내의 각 뉴런의 위치를 ​​포함하여 형태 학적 데이터, 추가 분석을 위해 추출된다. 표준 프로그래밍 함수는 독립 클러스터 분석 학적 지표에 기초하여 클러스터 평가를 수행하는 데에 이용 하였다. 클러스터 분석 PERFO의 이러한 분석의 유틸리티, 통계적 평가를 확인하려면원숭이 원숭이의 시상 (TRN)의 시상 망상 핵에 재건 (160) 뉴런에 rmed가되었다. 원래 클러스터 분석하고 여기에 수행 통계적 평가는 모두 TRN 뉴런 세 소집단, 독특한 형태 학적 특성을 각각으로 분리되어 있음을 나타냅니다.

우리는 선택적 모집단 내의 뉴런의 대규모 복원이 dLGN (5)에 변형 광견병 바이러스의 가능한 다음 주입 이전임을 보여 주었다. 최근, 동일 조직은 TRN 시각적 섹터 (160)의 뉴런을 재구성하기 위해 이용 하였다 (브래그 등, 리뷰].도 2A-B) 상술 한 상세한 방법 론적 단계에 따라. TRN 연구에서 TRN 뉴런의 세 가지 고유의 클러스터는 독립적 10 형태 메트릭 클러스터 분석에 기초하여 확인되었다 : 세포체 구역, 세포체 진원도의 TRN 내의 TRN 등쪽 - 복부 위치의 중심 내측 측방 상대적인 위치 , 수지상 나무, 노드에 평균 수지상 거리, 제 3의 평균 길이 및 고차 수상 돌기, 1 일 주문 수상 돌기의 평균 각도, 총 수지상 arborization의 평균 위상 각과에의 각도 편차의 수탈 수지상 arborization. TRN 뉴런은 등가 적으로 이러한 세 클러스터 (도 2c)에 분산시켰다. 세 개의 클러스터의 신경 세포에 걸쳐 10 개의 형태 학적 측정의 별도의 통계 비교는 원래 클러스터 분석에 포함 된 형태 측정의 모든하지만 두 클러스터에서 통계적으로 유의 한 차이를 얻었다. 따라서, 클러스터 분석 (도 2C) 및 클러스터에 걸쳐 통계 학적 별도의 통계 비교로부터 생성 된 계층 적 트리 dendrogram은에 기초 TRN 뉴런 독특한 세 그룹으로 분류된다. 본 연구에서는 특별히 별도 클러스터 분석을 결정 클러스터를 평가하는 통계적 방법을 적용하고 싶었다. 이전 연구에서 TRN 데이터 세트 관찰 세 개의 클러스터가 최적이었다 여부를 결정하기 위해 평가 하였다. 별도의 추가 클러스터, 즉 PCA와 GMM CLUS 분석에 들어가기는 종래 클러스터링 방법 (도 1)를 검증하기 위해 수행되었다. 세 가지 주요 성과는 별도로 전에 클러스터 분석을 확인합니다. 원래 클러스터 분석 방법은 클러스터를 생성하기 위해 &#39;링크&#39;기능을 지정하는 &quot;evalclusters &#39;기능을 이용하여 평가했을 때 먼저 클러스터의 최적 개수는 계층 적 트리 dendrogram은 (도 2c)에 기초하여 원래의 결론과 일치하는 3이었다. 둘째, PCA는 통계 학적 기여도에 기초 뉴런 그룹핑의 다른 수단으로서 160 TRN 뉴런 10 형태 메트릭 원래의 데이터 행렬에 행 하였다. 세는 GMM에 TRN 뉴런이 1, 2 또는 3 개의 고유 한 클러스터로 그룹화 가정하에 생성되었다. 음의 로그 우도 (NLL)과 아카 이케 정보 기준 (AIC)는 가장 낮은 나왔고, 따라서 대부분의 정보, 값 및 GMM은 (Figur을 TRN 형태의 데이터를 설명하기 위해 3 클러스터를 사용하는 경우 두 값은 최적이었다예 3). 셋째, GMM 기반 클러스터링 별도로 계층 트리 dendrogram은 3. 따라서 관측 세 클러스터 PCA 및 GMM-로 분리 뉴런 걸쳐 형태 메트릭 통계적 비교는 &#39;evalclusters&#39;기능 클러스터의 최적의 수를 사용 하였다 평가 기반 클러스터링하고 각 클러스터 법 (결합 및 GMM)의 별도의 평가는 모두 TRN 뉴런 최적 활용 10 형태 메트릭에 기초하여 3 클러스터로 분리하는 것과 같은 결과를 얻었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55133/55133fig1.jpg" /> 그림 1 : 데이터 형식. 클러스터 분석을 포함하는 독립 변수의 수에 대응하는 뉴런 m = 5 열의 수에 대응하는 n 개의 행의 예는 데이터 매트릭스 (데이터 매트릭스에 헤더를 포함하지 않는다). 그림 2 : 160 TRN 뉴런의 독립 클러스터링. 시토크롬 산화 효소 활동 스테인드 A. 왼쪽, 하나 동물의 dLGN을 통해 하나의 코로나 부분의 사진, dLGN 층을 시각화하고 GFP에 대해 바이러스 주사를 시각화 할 수 있습니다. 화살표는 고밀도 역행 표시 TRN 뉴런의 영역을 나타냅니다. 제 방향은 아래의 지느러미 - 복부 중간 - 측면 / (DV / ML) 나침반을 다음과 스케일 바는 A의 모든 패널 500 μm의를 나타냅니다. 왼쪽에서 두 번째, 윤곽은 바이러스 주입 (검정 윤곽선)를 포함하는 모든 부분에 대한 dLGN (적색)과 TRN (적갈색)의 설명합니다. 노란색 별은 주사 부위 센터를 나타냅니다. A의 같은 방향 및 규모 바. A의 같은 윤곽과 주사 부위, 방향 및 스케일 바의 왼쪽 3 차원 렌더링에서 세 번째. 오른쪽, 위치지도 재구성의<html> TRN 신경 세포, 색으로 구분 하나의 집계 TRN 윤곽 (적갈색) 내에서 클러스터 할당 (C)에 따라. A의 같은 방향 및 규모 바. B. TRN 내에서 내측 - 외측 위치에 따라 냉각하는 따뜻한 색깔의 5 재구성 TRN 신경 세포와 TRN (검정) 및 (회색) dLGN의 왼쪽, 총 윤곽. A의 DV / ML 나침반에 따라 방향은, 스케일 바는 500 μm의를 나타냅니다. 오른쪽, 색상 일치 스케일 바의 같은 5 TRN 뉴런의 사진은 100 μm의를 나타내는. C. 10 독립적 인 형태 측정을 기반으로 160 재구성 TRN 뉴런 사이의 연결 거리를 보여주는 클러스터 분석 다음 계층 트리 dendrogram은. 세 개의 클러스터, 녹색, 파란색과 빨간색으로 보여줍니다. 이 그림의 모든 부분은 브래그 등에 포함 된 그림에서 적응하고 있습니다. (리뷰).여윈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55133/55133fig3.jpg" /> 그림 3 : 클러스터 평가. 두 개의 다른 기준 값을 플롯 마이너스 로그 우도 (적색 NLL) 및 아카 이케 정보 기준 1, 2 또는 3 개의 클러스터를 가정 GMM에 세에서 생성 (AIC, 블루). (3) 클러스터와 GMM에 최저 기준 값을 제공한다. 기업 코드 파일 : 예제 코드, matlab에 호환 언어로 작성된은, PCA와 GMM이 접근 방식을 사용하여 클러스터 평가 다음에 예를 들어 데이터 행렬에 클러스터 분석을 수행 할 수 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55133/Briggs&amp;BraggSupplementaryCodeFile.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

이 프로토콜은 수정 된 광견병 바이러스가 형광 마커를 표현, 독립, 편견 클러스터가 서로 다른 신경 세포의 서브 클래스 간의 형태 학적 통계의 종합적인 특성을 사용하는 것이 분석과 역 행성 감염 다음 레이블이 선택적 신경 인구의 대규모 복원에 대해 설명합니다.

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

large-scale-reconstructions-independent-unbiased-clustering-based-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.9K 조회수.  Geisel School of Medicine at Dartmouth.  이 프로토콜은 수정 된 광견병 바이러스가 형광 마커를 표현, 독립, 편견 클러스터가 서로 다른 신경 세포의 서브 클래스 간의 형태 학적 통계의 종합적인 특성을 사용하는 것이 분석과 역 행성 감염 다음 레이블이 선택적 신경 인구의 대규모 복원에 대해 설명합니다. 

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

연구

신경과학

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Anesthetized 쥐의 실리콘 프로브와 함께 대규모의 연결 Ensembles 녹음하기

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

횡격막 모터 뉴런에 의해 다이어프램 신경 분포의 기능 및 형태 학적 평가

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.