나는 생체내 세포 기록하고 세포내 얼룩 기술의 초기 개발에 도움을 브라운과 데이비드 맥스웰의 초기 교육 앤서니 테일러 감사합니다. 나는 collocalization 매크로에 대한 도움말 M. 실버 주셔서 감사합니다. 많은 학자 누구와 나는 R. 동아, M. 모리 타니, P. 루오, R. Ambalavanar를 포함하여이 기술의 개발에 대한 통찰력을 제공하는 협력 있습니다. 이 기술은 NIH 보조금 DE10132, DE15386 및 RR017971에서 상당한 지원 개발되었습니다.

1. 동물 준비 <ol><li> pentobarbital 나트륨 (50mg/kg IP) 및 난방 패드에 장소와 쥐 마취. 동물 가위로 사후 두개골을 overlying 피부를 면도. 발가락이 palpebral 반사의 부재로 모근뿐만 아니라 경우 마취 수준의 수술 수준이 탈퇴 반사와 발성의 부재에 대한 테스트에서 얻은되었음을 보증하기 위해 동물을 확인합니다. 마취 15 분 간격의 수준을 확인하고 나트륨 pentobarbital 15mg/kg의 주사 45 분마다에 의해 anesthetisa의 수술 수준을 유지합니다. </li><li> 무균 기술을 사용하고 복부와 허벅지 안쪽에 의해 형성 포복 절도에 사타구니 지역에서 절개 단지 말초하고 대퇴 정맥에 정맥 (1mm 직경, 클레이 아담스)과 대퇴 동맥에 삽입합니다. 턱밑 지역의 정중선 절개를 만들고, infrahyoid 근육을 반영합니다. 기관의 작은 절개를하고 환기를 허용하도록 정맥 (2mm 직경)를 삽입합니다. 동맥 정맥을 통해 place.Monitor 체계 diastolic 및 수축기 혈압에 확보 cannual trachael 주위에 치료를 타이. 철수와 palpebral 반응을 모니터링하는 것 외에도 지금 마취의 수준을 평가하기 위해 혈압을 모니터링합니다. 정맥 정맥을 통해 필요할 때 추가적인 마취를 관리할 수 있습니다. </li><li> stereotaxic 프레임에 쥐 장소와 소뇌를 폭로 craniotomy을 수행합니다. 쥐 때문에 환기에 tracheal 정맥을 연결합니다. humidified 공기와 100/min의 속도 2cm 3의 부피와 동물을 환기. 1cm H 2 O의 긍정적인 최종 날숨 압력이 폐 붕괴를 방지하기 위해 유지되어야합니다. 매 15 분 무기폐을 방지하기 위해 폐가 hyperinflate. 다음 예열 미네랄 오일 (30 ° C)와 함께 두뇌의 표면을 커버. 직접 두정 골과 interparietal 뼈 사이의 교차점 아래에있는 큰 정맥 구멍을 피하기 위해주의하십시오. </li><li> 전자기 진동에 결합 막대에 cyanoacrylate 접착제를 적용하고 턱뼈의 치극이라고에있는 막대를 부착합니다. 중 A / D 컴퓨터 출력 또는 신호 발생기의 진동에 mandible 사용하는 명령 신호를 이동합니다. </li><li> craniotomy에 인접한 피부 아래 siliver - 실버 염화물 접지 전극을 배치합니다. </li></ol> 2. 전극 준비 <ol><li> 수평 microelectrode의 풀러를 사용하여 석영 또는 aluminosilicate 유리의 microelectrodes를 조작. </li><li> 0.25M KCl과 0.5M 트리스 버퍼 HCL (산도 7.6) 또는 호수에서 2 % tetramethlyrhodamine (산도 6)에 녹아있는 5-10%의 biotinamide로 microelectrode를 입력합니다. 전극 시험기와 전극 임피던스를 확인합니다. 대구경 axons에서 기록하려면 60 - 80M Ω의 임피던스와 전극을 작은 axons과 interneurons 80 - 150MΩ의 임피던스와 전극을하십시오. </li><li> 전위계의 머리 단계에 microelectrode를 놓습니다. 동물의 머리 뒤에 위치에 고정되는 작은 망원경 (동봉 십자선과 함께 20X)을 통해 전극을 시각화. 이 전극은 stereotaxically 큰 정밀도로 위치를 수 있기 때문에 망원경을 사용하는 것이 중요합니다. </li></ol> 3. Electrophysiological 기록 및 세포 염색법 <ol><li> 피아 메이터의 작은 오프닝을 만들고 전극은 머리를 닿을 때 피드백 신호가 생산되도록 커패시턴스 피드백을 받으려는. 이것은 두뇌의 표면의 정확한 위치를 수 있습니다. </li><li> 반복 mandibular 변위를 생산 및 스테핑 모터의 두뇌에 전극 사전. </li><li> DC 가능성에 갑자기 방울로의 연​​결을 impalements을 인식하고 지속적인 시냅스 활동에 의해 intrasomatic의 연결 impalements를 확인합니다. 커패시턴스의 overcompensation으로 전극을 윙윙하거나 거의 성공적인 세포 침투를 생산하지 도청. 때문에 전극의 높은 임피던스의의 연결 반응이 거의 침투하기 전에 관찰되지 않습니다. </li><li> 당신이 신경을 찌르려고하고 침투가 안정 것으로 간주되면 램프 길게 및 사인 턱 운동을 사용하여의 연결 반응을 특징 5.지도 신경 세포의 수용 필드를 비 전도성 프로브로 머리 주위 피부와 내부 구강을 탐색하여 나무 막대기 등. 연구에 관련된 경우, 그러한 근육 수축 및 유해 자극과 같은 다른 기능 관련 자극에 신경 세포의 반응을 조사 6. 프라이 머리 도입 성의 nociceptive의 연결 수용체가 nociceptive 자극에 반응. 같은 pentobarbital 나트륨과 같은 일반적인 anesthesetics은 기본 수입 성의 뉴런에서 axonal 전도를 차단하는 것이 아니라 신경 전송을 우울하게하지 않습니다. 따라서 기본 수입 성의 축삭의 연결에 axonal 전도는 보존됩니다. </li><li> 15 70nA 분 총 주입 시간 (DC, 1 4nA) 전류 주입. 현재 분사하는 동안 전극 침투를 모니터링하고 막 잠재력이 - 30mV보다 긍정 될 경우에는 중단.</li></ol> 4. 조직 처리 <ol><li> (0.9 % NaCl 38 헹굼 혈관과 pentobarbital의 과다 복용 (140mg/kg IV)와 perfuse하여 동물을 안락사 ° C 헤파린 500 단위 및 1ml 2 % 포함하는 0.1M 인산 버퍼에 4 % paraformaldehyde (산도 7.4) 다음 xylocaine . </li><li> 중 전두엽, 화살이나 수평면에 vibratome를 사용하여 50 100μm의 두뇌와 섹션을 제거합니다. Secions 25 ° C PBS에 부유를 수집하고 있습니다. </li><li> 1-2% 정상 염소 혈청의 잠복기, 1 % 트리톤 0.01M PBS에 X - 100 아비딘 비오틴 단지에 부화 (1시 50분 엘리트 Vectastain) 다음으로 DAB를위한 두뇌를 처리합니다. H 2 O 2와 니켈 - DAB를 사용하여 섹션을 반응. 텍사스 레드, 4 박 PBS에 아비딘 - 비오틴 복합 (1시 50분)에 품어 섹션 ° C 후 4 ° C 하룻밤에 PBST에 4% 텍사스 레드 아비딘 DCS에서 품어.위한 처리 23 ° C.에 형광 Nissl 얼룩 (NeuroTrace) 20 분들과 섹션 Counterstain </li><li> 신경 세포는 rhodamine로 주입 있었다면, 형광 현미경 (예 545nm)로 직접 주입 신경 세포를 시각화. </li></ol> 5. 역행 라벨, immunocytochemistry, 공촛점 이미징, 정량 colocalization 분석 방법을 결합 다른 방법이 기술을 결합의 성공은 좋은 상표 세포에 따라 크게 달라집니다. <ol><li> 방법은 쉽게 역행의 연결 라벨과 함께 조합하여 사용할 수 있습니다 여기에 시각. 이렇게하려면 70-10, 동물을 마취 및 무균 기술을 사용하여 이러한 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (20 % 양고추냉이 퍼옥시데이즈. 시그마 VI, 시그마)으로의 연결을 추적기 삽입, 1 % 밀가루 - 세균은 턱 근육과 같은 말초 대상 지역으로 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (시그마)를 aggultinated. 이것의 연결을 추적은 주변 axons로 최대 촬영 및 motoneuron의 somata에 axonal 수송을 통해 운반됩니다. 턱 근육 들어, 추적의 15μl는 살균 10 microliter의 microsyringe를 사용하여 근육에 주입합니다. 마취에서 회복 후 복구를 위해 자신의 새장에 배치까지 동물은 다음 가열 패드에 위치하고 모니터할 수 있습니다. 24 시간 후, 동물 마취 및 생리학 신경을 특징 및 intracellularly 그들을 얼룩. 다음 코발트와 안정기 및 심화로 chromagen 나트륨 tungstate로 tetramethylbenzidine (TMB)를 사용 HRP의 존재에 대한 이상 및 프로세스 조직 섹션에서 설명하는 것처럼 동물을 perfuse. 1 %의 나트륨에 넣어 섹션은 0.1M PBS (산도 6.5)와 15 절대 에탄올과 아세톤에 용해 0.0007 %의 TMB에 녹아있는 tungstate ° C 20 분. 그렇다면 0.3 % 60 분 부화 솔루션 100ml 당 H 2 O 2 1.0 ML를 추가하여 조직 섹션을 반응. 0.05 %의 diaminobenzidine (산도 7.4), 0.02 %의 코발트와 0.01 % H 2 10 분 0.1M PBS (산도 7.4)에서 O 2 0.1M PBS (산도 6.5)에 조직과 장소를 씻어. 37 ° C. 설명한대로 biotinamide로 주입 신경 세포의 시각화를위한 조직을 처리하고 표시된 감각 뉴런과 motoneurons 다양한 사이의 관계를 시각화. </li><li> 여기에 표시된 기술도 쉽게 immnocytochemistry와 함께하실 수 있습니다. 6 예를 들어, immunocytochemically 정확하게 표시 뉴런 사이 시냅스 (그림 3) 찾을 수 synaptophysin에 대한 두뇌를 처리합니다. 이렇게하려면 4 이일 ° C 그리고 23 1H에 대한 안티 마우스 FITC (1:400)에서 품어 ° C.에 대한 마우스 방지 synaptophysin 항체 (1:10,000)에서 뇌 부분을 품어 </li><li> 형광 마커로 표시하거나 형광 이미징을위한 처리 뉴런은 공촛점 이미징에 이상적입니다. 그림 3은 축삭의 부통 통해 공촛점 현미경과 취득 광학 섹션의 예입니다. (그림 3). 라벨 신경 세포 (그림 4)를 통해 여러 광학 부분을 인수하여 분류 뉴런의 애니메이션을 생성할 수 있습니다. </li><li> 이 방법으로 표시 뉴런은 양적 colocalization 분석에 사용할 수 있습니다. 이렇게하려면 (http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm에서 확인) NIH 이미지와 함께 공개 소프트웨어 매크로를 사용합니다. synaptophysin의 immunocytochemistry와 세포내 상표를 결합하여 단일 축삭 터미널 내에서 synaptophysin을 집중하다 6. </li></ol> 6. 대표 결과 : 이 방법을 사용하여 얻을 수있는 대표적인 결과의 개요는 그림 1에서 그림입니다. 이것은 하나의 brainstem 신경이 electrophysiologically 분명히 볼 수 있듯이, mandible 운동 기간 동안 기록되었다,이 신경 세포의 반응 (그림 1 왼쪽, 하늘색 하단)은 운동 중에 변조되었습니다. 이 신경 세포는 electrophysiological 특성 후 biotinamide와 함께 주입하고 이후 시각화에 대한 처리되었습니다. 재건축 신경 세포 (그림 1 중간, 녹색)가 실제 수해부 획기적인 테드,이 경우에는 삼차 모터 핵은 (빨간색 테두리) 지정. 움직임과 재건축 기간 동안의 연결에 따라 응답이 신경 세포는 보조 근육 스핀들 수입 성의 신경 세포로 확인할 수 있습니다. 그림 2 조 변위 동안 신경 세포의 생리적 반응의 대표적인 예를 보여줍니다. 신경 세포의 반응은 즉각적인 발사 주파수로 표현된다. 의 연결 응답이 밀접하게이 특정 신경 세포가 mandibular 위치에 관한 감각 피드백을 제공 나타내는 mandibular 변위를 모방 것을. 그림 3 참고 synaptophysin에 대한 얼룩과 Nissl은 얼룩과 함께 intracellularly 스테인드 축삭의 높은 배율 이미지입니다. 축삭 부통 이내 synaptophysin (노란색)의 colocalization을 확인합니다. 그림 4는 단일 생리학 특징 및 intracellularly 레이블 신경 세포의 애니메이션입니다. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 방법의 개요. 왼쪽 상단 : mandibular 변위. 하나의 신경 (노란색)에서 중간 세포 녹화 (녹색). 이 신경 세포의 형태는 세포 기록하고 주사 후 복원되었다. 레드 개요 삼차 모터 핵의 위치를​​ 나타냅니다. 왼쪽 하단 : 턱 운동 중에이 신경 세포의 생리 반응합니다. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. mandible 운동하는 동안 생체내에 기록된 하나의 근육 감각 신경 세포의 생리 반응 대표. 턱 변위로의 연결 응답의 유사성을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 탐색 근육 동안 응답 intracellularly 묻은 감각 신경 세포의 시냅스 부튼스 (적색 swellings)와 터미널 axonal arborization. synaptophysin에 대한 후속 immunocytochemical 처리 axonal 부통 (노란색) 이내 synaptophysin의 지방화를 보여줍니다. 녹색 형광 Nissl가 얼룩이다. 그림 4. 생리 반응 mandibular 운동 중에 생체내에 기록된 근육 스핀들 주 수입 성의 신경 세포의 축삭의 애니메이션은 축삭은 다음 intracellularly 스테인드 및 가시화를위한 처리되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">여기에 그림 4의 고해상도 비디오를 다운로드</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">여기에 그림 4의 중간 해상도 비디오를 다운로드</a>

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	<li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task.">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li><li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord.">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li><li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching.">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li><li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys.">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. 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Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat:+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular.">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li><li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat.">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li><li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide.">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat.">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li><li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep.">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li><li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum.">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li></ol>

동물 실험 (1985 개정 NIH 출판 번호 86-23) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 설명서에 명시된 guidlines 및 규정에 따라와 메릴랜드 애니멀 케어 대학에서 수행하고위원회를 사용했다.

여기에 그림이 메서드는 단일 뉴런의 기능에 중요한 통찰력을 제공하는 방법과 각각의 뉴런의 반응의 연결 회로에 기여하는 강력한 기법입니다. 아홉이 지식은 sensorimotor 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 이 기법의 가장 큰 장점은 생리학, 형태학 및 신경 형태학 및 배포를 포함한 신경 세포에 대한 매개 변수의 다수의 결정을 허용된다는 점입니다. 이 방법의 예 등의 연결 회로로 후퇴의 연결 레이블 추가 정보와 같은 다른 기술과 결합되면 것은 특색 수 있습니다. 7,8 또 다른 장점은이 단계에서 배운 수있다는 것입니다. 예를 들어, 세포 녹음 immunocytochemistry 또는 초기 방법의 숙달 후 추가 역행의 연결 라벨과 세포내 얼룩 다음, 처음 실시 수 있습니다. 아마도 기술의 가장 큰 한계는 뉴런의 단지 소수가 한 실험에 표시 될 수있다는 것입니다. 일반적으로 특정 생리적 유형의 2-3 뉴런들은 처음에 표시됩니다. 생리와 형태 사이의 잠재적인 관계가 공식화되면, 추가 실험은 신중하게 단 하나의 뉴런이 표시되는 실험이 관계를 확인하는 데 사용됩니다. 이 방법의 성공을 위해 가장 중요한 단계는 electrophysiological 세포내 기록 안정성을 유지합니다. 레코딩 안정성 연구에서 신경 세포의 두뇌 속에 위치하지만, 조작의 수를 기록 안정성을 향상하는 데 사용할 수에 따라 크게 달라집니다. pneumothorax이 수행과 동물은 인공적으로 호흡 pulsations을 줄이기 위해 환기 수 있습니다. 안정성에 대한 1cm H 2 O.의 긍정적인 끝에 날숨 압력을 적용하여 더욱 증가시킬 수 있습니다 두뇌 속에 관심의 영역에 도달하면 안정성이 호흡 볼륨을 감소하고 호흡 속도를 증가시켜 호흡 동물에 의해 향상된 수 있습니다. 일부 electrophysiological 연구는 두뇌를 통해 따뜻한 한천을 적용하고 방광을 cannulated 가지고, 이러한 절차는 brainstem의 녹화의 연결의 안정성을 증가 효과되지 않았습니다. 주입 시간이 오래 필요가 전혀 없다는 것을 지적하는 것이 중요합니다. 좋은 결과는 약 5 분 분사 시간을 얻을 수 있습니다. microelectrodes의 작은 팁 크기로 인해 뇌 안에 전극의 파손은 일반적으로 추적 많은 자료를 생산하지 않습니다. 따라서 전극 대체할 수 있으며, 뉴런이 성공적으로 기록 전극 파손의 위치의 수백 미크론 이내에 얼룩. 전극이 막혔어요 또는 녹음 솔루션은 적절하게 전극의 끝부분을 기입하지 않는 경우, 노이즈가 크게 증가되고 전극 교체해야합니다. 두뇌에 이전에 삽입하는 전극 임피던스 테스트하면 크게 비생산적인 전극 책자를 줄이고 시간을 절약할 수 있습니다. 당신은 두뇌 stereotaxic의 위치의 작은 지역에서 기록하려는 경우 최우선입니다. 나는 고정 stereotaxic 제로를 유지하는 기록 테이블에 부착된 망원경을 사용합니다. 전극이 기록 테이블에 연결된 후 확대에 따라 많이 전극 홀더에 놓을 수 있기 때문에 망원경은 매우 유용합니다. 이것은 대체 전극의 microelectrode 및 따르면 매우 정확한 위치를 수 있습니다. 최근 연구의 수가 juxtacellular의 연결 레이블을 사용합니다. 전극이의 연결을 기록하고의 연결을 추적의 특성에 따라 신경 세포에 근접 배치됩니다이 방법 11,12가 나옵니다. 추적기는 전극의 주변에있는 다른 뉴런의 dendrites과 axons에 통합될 수 있기 때문에이 방법으로 확실한 잠재적인 문제는 가짜 상표입니다. extracellularly 기록 작업 잠재력이뿐만 아니라 신경 세포에 시냅스 입력하여 있지만, 신경 세포의 본질적인 속성에 의해 생성된 수 있기 때문에뿐만 아니라, 신경 세포의 입력 - 출력 관계는 결정 수 없습니다. 방법은 여기를보고있는 microelectrode가 신경 세포 내에서 실제로하기 때문에 스테인드 신경 세포로의 연결 활동의 속성에 관한 아무런 모호함이없는 반면, 뉴런에만 표시됩니다. axons을 분류 때 특히 중요합니다 가짜 상표 몇 미크론 결과에 의해 microelectrode의 움직임 때문이다. 또한, 시냅스 후보를 포함한 subthreshold 이벤트는 찔려 죽은 신경 세포에서 기록하실 수 있습니다. 미래 연구는 evoked 움직임이 방법을 결합 수 있습니다. 예를 들어 피질 자극이 evoked 움직임 동안 뉴런의 세포 기록과 얼룩을 허용해야 brainstem 내에서 masticatory 움직임 및 기록 안정성을 보여주고 있습니다. 이 기술은 최소한의 수술의 개입과 함께 할 수 있기 때문에, 그것은 또한 포스 수 있습니다생체내의 유전자 발현을 변경 물질을 주입하기 위해이 방법을 사용하는 관계 였는데.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약이나 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 전자기 진동 </td><td> 링 동적 시스템 </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> 신호 발생기 </td><td> 피드백 시스템 </td><td> PFG605 </td><td> 사다리꼴 출력 신호를 생산 할 수 </td></tr><tr><td> 전극 유리 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> AF100 - 68-10 </td><td> 필라멘트와 함께 </td></tr><tr><td> 전극 풀러 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 P - 2000 P - 80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> 벡터 연구소 </td><td> SP - 1120 </td><td> 4 저장 ° C </td></tr><tr><td> 텍사스 레드 아비딘 DCS </td><td> 벡터 연구소 </td><td> A - 2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> 분자 프로브 </td><td> D - 3308 </td><td> 3,000 분자량, 라이신 고칠수 </td></tr><tr><td> 마우스 방지 synaptophysin 항체 </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 Nissl 얼룩 </td><td> Neurotrace, 분자 프로브 </td><td> N - 21480 </td><td></td></tr><tr><td> 전극 시험기 </td><td> 윈스턴 전자 </td><td> BL - 1000 - B </td><td> 전극 임피던스를 측정하는 </td></tr><tr><td> 전위계 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> Axoprobe 1A, 2B Axoclamp </td><td></td></tr></tbody></table>

physiological, morphological and neurochemical characterization of neurons modulated by movement

개별 뉴런과의 연결 회로에서 함수의 역할은 감각과 운동 기능의의 연결 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 동물은 운동하는 동안 정적 1,2 또는 레코드 세포의 연결 활동을하는 동안 sensorimotor 메커니즘 대부분의 조사는 뉴런 중 하나가 검사에 의존하고 있습니다. 3,4를 이러한 연구는 sensorimotor 기능을 위해 근본적인 배경을 제공하는 동안, 그들 중 기능적 정보를 평가하지 이것은 운동 중에 발생하거나 완전히 신경의 해부, 생리 및 neurochemical 표현형을 특징하는 능력에 제한됩니다. 기술은 생체내 운동의 기간 동안 개별 뉴런의 광범위한 특성을 허용하는 여기에 표시됩니다. 이 기술은 기본 수입 성의 뉴런을 공부뿐만 아니라 motoneurons 및 sensorimotor의 interneurons을 특성화하기 위해뿐만 아니라 사용하실 수 있습니다. 처음에는 하나의 신경 세포의 반응은 신경 세포에 대한 수용 분야의 결정 다음 mandible의 다양한 움직임 동안 electrophysiological 방법을 사용하여 기록됩니다. 의 연결을 추적은 다음 intracellularly 신경 세포에 주입되고 두뇌는 신경 세포가 빛을, 전자 또는 공촛점 현미경 (그림 1)과 시각 수 있도록 처리됩니다. 의 연결 형태가 신경 세포 (Figs. 2,3)의 생리적 반응과 상관 수 있도록 특성화 신경 세포의 자세한 형태는 다음 복원됩니다. 의사 소통이이 기술의 성공적인 구현을위한 중요한 핵심 세부 사항 및 도움말이 제공됩니다. 유용한 추가 정보는 다른 방법과이 방법을 결합하여 연구에서 신경 세포에 대한 결정하실 수 있습니다. 역행의 연결 레이블이 뉴런을 결정하는 데 사용할 수있는 레이블이 붙은 신경 세포의 시냅스와;의 연결 회로의 수 있으므로 자세한 결의. Immunocytochemistry은 표시 신경 세포 내의 신경 전달 물질을 검토하고있는 레이블 신경 세포의 시냅스가 뉴런의 화학 phenotypes을 결정하기 위해이 방법과 함께하실 수 있습니다. 분류 뉴런은 또한 레이블 신경 세포의 ultrastructural 기능과 microcircuitry을 결정하기 위해 전자 현미경을 위해 처리될 수 있습니다. 전체이 기술은 철저하게되므로 sensorimotor 기능에 신경 세포의 역할에 상당한 통찰력을 수 있단 운동의 동안 신경을 특성화하기위한 강력한 방법입니다.

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

기술은 운동하는 동안 포유류의 뉴런의 생체내 생리적 반응을 수량과의 연결 형태, neurochemical 표현형 및 시냅스 microcircuitry와 신경 세포의 생리 신원을 확인하도록 설명되어 있습니다.

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K 조회수.  University of Maryland. 기술은 운동하는 동안 포유류의 뉴런의 생체내 생리적 반응을 수량과의 연결 형태, neurochemical 표현형 및 시냅스 microcircuitry와 신경 세포의 생리 신원을 확인하도록 설명되어 있습니다.

비디오: Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Eye Movement Monitoring of Memory

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank yesterday."), however such reports can often be unreliable or sensitive to response bias 1, and may be unobtainable in some participant populations. Furthermore, explicit reports only reveal when information has reached consciousness and cannot comment on when memories were accessed during processing, regardless of whether the information is subsequently accessed in a conscious manner. Eye movement monitoring (eye tracking) provides a tool by which memory can be probed without asking participants to comment on the contents of their memories, and access of such memories can be revealed on-line 2,3. Video-based eye trackers (either head-mounted or remote) use a system of cameras and infrared markers to examine the pupil and corneal reflection in each eye as the participant views a display monitor. For head-mounted eye trackers, infrared markers are also used to determine head position to allow for head movement and more precise localization of eye position. Here, we demonstrate the use of a head-mounted eye tracking system to investigate memory performance in neurologically-intact and neurologically-impaired adults. Eye movement monitoring procedures begin with the placement of the eye tracker on the participant, and setup of the head and eye cameras. Calibration and validation procedures are conducted to ensure accuracy of eye position recording. Real-time recordings of X,Y-coordinate positions on the display monitor are then converted and used to describe periods of time in which the eye is static (i.e. fixations) versus in motion (i.e., saccades). Fixations and saccades are time-locked with respect to the onset/offset of a visual display or another external event (e.g. button press). Experimental manipulations are constructed to examine how and when patterns of fixations and saccades are altered through different types of prior experience. The influence of memory is revealed in the extent to which scanning patterns to new images differ from scanning patterns to images that have been previously studied 2, 4-5. Memory can also be interrogated for its specificity; for instance, eye movement patterns that differ between an identical and an altered version of a previously studied image reveal the storage of the altered detail in memory 2-3, 6-8. These indices of memory can be compared across participant populations, thereby providing a powerful tool by which to examine the organization of memory in healthy individuals, and the specific changes that occur to memory with neurological insult or decline 2-3, 8-10.

Eye movement monitoring (or eye tracking) reveals where in space the eyes linger, when and for how long. Here, we demonstrate how eye tracking can be used to investigate the integrity of memory in multiple participant populations, without requiring verbal, or otherwise explicit, reports.

메모리 아이 운동 모니터링

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

연구

신경과학

Coherence between Brain Cortical Function and Neurocognitive Performance during Changed Gravity Conditions

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and focused on psychological aspects. Until now, objective observation of neurophysiological parameters has not been carried out - undoubtedly because the technical and methodological means have not been available -, investigations into the neurophysiological effects of weightlessness are in their infancy (Schneider et al. 2008).
While imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and magnetic resonance imaging (MRI) would be hardly applicable in space, the non-invasive near-infrared spectroscopy (NIRS) technique represents a method of mapping hemodynamic processes in the brain in real time that is both relatively inexpensive and that can be employed even under extreme conditions. The combination with electroencephalography (EEG) opens up the possibility of following the electrocortical processes under changing gravity conditions with a finer temporal resolution as well as with deeper localization, for instance with electrotomography (LORETA).
Previous studies showed an increase of beta frequency activity under normal gravity conditions and a decrease under weightlessness conditions during a parabolic flight (Schneider et al. 2008a+b). Tilt studies revealed different changes in brain function, which let suggest, that changes in parabolic flight might reflect emotional processes rather than hemodynamic changes. However, it is still unclear whether these are effects of changed gravity or hemodynamic changes within the brain. Combining EEG/LORETA and NIRS should for the first time make it possible to map the effect of weightlessness and reduced gravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain. Initially, this is to be done as part of a feasibility study during a parabolic flight. Afterwards, it is also planned to use both techniques during medium- and long-term space flight.
It can be assumed that the long-term redistribution of the blood volume and the associated increase in the supply of oxygen to the brain will lead to changes in the central nervous system that are also responsible for anaemic processes, and which can in turn reduce performance (De Santo et al. 2005), which means that they could be crucial for the success and safety of a mission (Genik et al. 2005, Ellis 2000).
Depending on these results, it will be necessary to develop and employ extensive countermeasures. Initial results for the MARS500 study suggest that, in addition to their significance in the context of the cardiovascular and locomotor systems, sport and physical activity can play a part in improving neurocognitive parameters. Before this can be fully established, however, it seems necessary to learn more about the influence of changing gravity conditions on neurophysiological processes and associated neurocognitive impairment.

The effect of weightlessness and hypergravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain is going to be followed during parabolic flight by EEG and NIRS techniques. 
A feasibility study of a more complex experiment, which is planned to carry out during medium- and long-term space flight.

브레인 두피 기능 및 변경 중력 조건 중 Neurocognitive 성능 사이의 일관성

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and ...

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

당뇨병 쥐의 열전달 Nociceptive 본부 신속한 결정

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

횡격막 모터 뉴런에 의해 다이어프램 신경 분포의 기능 및 형태 학적 평가

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.