This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

뜨는 1. 준비는 활동에 대해 테스트 할 <ol><li> 멸균 0.1 M 황산 버퍼 (예를 들어 1 mg을 마이 토마 이신 C / 2 ml의 버퍼)에 해당하는 양을 용해하여 마이 토마 이신 C의 0.5 ㎎ / ㎖ 주식 솔루션을 준비합니다. 가벼운 보호 용기에 4 ° C에서 보관 재고 (마이 토마 이신 C 민감한 빛). </li><li> 왕의 매체 B (KB) 국물 (14)의 3 ㎖에 P. syringae의 단일 식민지의 예방. 실온에서 (200 rpm)으로 진탕 밤새 인큐베이션 (21-25 ° C). </li><li> 다음 날 아침, 신선한 KB 국물의 3 ㎖로 국물 문화 1/100 희석. 실온에서 진탕하면서 3-4 시간 동안 인큐베이션. 마이 토마 이신 C (0.5 μg의 / ㎖, 최종 농도)를 추가합니다. 실온에서 진탕 밤새 문화를 품어. 참고 : 미토 마이신 C, 따라서 박테리오파지 및 박테리오신 모두의 생산으로 이어지는, 세포의 SOS 반응을 자극, 이중 가닥 DNA 나누기가 발생합니다. </li><li> 펠렛 1-2 ml의 마이 토마 이신 C는 벤치 탑의 microcentrifuge에서 5 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 문화를 유도. </li><li> 제거하고 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터로 상청액을 통과시킴으로써 또는 클로로포름 상등액 (1 mL의 상층 액 100 μl의 클로로포름)로 처리하여 배양 상청액 중 살균. <ol><li> 클로로포름을 사용하는 경우, 15 초 동안 상기 혼합물을 와동 및 실온에서 1 시간 동안 배양한다하자. 배양 후, 5 분 동안 20,000 XG에서 혼합물을 원심 분리. 참고 : 클로로포름이 효율적으로 세포막을 용해하여 세포를 죽인다. 필터를 통해 멸균 클로로포름을 사용하는 장점은 저렴하고 스케일 업하기 쉬운 것이되는 경우 한번에 많은 (&gt; 20)의 샘플을 처리하는 단계를 포함한다. 소정의 살상 능력이 유기 상으로 분할의 결과로서, 클로로포름 처리 다음 손실 될 가능성이있을 수있다. </li><li> 신선한, 멸균 1.5 또는 2.0 ml의 1 ML의 피펫을 사용하여 상단, 수성 단계를 제거미세 원심 분리 튜브. 하부 클로로포름 층 중 하나를 전송하지 않도록주의 (는 캐리 오버를 방지 할 수 성상 미만을 제거하는 것이 좋다). </li><li> 잔류 클로로포름 (몇 시간) 증발 할 수 있도록 흄 후드에 상한선이 전송 된 상층 액을 품어. 4 ° C에서 보관 상층 액. </li></ol></li></ol> 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전에 의해 고 분자량 화합물의 살균 2, 분리, 농축 <ol><li> 멸균 상층 액에 각각 1 M 10 % 최종 농도의 NaCl 및 PEG 8000를 추가합니다. 염화나트륨 및 PEG 모두가 완전히 용해 될 때까지 반복적으로 샘플을 반전한다. 1 시간 또는 밤새 4 ℃에서하는 얼음 욕조에 샘플을 품어. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 샘플. 펠릿은 원심 분리 튜브의 하단을 형성한다. 뜨는을 가만히 따르다 (예 : 1/10 또는 원래 상층 권의 1/100로 원하는 볼륨에 펠렛을 재현 탁매화) 반복 피펫으로 버퍼 (10 mM 트리스, 10 mM의 황산, 산도 7.0)의. </li><li> 클로로포름의 동일한 볼륨이 순차적으로 추출하여 잔류 PEG를 제거합니다. <ol><li> 10 초 15의 재 부유 펠릿과 소용돌이와 클로로포름을 결합, 다음 5 분 동안 20,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 신선한의 microfuge 튜브에 위 수성 위상을 전송합니다. 수성 및 유기 단계 사이에 흰색 인터페이스가 보이지 않을 때까지이 추출을 반복 (보통 2 추출은 총). 잔류 클로로포름은 흄 후드에서 추출 상층 액에서 증발하도록 허용합니다. </li></ol></li></ol> 활동에 대한 오버레이 및 테스트 상층 액 3. 준비 <ol><li> P. syringae 균주의 단일 콜로니 KB 3 ㎖에 감도를 판정하는 접종 실온에서 진탕하면서 하룻밤 동안 배양한다. </li><li> 다음 날 아침, 다시 신선한 KB로 문화 1/100 희석. 객실 temperatu에서 진탕 3 ~ 4 시간을 품어레. </li><li> 초순수에 한천 (/ V 승) 현탁액 0.35-0.7 %를 고온 가압 멸균하여 멸균 한천을 준비합니다. 참고 : 연수 한천의 주식은 전자 레인지에서 용융 반복적으로 재사용 할 수있는, 신선한 오버레이는 각 실험을 준비 할 필요가 없습니다. 물 한천 재사용되는 경우, 완전히 다음은 전자 레인지 용융되도록하는 것이 중요하다. 그렇지 않은 경우, 오버레이는 해석을 어렵게 만들 것입니다 응고시 거친 텍스처를해야합니다. 이 경우, 더 이상 이전 완료보다 마이크로파에서 몇 분 동안 한천을 용해. </li><li> 사용하기 전에 60 ° C의 물을 욕조에 녹은 부드러운 한천을 유지한다. 멸균 배양 튜브로 전송 부드러운 한천의 3 ㎖를 멸균 혈청 학적 피펫을 사용하여. 용융 상태로 유지하기 위해 물을 욕조에 문화 튜브를 돌려줍니다. </li><li> 첫 번째 (가 따뜻한하지만 터치 섹시하지 느껴야한다) 용융 한천이 식을 수 있도록, 오버레이를 부어 있지만, 응고하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 멸균 후드에서 100 μl를 접종부드러운 한천과 소용돌이에 테스터 변형 문화가 혼합합니다. 바닥 한천 (KB 한천)에 부어 후 10 ~ 15 초 동안 손으로 문화를 돌립니다. 부드러운 한천이 균일하게 바닥 한천을 커버하기 위해 모든 방향으로 접시를 기울입니다. 주 : 하부 한천 시험 균주 강하게 성장하는 임의의 고화 (1.5 % 한천) 매체 일 수있다. 표준 100mm 직경 페트리 접시를 들어, ~ 20 ㎖ 매체를 용융 사용합니다. (건조하지 않고 39 ° C로 유지하는 경우) 또는 당일 제조 할 수 하부 한천은 미리 몇 주를 제조 할 수있다. 오버레이를 수행하는 것과 같은 일을 준비하면 3.4 단계 너무 전에 수행하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 플레이트를 커버하고 20 ~ 30 분 응고 할 수 있습니다. 응고 동안 접시를 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 일단 상층 액의 2-5 μl를 발견, 응고 오버레이 상 (섹션 위의 1과 2에서 발생). 플레이트를 실온에서 밤새 배양 허용. 관찰하고 기록 결과 다음 아침. 참고 : 그것은을수행하고 상층 액의 일련의 희석에서 발견하는 것이 유용 할 수 있습니다. 이 연구원은 박테리오파지 및 박테리오신 청소 활동을 구별 할 수 있습니다. 1:10 희석 5 :이 경우, 하나를 수행하도록 권장한다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 소프트 한천 오버레이 기법은 널리 박테리오파지 또는 박테리오신에 관심있는 연구자들에 의해 수십 년 동안 적용되었습니다. 이 방법의 주요 이점은, 저렴하고 간단한 해석 비교적 쉽다는 점이다. PEG 침전 시리얼 희석 연질 한천 오버레이를 결합함으로써, 항 미생물제 (예 : 박테리오파지 대 tailocin 각각) 비 - 복제 성 대 저 분자량 대 고 화제 및 복제 성 제제로 분리 될 수있다. 마지막으로, 추정 박테리오신 또는 프로 파지 궤적의 대상으로 유전자 조작 (삭제 및 보완)의 통합 단단히 주어진 대립 화합물의 정체성을 확립 할 수 있습니다. 우리는 최근에 새로운 박테리오파지 유래 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)들 사이에서 유행 박테리오신 9 균주 설명하기 위해이 방법을 사용했다. 슈도모나스 한건데 잘이 프로토콜 작업에 표시된 성장 배지 및 조건ringae과 가능성이 이러한 조건에서 적극적으로 성장을 다른 그람 음성 세균 충분합니다. 그러나,이 방법을 사용하는 연구자들은 시스템의 타이밍 배지 유도있어서, 배양 온도를 최적화 할 것이다. 임계 파라미터는 대수 성장 단계에서 동시에 생산 배양을 유도뿐만 아니라, 균일 한 세균 분포를 보장하기 위해 충분한 대수 위상 문화 연질 한천 오버레이 시드하지만 전위 소거 영역을 불명료하지 않습니다 과도한 배양을 포함한다. 거기 SOS 응답의 일부로서 유도되지 않는 많은 박테리오신은 오히려 같은 펩티드 균체 감지 시스템, 즉, 연구자는 여러 다른 유도 방법을 선별 할 수있다 (15, 특히 그람 양성 박테리오신 ()을 유도 매체를 유도하거나 생산 균주의 배양 확장) 허용의 영양소 함량을 수정하는 단계를 포함한다. 사용하는 경우이 기술은, 연질 한천 오버레이 충분히 전에 시딩 균주의 첨가에 55-60 ℃에서 용융 유지되어야한다. 우리는 (시각적으로는 것처럼 보였다하지만)와 거친 외모와 오버레이 결과 소프트 한천이 완전히 용융되지 않은 몇 가지 실험이 있었다. 거친 오버레이의 결과는 여전히하지만,이 (관찰하는 것이 더 어려울 것이다 약한 억제) 억제의 강도에 따라 달라집니다, 일반적으로 해석 할 수있다. 이 기술을 사용하면, 용융 아가의 온도가 시드 균주를 죽이는 피하기 위해, 종래 시딩 균주 접종으로 냉각 할 수있는 충분한 시간을 허용되는 때 최종 교란 변수를 고려한다. 이 문제를 방지하려면, 우리는 소프트 한천은 터치, 뜨거운 따뜻한,하지만하지 않습니다 확인합니다. 이러한 맥락에서, 우리는 또한 우리가 용융 한천에 적응하기위한 시딩 문화에 대한 부적절한 시간을 줄 경우, 오버레이를 주입하기 전에, 우리는 일반적으로 가난한 세균 g을 복구하는 것이 관찰특정 억제 어렵거나 불가능의 해석이 해석 할 수 rowth. 우리가 텍싱 및 오버레이를 붓는 사이에 배양의 10 ~ 15 추가 초 정도의 이유입니다. 완전히 용융 상태의 한천을 유지 사이의 트레이드 오프 (뜨거운이 아닌 더 나은) 가능성이 시행 착오를 통해 연구자에 의해 결정되어야합니다 하나 인 시드 변형에 있지만 치명적인 (뜨거운 더 낫다). PEG의 침전 공정이 사용되는 경우에도 무균 브로스 배지가 배양 상등액에 동일 처리 대조군을 포함하는 것이 유익 할 것이다. 이 활동을 죽이는 샘플 상등액 내의 잔류 PEG 또는 클로로포름의 결과가 아닌지 확인합니다. 박테리오파지 및 박테리오신 모두 매우 구체적인 경향으로서,이 균주의 소정 조합으로 명백한 살상 능력 발생하지 것은 드물지 않다. 이 균주 별 재 다양한에서 발생할 수 있습니다sistance 메커니즘은, 하나는 테스터의 변형이 부족하거나 주어진 박테리오신 또는 박테리오파지 타겟팅에 필요한 수용체의 알 수없는 버전이 하나 있다는 것을. 다른 방법은 박테리오신 스크리닝 방법은 가와이 동부 등에 의해 설명되었다. 하지만, 단점을 앓고 널리 (16)을 채택되지 않았습니다. 특히,이 기술은 부담이 될 수 시간 간격으로 국물 샘플을 관찰이 필요하며, 파생-박테리오파지 및 박테리오신 유래 살인 활동 사이의 차별을 허용하지 않습니다. 이 기술의 주요 한계는 잘 견고하게 성장하지 않는 (따라서 쉽게 식별 할 지우기 영역이 부족합니다) 또는 견고 실험실 조건에서 생산되지 않는 항구 prophages 또는 박테리오신을 생물에 적합하지 않은 것입니다. 이 기술의 적응력 유틸리티를 확장 할 것입니다 모두 환경 시료에서 생산 박테리오신을 감지이 기술의 것은 자연 환경 내에서 박테리오신의 역할에 더 큰 통찰력을 용이하게한다.

최근 항생제 내성 병원균 1,2 퇴치에 사용하기 위해 미생물 생태에 대한 이해 (다양한 환경의 특히 microbiomes)뿐만 아니라 새로운 항균 화합물을 심화에 상당한 관심이 있었다. 이러한 이익 사이의 상호 테마는 자연 환경에서 박테리아 균주 간의 대립 상호 작용을 이해하는 것입니다. 박테리아가 경쟁 3 길항하는 여러 가지 방법이 있습니다. 박테리오신, 단백질, 항균 화합물의 다양한 그룹은 긴 녹농균 4,5 및 대장균 (6), 중요한 인간 병원체되는 대부분의 연구 종의 두 가지로, interbacterial 길항 작용을 매개의 역할에 대한 연구되어왔다. 박테리오신 외에도 유도 prophages 또한 변형 이미 7 식민되는 틈새로 침입 할 수 anticompetitor 제로서 작용할 수있다. 슈도모나스 (Pseudomonas)의yringae 단일 단백질 박테리오신 8 테일 박테리오파지 유래 박테리오신 9 (라 tailocins)뿐만 아니라 비 - 단백질 이차 대사 산물 (10)를 포함하여 항균제의 어레이를 생성하는 것으로 알려진 식물 병원균이다. 최근 이러한 항생제들은이 식물 병 (11)를 제어 할 무력화 할 수있는 방법뿐만 아니라,이 생물의 생태에 영향을 미치는 방법을 이해 관심이 있었다. 박테리오신과 박테리오파지 모두 연구를위한 널리 이용 방법은 부드러운 한천 오버레이 기법이다. 이 방법은 첫 번째 박테리오파지 12, 13을 열거 돕기 위해 1936 년 gratia에 의해 설명되었다. 다음은 (세 가지 항균제 중에서 박테리오파지 구별에서 표적 유전자 조작 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전과 함께, 연질 한천 오버레이 방식의 적용을 설명 고분자 BACT하나의 균주에 의해 생산 eriocin 및 저 분자량 박테리오신). 이 방법의 장점은 그것이 확실히되는 &#39;로우 테크에도 불구하고, 그것은 여전히 ​​널리 이용되는 이유이다 비교적 간단하고 저렴한 점이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:140px;">sc-3514</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34854</td>
			<td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Glycol (PEG)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacteriological grade agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-274</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

소프트 한천 오버레이 기술은 원래 70 년 전에 개발되어 널리 박테리오파지 및 박테리오신, 단백질 항균제와 작업을 포함하여 미생물 학적 연구의 여러 분야에서 사용되고있다. 이 방식은 최소 리소스 요구, 비교적 저렴하다. 이 기술은 (독성 화합물 (들)에 민감한) 세균 시험 균주로 접종하는 응고 부드러운 한천 오버레이 상 (잠재적으로 독성 화합물 (들)을 은닉) 도너 균주로부터 상층 액에 얼룩을지게로 구성되어 있습니다. 우리는 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)의 라이브러리가 종내 살인에 대한 균주 화면이 기술을 이용했다. 침전 단계 및 표적 유전자 결실이 방법을 조합하여, 동일한 균주에 의해 생성 된 다수의 화합물은 독성이 구별 될 수있다. 일반적으로이 기술을 사용하여 복구 두 대립 에이전트는 박테리오파지 및 박테리오신 있습니다. 이 두 에이전트를 사용하여 구별 할 수있다이 간단한 추가 시험. 박테리오파지를 포함하는 상층 액에 일련의 희석을 수행하면, 큰 희석 수가 적게되고 개별 플라크 발생하는 반면 더 희석 균일 더 혼탁하게 지우기 영역을 초래할 것이다 박테리오신을 함유하는 상층 액 용액을 희석. 박테리오신의 희석으로 인해, 신선한 부드러운 한천 잔디로 전송하는 경우 박테리오신은 청소 영역을 생산하지 않습니다 반면, 동일한 균주 접종 신선한 부드러운 한천 오버레이에 발견하는 경우 또한, 박테리오파지는 청소 영역을 생성합니다.

연질 한천 오버레이 PEG 침전의 조합은 동일한 균주에 의해 생성 된 다른 항균제를 확인하고 특성화 할 수있다. 도 1은 동일한 종의 세번째 변형에 의해 억제된다 P. syringae (A 및 B)의 두 가지 변종을 도시한다. 두 균주는, 그러나, 상이한 박테리오신에 의해 억제된다. 균주 A의 클리어 존 변형 B의 클리어 존 큰 반면, 날카로운 모서리를 나타내는 한 비 선명한 경계를 나타낸다. 특히 A와 B가 서로 다른 박테리오신에 민감한 균주 (박테리오신 부족) 확인 박테리오신 제 (부족 tailocin) tailocin 또는 저 분자량를 비활성화 생산중인 균주 내에서 유전자 조작. 도 2는 박테리오파지 매개 살상 희석 계열을 비교하여 다른 비 - 복제 성 항생제 구별 될 수 있음을 보여준다. 모두 박테리오신 때문에파지은 마이 토마 이신 C 처리에 의해 유도 될 수 있으며, 이들 두 제제의 활동들은 면밀히 (활성화 파지 풍부한 경우 특히)이 서로 유사 할 수있다. 박테리오신 매개 삭제가 이러한 플라크로 해결되지 않습니다 동안 박테리오파지 매개 청산의 경우, 상층 액의 희석 개별 플라크 (클리어 존)으로 해결됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> 그림 1 : 동일한 균주에 의해 생성 된 여러 항균제의 표현형 차이. tailocin 결핍 균주에서 삭제 부족 아닌 박테리오신 결핍 균주에 의해 입증 균주 A는 다른 저 분자량 박테리오신 고분자 박테리오신 (tailocin) 아니라 민감하다. 반대로, 변형 B는 tailocin 둔감하지만, 저 분자량 박테리오신 민감하다. tailocin는 effic입니다저 분자량 박테리오신이없는 동안 iently, PEG 침전 다음 회복되었다. WT는 야생형을 =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> 그림 2 : 비 복제 성 항균제 및 박테리오파지 사이에 구별. 적은 수많은 될 개별 플라크에서 박테리오파지 결과 (높은 역가 탑, 낮은 역가의 바닥)의 높은 역가의 (A) 희석. 각각의 플라크로 해결되지 않는 균일 이하 청산에 박테리오신 결과 (B) 희석. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K 조회수.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

비디오: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

사용<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 모델 생물로 공부하기<em&gt; 레지오넬라 뉴모 필라</em&gt; 감염

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; Entamoeba 아메바</em&gt; 감염

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

결핵 균복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추동물 갤러리아 멜로넬라 사용

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...