이 연구는 NIDCR / NIH에서 R01DE023348 (RHK)와 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 부문의 학술 상원의 연구에 이사회에서 학부 연구 그랜트 (RHK)에 의해 지원되었다.

마우스는 잭슨 연구소에서 구입하여 실험 동물 의학의 UCLA과 (DLAM)에서 병원균이없는 동식물 사육장에 보관 하였다. 실험은 교육감의 동물 연구위원회 (ARC 번호 2016-037)에서 승인 된 기관의 지침에 따라 수행 하였다. 1. 마우스 마취 <ol><li> 8 주 된 암컷 C57 / BL6 마우스를 사용하여 (n = 3)를 나타낸다. </li><li> 케타민 (마우스 체중의 80 ~ 120 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 밀리그램 / 마우스 체중 kg) 솔루션을 사용하여 마우스를 마취 및 10 ㎖ / kg의 용량으로 복강 내 (IP) 투여. </li><li> 케타민 준비 (80-120 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏) 용액 및 10 ㎖ / kg의 용량으로 복강 내 (IP)을 투여. </li><li> 쥐가 완전히 발가락 핀치를 수행하여 마취되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 2. 펄프 캐핑 절차 <ol><li> 마우스의 입에서 입 홀더를 배치합니다. </li><li> 그는 그 같은 테이블에 입 홀더를 고정광고가 위쪽으로 직면하고있다. </li><li> 첫 번째 상악 대구치가 완전히 볼 수 있도록 입의 상단에있는 현미경 (10X)를 놓습니다. </li><li> 펄프 투명 상아질 통해 보일 때까지 20 rpm으로 고속 핸드 피스의 ¼ 라운드 버를 사용하여, 중간 치아의 에나멜 부분을 제거한다. 버와 펄프를 노출시키지 마십시오. </li><li> A # 15 근관 K-파일 (150 μm의 직경)를 사용하여 상아질을 통해 천공 및 펄프를 노출합니다. 참고 : 상아질 파편이 펄프로 밀어되지 않도록 특별한주의가 요구됩니다. 이 분기마다 K 파일을 회전하고 출력이 K-파일 당겨 회피 할 수있다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 멸균 H 2 O와 MTA를 섞는다. 제공 및 탐색기의 끝 노출 된 펄프에 MTA에 배치합니다. 부드러운 감청에 의해 노출 된 펄프로 MTA를 포장하는 종이 포인트 (미세)의 뒷면을 사용합니다. 용지 점의 두꺼운 측이 평평하기 때문에 허용노출 된 펄프에 MTA의 적절한 응축. </li><li> 단지 치아를 커버하는 35 % 인산 에칭액을 배치하여 15 초 동안 에칭 치아. 이 잇몸 조직을 자극 할 수 있으므로, 에칭의 배치를 제한하기 위해 특별한주의하십시오. 주 : 에칭액 주사기오고 치과 접착제 치아에 마이크로 기계식 결합을 매개하는 데에 흐를 수 있도록 치아 표면을 거칠게하는 데 사용된다. 그들은 점성 때문에 독립적 치아에 직접 적은 양을 적용함으로써 할 수있다. </li><li> 에칭 제를 제거하는 음의 압력을 흡입을 사용합니다. 가볍게 에칭의 잔류 물을 제거하기 위해 H 2 O에 배어있는 면봉을 사용합니다. 에칭이 완전히 치아에서 제거 될 때까지이 단계를 반복합니다. </li><li> 압축 공기 살포기를 사용하여 부드럽게 치아를 건조. </li><li> 용지 포인트의 뒷면을 사용하여 치과 용 접착제를 적용한다. </li><li> 3 초 동안 압축 공기를 이용하여 상기 접착제 층이 얇게. </li><li> 기음URE 경화 백라이트 유닛을 사용하여 20 초 동안 치과 용 접착제. </li><li> MTA와 모자를 씌웠다 치아에 소량의 유동성 복합 놓습니다. 치아 홈에 복합 흐름에 탐색기의 팁을 사용합니다. </li><li> 이를 중합 광 경화 유닛을 이용하여 30 초 동안 복합 치료. 복합 완전히 경화 하드 탐색기를 사용하고 있는지 확인합니다. </li></ol> 3. 수술 후 케어 <ol><li> 즉시 펄프 캐핑 시술 후 카프로 펜 (5 ㎎ / ㎏) 피하 (SC)를 관리 할 수 ​​있습니다. </li><li> 그들이 일어나 전에 따뜻한 동물을 유지하기 위해 낮은 전력으로 가열 패드에서 마우스를 놓습니다. </li><li> 주택의 동식물 사육장에 마우스를 돌려줍니다. </li></ol> 4. 조직 조달 <ol><li> 오 후 - 육주, 이소 플루 란과 완벽한 마취 상태에서 자궁 전위에 의해 쥐를 안락사. </li><li> 조심스럽게 두개골의 바닥에서 상악를 제거하고 50 mL의 관에 넣어. entir 수정밤새 39 ° C에서 펄프 캡핑 치아와 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드, pH가 7.4 반대측 캡핑 치아를 모두 포함하고, 그 다음 70 % 에탄올 용액에 보관 전자 상악. 참고 : 파라 포름 알데히드는 독성 및 발암 성이다. 표준 운영 절차 (SOP)에 설명 된대로 적절한 사용 파라 포름 알데히드를 모니터링해야한다. </li><li> μCT 검사를 사용하여 마우스 상악를 스캔합니다. 70 % 에탄올에 적신 거즈로 샘플을 포장하고, 15 mL의 세포 배양 튜브에 배치, 스캔하는 동안 상악을 확보합니다. </li></ol> 5. μCT 검색 <ol><li> μCT 검사를위한 샘플을 준비합니다. 간단히, 70 % 에탄올에 적신 거즈로 샘플을 포장 및 일반 15 mL의 세포 배양 원뿔 튜브를 고정합니다. 제조업체의 지침에 설명 된 바와 같이, μCT 스캔 무대에 튜브를 장착합니다. </li><li> 145 μA의 전류 55 KVP의 전압, 및 (2)의 노광 시간으로 X 선 소스를 설정00 밀리. </li><li> 20 μm의 해상도와 0.5 mm 알루미늄 필터로 μCT 스캐너로 이미지 수집을 수행합니다. </li><li> 이미지를 재구성하고 (11)를 시각화. </li><li> μCT 검사가 완료되면 2 주 동안 5 % EDTA와 PBS에서 4 %의 자당 (PH 7.4)와 탈회를 시작합니다. </li></ol> 6. 조직 가공 및 염색 <ol><li> 파라핀의 탈회 조직을 포함. 삽입하기 전에, 바로 첫 번째 어금니에 전방 시상 절단하여 상악 트림. 매립하면서 제 몰의 종단면은 절단면이되도록 하향으로이 표면의 위치. </li><li> 마이크로톰을 사용하여, 5 μm의 두께의 슬라이드를 준비합니다. 펄프 캐핑 영역은 일반적으로 표식으로서 사용될 수 distopalatal (DP) 루트와 일치한다. 광학 현미경 하에서 조직 학적 검사 및 μCT 이미지를 비교하여 관심의 정확한 영역을 결정합니다. </li><li> H &amp; E 염색, depara에 대한ffinize 자일 렌 (2 배)와 직렬로 희석 한 에탄올 (100 % EtOH로 배, 95 % EtOH로 배, 70 % EtOH로 1 배)로 슬라이드를 재수. </li><li> 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻어. </li><li> 2.5 분 헤 마톡 실린 용액으로 얼룩 및 수돗물로 씻어냅니다. </li><li> 1 분 동안 95 % 에탄올에서 슬라이드 딥. </li><li> 1 분 에오신 용액으로 얼룩 및 수돗물로 씻어냅니다. </li><li> 희석 한 에탄올 (70 % EtOH로 1 배, 95 % EtOH로 2 배, 및 100 % EtOH로 3X) 및 크실렌 (3x)로 탈수. </li><li> 솔루션을 장착와 슬라이드를 탑재합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

현재 치과 펄프 줄기 세포 (DPSCs) (13)의 치성 분화에 치과 재료, 비계, 또는 성장 인자의 생체 내 효과를 검증 할 수 여러 가지 실험 모델이있다. 이 모델은 신장 캡슐 기관에 DPSCs의 자궁외자가 이식, 또는 비계 14, 15와 면역 저하 마우스로 DPSCs의 피하 이식을 포함한다. 그러나, 이들 방법은 DPSCs 그들의 원성 효과는 동소 펄프 환경에서 수행되지 않도록 제한된다. 한편, 치아의 펄프 펄프 캡핑 절차에 동소 이식 큰 동물 (16, 17)에 사용된다. 이러한 모델은 동소 환경 원성 잠재력을 평가하는데 유용한 있지만, 이들 모델의 사용은 펄프 상처 치유 및 수복 상아질 형성 제한된 기계적 통찰력을 제공하는 자연에서 주로 관찰된다. </P&gt; 본 논문에서는 생쥐에서 펄프 - 캡핑을 수행 할 수있는 구체적인 방법을 제시한다. 이 단계별 절차는 스캔 μCT와 분석, 펄프 캐핑 물질을 배치 상악를 수확, 클래스-I와 같은 공동을 준비하고, 쥐를 마취하고, 수복 상아질 형성을 위해 조직 샘플에 대한 평가를 포함하고 있습니다. 우리의 펄프 캐핑 마우스 모델은 연구 커뮤니티에서 널리 사용할 수있는 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스의 사용을 가능하게하여 수복 상아질의 맥락에서 생체 내에서 치수의 상처 치유의 기본 분자 메커니즘을 조사하는 수단이 될 것입니다. 최근의 연구는 상아질의 형성 (18, 19)을 관찰하는 몇 가지 마우스 모델을 선보였습니다. 사이토 등. 반동이 아니라 복기, 상아질의 형성을 자극 펄프 노출이없는 클래스 I-같은 준비를 만들었습니다. 반동 상아질과 수복 상아질 모두 차 상아질로 분류됩니다어느 치아에 외부 자극에 따라 형성한다. 그러나, 기존 아세포에 의해 형성되는 반동 상아질 달리 수복 상아질이 노출 펄프 해지고 odontoblastic 층 (20)을 벗어나 같은 DPSCs 같은 상아질 모세포와 같은 세포에 의해 형성된다. 따라서, 임상의 실제 펄프 캐핑 순서를 나타내지 않는다. 또 다른 연구에서, 유리 이오노머 펄프 노출 19 캡핑 하였다. 그러나, 임상 연구는 유리 이오노머 만성 염증을 유발하지만, 복기 (21) 상아질없는 것으로 나타났다. 이와 관련하여, 더 나은 펄프 캐핑 마우스 모델은 환자의 실제 펄프 캐핑 절차를 나타낸다. 우리가 6 개 이상의 주 후에 마우스를 수확 할 때, 수복 상아질 형성 펄프 챔버와 근관 (그림 4)에 걸쳐 발생했음을 주목할 만하다. 이러한 관찰은 우리가 6월에 수복 상아질 형성 예상대로가 아니라 예기치 않은펄프 캐핑 물질 펄프 사이 ction. 그러나, 펄프 강력한 광물은 특히 비교적 젊은 환자 (22)에, 임상 설정에서 관찰된다. 본 연구에서 사용 된 8 주령 생쥐 &quot;청소년&quot;23 인 것으로 간주되기 때문에 이러한 마우스는 여전히 상당한 원성 잠재력을 품고있다, 가능성이 존재한다. 따라서, 마우스 수복 상아질 형성의 노화 효과를 조사 할 가치가있을 것이다. 우리의 조직 ​​학적 검사를 수복 상아질이 명확하게 펄프 덮인 치아에 형성되었다하더라도 복기에 상아질 세관의 존재 (빨간색 화살표) 및 골 세포 (블랙 화살촉)에 의해 입증, 모두 상아질과 뼈 형성의 특성이 있었다, 밝혀 상아질 (그림 5). 이러한 관찰은 수복 상아질 형성 로컬 상아질 모세포 형 치과 펄프 줄기 세포뿐만 아니라 infiltratin을 존재에 의해 유도 될 수 있음을 시사주변의 뼈에서 g 중간 엽 줄기 세포. 타르트 레이트 저항성 산성 포스파타제 (TRAP) 염색에 의해 측정 상아질 형성 세포에 비해, 우리는 펄프 내에 상아질 - 재 흡수 세포 발견 (데이터는 보이지 않음). 실제로, 치수의 염증 또는 치근단 치아 주위 뼈 표면에 파골 세포 형성을 유도하지만 인해로서 아직 알려지지 않은 메카니즘 (24) 상아질 표면. 참고로, 기존의 상아질과 새로 형성된 수복 상아질 (그림 4) 사이에 명확한 경계가 있었다. 이전의 연구는 유사한 현상을 보여 주었다; 치아가 비스포스포네이트 또는 파골 세포의 기능을 억제하는 둘 항 RANKL 항체의 존재 하에서 추출되는 경우, 기존의 층판 뼈 새로 형성된 뼈 직포 25 들간 무사 (武士)가 있었다. 이러한 개념은 상기 펄프 상아질 - 재 흡수 세포의 유무를 지원한다. 종합적으로, 우리의 설립 마우스 모델은 P 것펄프 상처 치유 및 생체 수복 상아질 형성의 메커니즘을 조사하는 독특한 기회를 rovide. 펄프 캐핑 마우스 모델에 한계가있다. 인간과 쥐 사이의 유전 메이크업은 분명히 다르다. 전체 게놈 인간 및 마우스에서 서열화되었으며, 마우스 및 인간 (26, 27)의 단백질 코딩 영역에서 약 85 %의 유사성이있다. 이 개념에 부합에서는 동물 캡 펄프에 관한 연구 결과는 반드시 인간 (28) 사람들을 반영하지 않는 것을 제안했다. 그럼에도 불구하고, 동물 모델은 광범위하게 류마티스 관절염 (29), 전신 쇼크 (31) 골다공증 (30), 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 관리를위한 ovariactomy 유발 뼈 손실 및 합자 콜라겐 유도 관절염과 같은 생체 내에서 인간의 질병을, 요점을 되풀이하는 연구 커뮤니티에서 사용되는 치주염 (32)에 대한 배치. 예컨대, 펄프 캐핑 각서로서SE 모델 펄프 상처 치유 및 생체 수복 상아질 형성의 분자 메커니즘을 조사하는 것이 필수적 일 것이다. 그럼에도 불구하고, 단지 다른 동물 모델, 해석 및 펄프 캐핑 마우스 모델에서 연구 결과의 검증과 같은주의 깊게 평가되어야한다. 요약하면, 본 연구는 쥐 캐핑 성공적인 펄프를 보여준다. 다른 알려진 모델과는 달리,이 펄프 캐핑 마우스 모델은 펄프 재생 및 수복 상아질 형성이 제공하기 때문에의 분야에서 매우 중요한 연구 도구를 제공합니다 : 상기 기본 메커니즘을 규명하기 위해 널리 사용되는 유전자 조작 마우스 균주를 이용하기 1) 기회 분자 수준 2) 경제적으로 효율적인 방법은 샘플의 크기를 증가시킴으로써 유의 한 결과를 얻었다. 또한 연구는 생체 내에서 수복 상아질 형성의 목적 정량, 수복 상아질 형성의 연령에 따라 효과, evalua을 포함 기다리고 있습니다임상 적으로 사용 가능한 펄프 캐핑 물질의 기, 적절한 치수의 상처 치유와 수복 상아질의 재생에 필요한 분자 결정의 유효성 검사.

Dental caries are one of the most prevalent oral diseases and the leading cause of surgical interventions to dentitions in almost all individuals1,2. The prognosis of surgical interventions and restorations of a tooth largely depends upon proper pulpal response and successful wound healing. Indeed, dental caries that penetrate deeply through the enamel and dentin frequently lead to the exposure of the underlying pulp tissue that is often "capped" with dental materials, such as calcium hydroxide (Ca(OH)2) or hydraulic calcium-silicate cements (HCSCs), including mineral trioxide aggregates (MTA). The ultimate goal of such a pulp-capping procedure is to expedite pulpal wound healing by regenerating reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" to protect the underlying pulp tissue and to increase the life expectancy of the tooth and the overall oral health. However, the underlying mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is not fully understood.
To better understand the mechanisms of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo, several animals were previously used, including monkeys, dogs, and pigs3-5. Among them, rats are frequently used because they are relatively smaller in sizes compared to the other animals, but their teeth are large enough to perform direct pulp capping without any technical difficulties6-10. These animal models are ideal alternatives to human studies for examining pulpal responses and reparative dentin formation. However, their utilization is limited to observational studies at the cellular level, and they scarcely provide mechanistic insights during reparative dentin formation at the molecular level.
Recent technical advances in genetic engineering provided invaluable and indispensable research tools-mice that harbor a gene that is either overexpressed or deleted-that are instrumental to studying molecular mechanisms of human diseases in vivo. The numbers of different strains of transgenic or knockout mice that are strategically inducible in a cell-specific manner are continually growing in the scientific community. Therefore, examining pulpal wound healing and reparative dentin regeneration in these mice would greatly help to expedite our understanding of these processes at the molecular level. However, the use of mice is significantly dampened, as performing a pulp-capping procedure on a mouse tooth is technically challenging due to its miniature size. Here, we present our reproducible method of performing direct pulp capping in mice for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

<table><tbody><tr><td>BM-LED stereo microscope</td><td>MEIJI Techno</td><td></td><td>Microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Optima MCX-LED&amp;nbsp;</td><td>Bien Air Dental</td><td>1700588-001</td><td>Electic motor engine</td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Henry schein animal health</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td></td></tr><tr><td>1/4 round bur</td><td>Brasseler</td><td>001092T0</td><td></td></tr><tr><td>Endodontic K-file</td><td>Roydent</td><td>98947</td><td></td></tr><tr><td>ProRoot MTA</td><td>Dentsply</td><td>PROROOT5W</td><td>MTA</td></tr><tr><td>Paper point</td><td>Henry schein</td><td>100-3941</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Etch</td><td>Ultradent product Inc.</td><td></td><td>Phosphoric acid etchant</td></tr><tr><td>OptiBond SoloPlus</td><td>Kerr</td><td>29669</td><td>Adhesives</td></tr><tr><td>Coltolux LED</td><td>Coltene/whaledent Inc.</td><td>C7970100115</td><td>Curing light unit</td></tr><tr><td>Characterization tint</td><td>Bisco</td><td>T-14012</td><td>Flowable composite</td></tr><tr><td>Skyscan</td><td>Breuker</td><td>1275</td><td>uCT scanner</td></tr><tr><td>Microm</td><td>Thermo</td><td>HM355S</td><td>Microtome</td></tr><tr><td>Hematoxyline-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>7221</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-16</td><td>Mounting solution</td></tr></tbody></table>

development of a direct pulp-capping model for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

여기서는 마우스 치아 캐핑 펄프 수행 단계별 과정을 나타내었다. 마우스에서 캐핑 펄프의 중요한 측면 중 하나는 적절한 장치를 가지고있다. 이와 관련하여, 10 배의 전력 배율 현미경을 갖는 것이 필수적 (도 1a)이다. 치아의 클래스 I-같은 준비를 만들려면, 우리는 20 만 rpm으로 (그림 1B)에서 전기 고속 핸드 피스의 ¼ 라운드 버를 사용했다. 대안 적으로, 압축 공기를 사용하는 것을 포함하여 다른 엔진은, 치아를 제조 할 수있다. 그림 2A-2E에서, 펄프 캡을 수행하기위한 대표적인 단계가 표시됩니다. 클래스-I-같은 준비 (그림 2B)를 수행 하였다. 물 스프레이 절차를 수행하는 동안 쥐를 익사 수 있기 때문에, 그것의 사용은 권장되지 않습니다. 이 때문에, 부드러운 intermi으로 치아를 준비 필수ttent 과열을 방지하기 위해 스트로크. 압축 공기의 사용은 또한, 냉각 효과를 제공 할 것을 권장한다. 이 수복 상아질 형성 (그림 2C)의 데이터 해석을 방해 할 수와 같은 근관 파일로 펄프를 노출하는 동안, 펄프에 상아질 파편을 밀어 않도록주의를 취할. 이 압축 공기를 사용하여 회피 할 수있다. 마찬가지로, MTA는 펄프에 너무 누르지 않고 노출 된 펄프에 배치해야합니다. MTA 배치 부드러운 태핑 동작 (도 2d)과 용지 포인트의 뒷면을 사용하여 달성 될 수있다. MTA 위치에 따라, 치아는 치아에 복합의 결합을 방해 할 수 있습니다 홈에 남아있는 MTA를 제거하는 H 2 O-적신 코튼 펠렛을 사용하여 청소해야합니다. 합성 복원 통상적 인 방법은 (유동성 복합체, 치아 표면을 에칭 접착제 프라이밍 본딩 및 배치 및 경화제를 포함하여 사용그림 2E). 6 주 펄프 캡핑 후 마우스를 수확하고, 상위 뷰는 복합는 (그림 3A) 그대로임을 확인하기 위해 촬영했다. μCT 검사는 수복 상아질이 펄프에 형성된 것을 제안, 펄프 덮인 그룹 (그림 3B)에서 치수의 공간의 의미있는 경기 침체를 보였다. 탈회 조직 샘플은 상기 생체 조직 학적 수복 상아질의 형성을 조사 H &amp; E 염색 하였다. 대조군, odontoblastic 층 (OB)는 상아질 (- 4C도 4a)의 가장자리 주위에 띄게 명백 하였다. 반면, 펄프 캐핑 그룹은 치수의 공간 (- 4F도 4d)에 형성된 수복 상아질 (RD)의 상당한 양이었다. 흥미롭게도, 자세히 검사가 수복 상아질 (RD)는 상아질의 전형적인 특성을 전시 것으로 나타났다 (예를 들면,이야<html> 상아질 세관, 빨간색 화살표)를 나타내는 triated 줄뿐만 아니라, 그 뼈의 (예를 들면, 골 세포가 나타내는 갇힌 조골 세포, 블랙 화살촉). 우리는 상아질 매트릭스 단백질 1 (DMP1) 치성 분화 (12)에 대한 마커 염색시 (도 5a 및도 5b)을 캡핑 치아의 것과 비교하면, 우리는 펄프 덮인 치아의 펄프 DMP1 발현이 크게 증가하는 결과 , 수복 상아질이 펄프 내에 형성되었음을 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig1.jpg" /> 그림 1 : 펄프 캐핑 절차에 대한 장비 설치. (A) 마우스 치아를 가시화하는 현미경 (10X). (B) 고속 핸드 피스와 펄프를 노출시키는 클래스 I 제제를 제조하기위한 전기 모터 엔진.= &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig2.jpg" /> 그림 2 : 모자를 씌우는 과정에서 대표 단계. (A) 마우스에서 상악 첫 번째 어금니에 준비되지 않은 치아. (B) 분기 라운드 버를 사용하여 초기 에나멜 제거. 근관 파일을 사용하여 (C) 펄프 노출. 노출 된 펄프 (D) MTA 배치. (E) 치아에 복합 복원 위치. 바는 500 μm의를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54973/54973fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig3.jpg" /> 그림 3 : 임상 프레 젠 테이션 및 μCT Scannin마우스의 펄프 출장 및 캡핑 치아의 g. (A) 펄프 덮인 치아 (왼쪽)와 캡핑 치아 (오른쪽)에 마우스 상악의 교합보기. (B) 상악의 단면 μCT 이미지. 바는 500 μm의를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54973/54973fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig4.jpg" /> 그림 4 : 생체 내에서 수복 상아질 형성의 조직 학적 증거. 100X, 200X와 400X에서 마우스의 상한선 상악 대구치 (AC) H &amp; E 염색. 100X, 200X와 400X에서 마우스의 펄프 덮인 상악 대구치 (DE) H &amp; E 염색. RD = 수복 상아질; 바는 100 μm의 (OB = 상아질 모세포 층을 나타내는 검은 색 화살촉을 =골 세포; 빨간색 화살표 = 상아질 세관). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54973/54973fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig5.jpg" /> 그림 5 : DMP1의 면역 조직 화학 염색. 400X에서 마우스의 상한선 상악 대구치 (A) DMP1 염색. 400X에서 마우스의 펄프 덮인 상악 대구치 (B) DMP1 염색. 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54973/54973fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

우리는 치수의 상처 치유 및 생체 수복 상아질 형성 평가 마우스 치아에 직접 캐핑 펄프를 행하는 단계적인 방법을 설명한다.

치수의의 평가에 대한 직접 펄프 캐핑 모델의 개발 상처 치유와 마우스의 수복 상아질 형성

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.2K 조회수.  The UCLA School of Dentistry.  우리는 치수의 상처 치유 및 생체 수복 상아질 형성 평가 마우스 치아에 직접 캐핑 펄프를 행하는 단계적인 방법을 설명한다. 

비디오: Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

상처 치유의 생쥐 모델

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

연구

의학

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

발생학

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.

뮤린 흥분 상처 치유 모델 및 조직학적 형태화 상처 분석

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Two-Photon Microscopy를 통한 치아 세포의 실시간 추적

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal stem cells and tooth regeneration. These progenitor populations actively divide, move, and differentiate to maintain tissue homeostasis and regenerate lost cells in a responsive manner. However, traditional analyses using fixed tissue sections could not capture the dynamic processes of cellular movements and interactions, limiting our ability to study their regulations. This paper describes a protocol to maintain whole mouse incisors in an explant culture system and live-track dental epithelial cells using multiphoton timelapse microscopy. This technique adds to our existing toolbox for dental research and allows investigators to acquire spatiotemporal information on cell behaviors and organizations in a living tissue. We anticipate that this methodology will help researchers further explore mechanisms that control the dynamic cellular processes taking place during both dental renewal and regeneration.

저자 스포트라이트: Understanding Dynamic Cellular Behaviors in Adult Mouse Dental Tissue Renewal and Repairment(성인 마우스 치아 조직 재생 및 수리에서 동적 세포 행동 이해) 

Ex vivo live imaging is a powerful technique for studying the dynamic processes of cellular movements and interactions in living tissues. Here, we present a protocol that implements two-photon microscopy to live track dental epithelial cells in cultured whole adult mouse incisors.

Ex vivo Live Imaging을 사용하여 마우스 치아 재생 중 세포 분열 및 움직임 조사

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

면역학 및 감염병학

Digital Planimetry for Assessing Wound Closure Kinetics in a Mouse Model

Chronic wounds, due to their high prevalence, are a serious global health concern. Effective therapeutic strategies can significantly accelerate healing, thereby reducing the risk of complications and alleviating the economic burden on healthcare systems. Although numerous experimental studies have investigated wound healing, most rely on qualitative observations or quantitative direct measurements. The objective of this study was to standardize an indirect wound measurement method using digital planimetry, incorporating digital scaling and segmentation. This approach addresses the lack of detailed, step-by-step methodologies for accurate wound assessment. A photodocumentation booth was designed and constructed, and computer-assisted digital planimetry tools were employed to minimize variability in measurements of the wound area, perimeter, and the distance from the wound center to its edges. A circular traumatic wound (5 mm in diameter) was created on the dorsal midline at the shoulder blade level of male CD1 mice (n = 4, 10 weeks old, 30-35 g). Wound evolution was photodocumented for 14 days using the custom-designed photo booth, which controlled lighting conditions, focal distance, and subject positioning. Scaling and wound measurements were performed using segmentation in ImageJ software, and statistical analysis was conducted using statistical analysis software. The kinetics of wound closure showed a slight increase in wound size and perimeter between day 0 and day 2, followed by a gradual decrease until complete closure by day 14. The photodocumentation booth and computer-assisted digital planimetry enabled quantitative measurements with minimal variability. In conclusion, these tools provide a reliable and reproducible method for evaluating wound closure kinetics in pre-clinical models.

Wounds represent a global health challenge. This study developed a standardized photo booth utilizing digital planimetry to minimize wound measurement variability. Monitoring wounds in mice over 14 days revealed an initial increase in wound area and perimeter, followed by gradual closure. This methodology may aid in evaluating wound closure kinetics in pre-clinical models.

마우스 모델에서 상처 봉합 동역학을 평가하기 위한 디지털 플레니메트리

Chronic wounds, due to their high prevalence, are a serious global health concern. Effective therapeutic strategies can significantly accelerate healing, ...

생체공학

새로운 구강 재갈을 사용하여 Pulp Inflammation Mouse Model 만들기 

Establishment of a Murine Pulp Exposure Model with a Novel Mouth-Gag for Pulpitis Research

Pulpitis, a common cause of natural tooth loss, leads to necrosis and loss of bioactivity in the inflamed dental pulp. Unraveling the mechanisms underlying pulpitis and its efficient treatment is an ongoing focus of endodontic research. Therefore, understanding the inflammatory process within the dental pulp is vital for improving pulp preservation. Compared to other in vitro experiments, a murine pulpitis model offers a more authentic and genetically diverse context to observe the pathological progression of pulpitis. However, using mice, despite their cost-effectiveness and accessibility, poses difficulties due to their small size, poor coordination, and low tolerance, complicating intraoral and dental procedures. This protocol introduces a novel design and application of a mouth-gag to expose mouse pulp, facilitating more efficient intraoral procedures. The mouth-gag, comprised of a dental arch readily available to most dentists and can significantly expedite surgical preparation, even for first-time procedures. Micro-CT, hematoxylin-eosin (HE) staining, and immunofluorescence staining were used to identify changes in morphology and cell expression. The aim of this article is to help researchers establish a more reproducible and less demanding procedure for creating a pulp inflammation model using this novel mouth-gag.

저자 스포트라이트: 개선된 마우스 모델을 통한 치과용 펄프 연구 강화

This article presents a streamlined protocol for establishing a pulpitis model in mice using an innovative mouth-gag, followed by subsequent histological analysis.

치수의의 평가에 대한 직접 펄프 캐핑 모델의 개발 상처 치유와 마우스의 수복 상아질 형성

요약

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상처 치유의 생쥐 모델

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

뮤린 흥분 상처 치유 모델 및 조직학적 형태화 상처 분석

Ex vivo Live Imaging을 사용하여 마우스 치아 재생 중 세포 분열 및 움직임 조사

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등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

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Pulpitis 연구를 위한 새로운 구강 개그를 이용한 Murine Pulp Exposure Model 구축

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