This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).

1. 칼라의 머리를 고정하고 파라핀에 임베드 주 : 정착 프로세스의 모든 단계는 흄 후드에서 수행되어야한다. 건강 위험 포즈를하지 않으면 서 메틸 벤조 에이트는, 흄 후드에서 처리되지 않는 경우에 압도 될 수있는 매우 독특한 냄새를 가지고있다. <ol><li> 파리를 마취 전에 클로로포름 15 ㎖의 99 % 에탄올 30 ㎖에 빙초산을 5 ㎖ (클로로포름 및 아세트산을 혼합하지 않음)에 추가하여 Carnoy 용액 50 ㎖를 구성한다. 칼라 평면 놓을 수 완전히 솔루션이 적용되는 것을 보장하기 위해, 이러한 crystalizing 접시 같은 평평한 바닥과 유리 용기에 붓는다. </li><li> CO 2 또는 에테르와 함께 파리를 마취. </li><li> 집게를 사용하여 칼라로 목에 의한 스레드 파리 (최대 대부분의 칼라와 20). 그림 1A에서와 같이, 같은 방향으로 머리를 모두 맞춘 손상 머리 나 눈에 발생하지 않도록 부드럽게해야합니다. </li><li> 파리의 순서가 쉽게 부분에서 식별 될 수 있도록 임의의 위치에서 사인 oculis 파리 (화살표,도 1a)를 포함한다. 실험 파리는 빛 또는 흰색 눈 색깔이있는 경우 또한, 같은 야생형 같은 일부 빨간색 파리, 스레드 그들 사이에 충분한 안료 슬라이드를 염색하는 존재 확인 할 수 있습니다. 하나 이상의 칼라를 사용하는 경우, 칼라 번호와 함께 프로토콜 시트 파리의 순서를 기록한다. </li><li> 4 시간 - 칼라가 완료되면, 3.5에 대한 준비 Carnoy 용액에 넣습니다. </li><li> 적절한 폐기 용기에 Carnoy 솔루션을 덤프 및 에탄올 세척을 시작합니다. 컨테이너 칼라의 배치를 방해하지 않도록 천천히 부어해야합니다. </li><li> 두 번 99 % 에탄올에 30 분 동안 칼라를 씻으십시오. </li><li> 1 시간 동안 100 % 에탄올 칼라를 씻으십시오. overdehydration을 방지하기 위해 시간에 세척을 변경해야합니다. </li><li> 메틸 벤조 에이트의 칼라를 넣어O / RT에서 N. 메틸 벤조 에이트의 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉 용기. </li><li> 흄 후드의 적절한 일회용 용기에 methylbenozate을 따르십시오. (- 57 °의 C 56) 파라핀 왁스 및 메틸 벤조 에이트 (1) 저 융점 : 1의 이전에 제조 된 혼합물을 추가합니다. 이 시점에서, 칼라는 파라핀이 경화되지 않는 것을 확인하기 위해 65 ° C에서 인큐베이터에 보관해야합니다. </li><li> 적절한 일회용 용기에 methylbenozate과 파라핀 혼합물을 붓고, 용융 순수 파라핀 왁스를 부어 칼라에, 65 ° C로 유지. </li><li> 30 분 후 파라핀을 변경하고이 적어도 5 번 반복한다. 적어도 6-8 세척을 수행해야합니다. </li><li> 세척이 완료되면, 약 슬롯 칼라의 크기의 고무 아이스 큐브 트레이에 칼라를 배치합니다. 완전히 덮여 때까지 그들을 녹은 파라핀을 붓고는 O를 강화 할 수 있도록 / N은 (공기 방울을 피하려고). </li><li> 파라핀 블록 contai를 제거닝 아이스 큐브 트레이에서 목걸이. 부드럽게 칼라를 깨고, 면도날을 사용하여 칼라에서 파라핀 블록을 분리합니다. 몸이 칼라에 남아있을 것입니다 동안 머리는 파라핀 블록에있을 것입니다. 블록이 실온에서 유지 될 수있다. </li><li> 칼라를 청소하려면, 빛 세정 깨끗한 파라핀을 제거하고 재사용하기 전에 에탄올 세척 65 ° C에서 deparafinization 에이전트에서 그들을 흡수. </li></ol> 2. 단면 및 설치 <ol><li> 50 ° C까지 가열 플레이트를 따뜻하게. 접시에 개체 소유자 (또는 금속 장착 블록) 및 면도날을 놓고 그들을 따뜻하게 할 수 있습니다. </li><li> 절편의 원하는 방향에 따라 파라핀 (수평 섹션에 대한) 측을 향해 머리와 두 블록 또는 (간단히 접촉 측의 블록을 용융) 가열 장착 블록 (정면 부분에 대한) 위쪽으로 향하도록 연결합니다. 가열 플레이트에서 블록을 제거하고 적어도 10 마일을 위해 냉각 할 수 있도록n은 파라핀이 장착 블록 상에 적절한 시일 충분히 경화되어 있는지 확인합니다. 단차를 방지 할 수만큼 블럭의 표면과 평행하게 정렬 헤드의 열을 유지한다. </li><li> 면도날을 가지고 포함 된 머리와 단지 작은 행이 유지되도록 멀리 비행 헤드에서 과잉 파라핀 트림 (면도날은 쉽게 다듬을 워밍업 할 수있다). 파라핀은 (절편 동안 수행 할 수 있습니다 더 트리밍) 절편 동안 중단되지 않도록 너무 많이 잘라 내지 않도록주의하십시오. </li><li> 마이크로톰의 물체 홀더에 장착 블록을두고 머리의 행의 배향 블레이드의 에지에 가능한 한 평행하도록 보장한다. </li><li> 폴리 -L- 리신 (PLL) 솔루션의 얇은 층을 덮어 현미경 슬라이드를 준비하고 5 분 동안 그들을 건조 할 수 있습니다. 직전에 사용하는 물을 커버. </li><li> 7 μm의 섹션을 잘라 물에 떠있는 슬라이드에 부분의 리본을 전송합니다. &lt;BR /&gt; 참고 : 수평 섹션에 대한 전체 뇌를 얻으려면, 우리는 머리가 완전히 절단 될 때까지 (뇌에 코에서 절단) 눈으로 절단하기 시작할 때부터 리본을 수집합니다. 하나 이상의 슬라이드 전체 머리 필요할 수있다. </li><li> 37 ° C에서 열판에 슬라이드를 놓고 리본이 약 1 분 동안 확장 할 수 있습니다. </li><li> (그것을 떨어져 쏟아져 또는 조직을 사용하여) 과잉의 물을 제거하고 슬라이드 O / N을 건조. </li><li> deparafinization 에이전트 (완전히 섹션을 포함)으로 가득 높이, 수직 슬라이드 염색 항아리에 슬라이드를 배치하여 슬라이드에서 파라핀 왁스를 제거합니다. 60 분 각각 - 30 분의 3 세척을 수행합니다. </li><li> 최종 세척에서 슬라이드를 제거합니다. 슬라이드에 삽입 미디어 2 방울을 놓고 큰 커버 슬립으로 커버. </li></ol> 3. 섹션을 사진 촬영 및 분석 <ol><li> 2 일 - 준비된 슬라이드 1 건조하도록 허용합니다. 그리고, 형광 microsc 그들을 검토푸른 빛 아래 OPE. </li><li> 파리의 방향을 결정하고, 특정 영역에 집중하는 경우 관심 영역을 찾는 저배율를 사용한다. 참고 : SWS 파리 (그림 2 참조)의 경우, 우리는 큰 접합면이 들어있는 부분을 찾아 (일반적으로 40 배 배율) 이미지를 촬영합니다. (그림 3에서와 같이) 전체 뇌를 분석 할 때, 우리는 머리에서 모든 섹션을 스크롤하여 가장 심각한 표현형 또는 공포를 보여 모든 섹션과 섹션을 촬영 중. </li><li> 이중 맹검 분석을 위해 취하고 번호 이미지 유전자형 모르게 이상을 식별하는 행에있는 칼라 수와 헤드의 위치를 ​​기록한다. </li><li> 화상이 촬영 된 후에 촬상 소프트웨어를 사용하여 분석한다. </li><li> 섹션 별 또는 머리 당 공포의 수를 계산합니다. , 액포의 크기를 측정하는 소프트웨어 프로그램에서 이미지를 열고도 선택과 액포를 선택하려면엘. 선택된 액포 화소의 크기를 결정한다. </li><li> 2 μm의 변환을 위해, 포토 취득에 사용되는 확대 한 스테이지 마이크로 미터 교정 슬라이드의 사진을 촬영. 변환 계수를 계산하기 위해 100 ㎛의 2 픽셀의 양을 결정한다. </li><li> 상기 단계에서 계산 된 변환 계수가 픽셀 수를 분할하여 2 ㎛로 총 화소 수를 변환한다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

설명 된 방법은 초파리의 뇌 퇴행을 정량하는 방법을 제공한다. 특정 세포 유형을 계산하는 등의 다른 방법이, 신경 퇴행을 식별하는 데 사용될 수 있지만,이 방법의 장점은,보다 일반적으로 적용 할 수 있다는 것이다. 세포를 계수하는 것은 이들 세포를 확실하게 특정 항체 또는 항상 가능하지 않은 세포 특이 마커의 발현을 사용하여 식별 될 수있는 것을 요구한다. 또한,이 극적으로 다른 결과 아마도 의한 라벨링 및 검출에 사용되는 조건을, 그 방법 (24)을 얻을 수있다 나타났다. 퇴화 세포를 검출하는 또 다른 방법은 그러나 반대로 활성 카스파 제 3과 같이, 이것은 적극적 세포 사멸을 겪는 세포를 식별하지 않고 세포가 사망하면 더 이상 검출하고, 세포 죽음 마커의 사용이다. 여기에서 제안 된 방법의 다른 장점은 오염 인해 autoflu에 필요하지 않다는 것이다시간을 절약하고 오염 조건의 변화에 ​​의한 아티팩트를 최소화 눈 안료 의한 orescence. 또한이 방법을 사용하는 경우, 파리의 눈 슬라이드를 착색하기에 충분한 안료를 가지고 있음을 주목하는 것이 중요하다. 눈 색깔이 너무 밝은 경우, 일부 야생 형을 추가하면 충분하고도 슬라이드에 걸쳐 염색 확인하는 것이 좋습니다 것입니다 칼라 (으)로 운항하는 항공사. 이 방법의 또 다른 장점은 여러 영역 심지어 동일한 헤드에 검사 될 수 있다는 것이다. 우리는 데이터를 표시하지 않지만, 우리는 얇은 피질 30, 36의 망막과 아교 세포 손실 신경 퇴행을 검사하려면 다음 섹션을 사용하고 있습니다. 여기에 설명 된 바와 같이,이 방법은 수평 섹션을 제공하지만, 물품 홀더 상을 용융 할 때 90 ° 파라핀 블록을 설정하여, 하나는 정면 섹션을 얻을 수있다. 따라서,이 방법은 플라이 뇌의 신경 변성의 적절하고 효율적으로 측정 할 수있는 다양한 방법이다. 진공 청소기의 형성 때문에uoles가 AD에 대한 모델을 포함하여 인간의 신경 퇴행성 질환의 많은 플라이 모델에서 관찰 된, PD, 근 위축성 측삭 경화증 (ALS), 및 폴리 글루타민 반복되지 16,37-40 의한 질환,이 메소드에서 퇴행성 표현형을 정량화하는데 사용될 수있다 질병 모델의 다양한. 전반적으로,이 프로토콜은 간단하고, 장치의 초기 설정이 수행되면 쉽게 완성된다. 유의해야 할 사항은 슬라이드 인 경우주의 깊게 섹션이나 머리를 분실하지 않도록주의하여 파라핀 블록을 손질하고, 물에 리본을 overexpand하지, 과도한 탈수 헤드의 피하기 위해 에탄올 세척을 시간이한다 열 블록. 리본이 발생할 수 있습니다 플라이 헤드의 찢어 너무 멀리 확장을 허용하면 리본 머리의 순서가 손실 될 수 있습니다. 또한, 분석하는 동안 유전자형에 무지하면 바이어스를 방지하기 위해 필수적이다. 이것은, SLI를 준비하는 한 사람을함으로써 달성된다데 다른 사람이 사진을 촬영하고 측정을하는 동안 기록을 유지. 이러한 방법의 한계 중 하나는 단지 몇 개의 세포 변성 검출하는 것은 매우 어려울 것이라는 것이다. 그 경우에, 영향을받은 세포 집단의 특정 얼룩이 더 유익 할 것이다. 또한,이 방법은 하나의 세포 자멸사 세포 사멸을 결정하기 위해 그러한 TUNEL 염색과 같은보다 구체적인 방법을 필요로 세포 사멸의 종류를 구별 할 수 없다. 마지막으로,이 방법은 세포 사멸 또한 neuropil에서 액포로 검출 될 축삭 변성, 구별 할 수 없습니다. 우리의 결과에 도시 된 바와 같이,이 방법은 특정 뇌 영역 또는 전체 뇌의 퇴행성 변화를 해결하기 위해 사용될 수있다. 표현형이 매우 강한 경우에 우리의 경험에서, 모든 뇌 영역이 영향을받는 경우에도, 특정 영역만을 분석하는 것이 유용하다. 이로 인해 작업 부하를 감소시키고 영향을 미치지 않는다결과. 우리는 원래 SWS 돌연변이 여러 영역을 분석하고, 하나의 영역을 비교하면 표현형의 진행에 매우 유사한 결과를 관찰하고 모든 영역을 분석 할 때 (데이터 미도시). 그러나, 명확하게 식별 영역으로 인해 상이한 레벨에서 다른 지역 또는 영역의 분석 아티팩트를 회피하도록 선택되어야한다는 것을 주목해야한다. 반대로, 표현형이 비교적 온화한 경우에는, 특정 영역에 액포를 찾을 가능성이 낮기 때문에, 뇌 전체를 분석하는 것이 좋다. 60 일된 파리의 전체 뇌에서 5 공포 - 나이와 관련된 신경 퇴행을 결정할 때 단지 4 결과도 3에 도시 된 바와 같이, 예를 들어, 이는, 경우이다. 전체 뇌에서 공포를 계산하면, 사람은 큰 사람은 여러 섹션을 통해 확장하는 반면 작은 액포는, 하나의 섹션에 표시됩니다 것을 고려해야한다. 형용사의 후자에 관해서는 근접이 같은 공포 여러 부분에 존재하는지 여부를 결정하는 비교적 용이하므로 근접한 부분이 방법을 사용하여 (도 1)는 또 다른 장점을 제공한다. 결론적으로,이 프로토콜은 서로 다른 신경 퇴행성 질환의 많은 초파리 모델을 연구하는데 유용 할 수 있습니다. 개선 또는 원인이나 알츠하이머와 파킨슨 같은 질병을 수정 기본 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 수있는 퇴행성 표현형을 악화 상호 작용하는 단백질을 확인. 이 책에서 우리는 동물이 일반적으로 개발 진보적 인 변성을 감지하지만 노화 동안 변성을 증가 표시하려면이 방법을 사용합니다. 또한,이 방법은 이미 새로 eclosed 파리에 존재해야 발달 결함에 의해 발생되는 퇴행성 변화를 결정하도록 구성 될 수있다.

기대 수명의 증가와 함께, 알츠하이머 나 파킨슨 병 같은 신경 퇴행성 질환은 일반 인구 증가 건강에 위협이되고있다. 국립 보건원에 따르면 115 만명 전세계 기본 상당한 진전이 많은 분야에서 이들 질환의 적어도 일부에 관여하는 유전자와 위험 요인을 식별 하였지만 2050 치매에 의해 영향을받을 것으로 예상되는 분자 메커니즘은 여전히 ​​알 수없는 여부를 잘 이해한다. 예쁜 꼬마 선충과 초파리 melanogaster의 같은 간단한 무척추 동물 모델 생물은 짧은 라이프 사이클, 자손의 많은 수의, 잘 설립 때로는 독특한 유전 및 분자 방법 1의 가용성을 포함한 신경 퇴행성 질환의 메커니즘을 연구하는 실험 다양한 장점을 제공합니다 -12. 또한, 이러한 유기체는 편견 의무가 있습니다신경 퇴행성 표현형에 자신의 악화 또는 의한 개선 효과에 의해 이러한 질병에 기여하는 요인을 식별 할 수있는 상호 작용 화면. 이러한 유전자의 상호 작용을 분석하고 노화 효과를 평가하는 신경 퇴행을 검출하고 그 심각도를 측정하는 정량적 프로토콜을 필요로한다. 숫자 성능 값 13-21을 제공하는 등 후각 학습, 부정적인 geotaxis, 또는 빠른 phototaxis으로 초파리의 행동 측면을 측정 할 때이 평가는 비교적 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이는 뉴런을 카운트함으로써 신경 세포의 생존에 대한 효과를 결정하는 것도 가능하다. PD의 영향, 그리고 심지어 그 후, 결과는 22-24 논란 한 도파민 뉴런 같이 명확하게 식별되는 특정 인구 집중 그러나이 경우에만 가능하다. 여기에 설명 된 프로토콜 파라핀 직렬 섹션을 수행 칼라 방법을 사용하는 방법즉 원래 초파리 25 해부학 뇌 돌연변이를 분리하여 사용하고 Böhl 하이젠 베르크에 의해 개발되었다. 칼라 방법의 사용은 다음에 저온부, vibratome 부, 비닐 부 26-28에 포함하도록 구성되었다. 여기서,이 방법은 퇴행성 신경 표현형 16,21,29-32에 파리 발전 액포를 측정하는 데 사용할 수있는 전체 플라이 헤드의 직렬 부분을 얻기 위해 사용된다. 이러한 측정들은 특정 뇌 영역에서 수행 될 수 있거나 뇌 전체를 커버 할 수있다; 후자의 방법은 노화 동안 관찰 한도 약한 퇴행성 표현형을 식별 할 수 있습니다. 칼라를 사용하는 경우 마지막으로, 20 파리에는 하나 준비로 처리 할 수 ​​있습니다뿐만 아니라 적은 시간이 소요되지만 인해 약간의 변화에 ​​아티팩트를 최소화 제어와 같은 준비 실험 파리의 분석 가능 준비.

<table><tbody><tr><td>Name of the Reagent/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>Collar</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rubber ice cube tray for embedding</td><td>Household store</td><td></td><td>The size can be made-to-fit by glueing in additional walls&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Crystallizing dish</td><td>Fisher Scientific company</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Methylbenzoate</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>Distinct Odor - Use in fume hood!</td></tr><tr><td>Low Melting Point Paraffin Wax</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>Make sure to keep extra melted in a 65&amp;deg;C waterbath</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>Three different containers for washes</td></tr><tr><td>Vertical Staining Jar with Cover</td><td>Ted Pella Inc.&amp;nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Solution (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

mass histology to quantify neurodegeneration in drosophila

알츠하이머 병 (AD) 또는 파킨슨 병 (PD)와 같은 진보적 인 신경 퇴행성 질환은 전 세계적으로 사람의 건강에 위협이 증가한다. 포유 동물 모델은 병원성의 기전에 중요한 통찰력을 제공하고 있지만, 함께 높은 비용 포유류 시스템의 복잡성은 자신의 사용을 제한하고 있습니다. 따라서, 간단하지만 잘 확립 된 초파리 모델 시스템은 이러한 질병에 영향을 분자 경로를 조사하기위한 대안을 제공합니다. 행동 적자 외에도, 신경 퇴행성 질환 등 신경 죽음과 axonopathy 등의 조직 학적 표현형을 특징으로한다. 신경 세포의 변성을 정량화하고는 유전 적, 환경 적 요인에 의해 영향을받는 방법을 결정하기 위해, 우리는 성인 플라이 뇌에서 공포 측정을 기반으로하는 조직 학적 접근 방법을 사용합니다. 계통 오차의 영향을 최소화하기 위해 직접적으로 제어 및 경험치의 섹션을 비교하나 준비 erimental 파리, 우리는 파라핀 섹션의 &#39;칼라&#39;방법을 사용합니다. 신경 퇴행은 플라이 뇌 개발 액포의 크기 및 / 또는 개수를 측정하여 평가한다. 이것은 하나의 관심의 특정 영역에 집중하거나 완전한 헤드 걸쳐 직렬 부분을 취득하여 전체 뇌를 분석함으로써 수행 될 수있다. 정상적인 노화 중에 발생 따라서,이 방법은, 하나는 심한 변성뿐만 아니라 몇 부분 만 감지 상대적으로 약한 표현형뿐만 아니라 측정 할 수 있습니다.

전체 플라이 헤드를 포함 눈 안료 (33)에 의해 스테인드 시리얼 섹션에 설명 된 방법의 결과를 사용. 이것의 일부는 각각의 헤드의 부분이 위로부터 아래로 도시되어도 1b에 도시된다. 다른 파리에서 섹션이 예에서 왼쪽에서 오른쪽으로 볼 수 있습니다. 방향과 파리의 식별을 용이하게하기 위해, 눈이없는 비행 (사인 oculis)의 위치 3 (화살표, 그림 1B)에서 마커로 삽입됩니다. 신경 퇴행을 정량화하기 위해,이 부분에서 검출 할 수 액포의 형성을 측정한다. 액포가 라운드로 정의된다, 녹색 형광 neuropil 내에서 (그림 2의 화살촉 3) 또는 피질과 어두운 반점은 즉시 뇌의 이상이 연속 섹션에서 볼 수 있습니다. 에 의해 신경 퇴행을 정량화측정 공포는 어느 특정 뇌 영역에 초점을 맞춤으로써 또는 전체 뇌를 분석하여 수행 할 수 있습니다. 뇌의 특정 영역에 분석을 한정하는 것은 돌연변이 만 돌연변이 34 OLK futsch &#39;의 후각 로브 같이 특정 지역에 영향을 미치는 경우에 유용하지만, 모든 또는 많은 심각한 변성가있을 때 또한 사용될 수있다 뇌의 영역. 후자의 예는 모든 공포를 측정하는 것은 너무 많은 시간이 소요 될 것 스위스 치즈 (SWS) 돌연변이 (그림 2)입니다. 그러므로 우리는 측정이 항상 같은 수준에서 수행되었는지 확인하기 위해, 하나의 이미지를 가지고 가고, 우리는 하나 또는 두 개의 섹션에 포함 된 큰 접합면 (GC, 그림 2A)의 수준에서 모든 이미지를했다. 우리는 (데이터 미도시) 1 일된 SWS &#39;1 파리에서 액포 형성을 검출하지 않은 반면하는 기능 상실 형질 35 일부 액포가 검출 I이었다n은 7 일 된 SWS &#39;1 파리 (화살촉, 그림 2A). 14 일 (그림 2B) 21 D (그림 2C)에 파리를 노화 더 진보적 인 성격을 보여주는,이 표현형 증가했다. 전술 한 방법을 사용하여 deutocerebral neuropil (DN)에 액포의 수를 카운트하는 나이 액포의 수가 크게 증가를 확인했다. 또한, 액포에 포함 결합 된 영역은 크게 (그림 2D)을 노화로 증가 하였다. 그러나, 모든 돌연변이 SWS 같은 심각한 표현형을 보여주고, 이러한 경우에는 변성에 차이가 작은 영역에 집중 될 때를 결정하기가 어렵다. 마찬가지로, 노화 중에 발생하는 변성 (그림 3A - C) 아주 가벼운이며,이 표현형을 정량화 할 때 따라서, 우리는 전체 뇌를 분석 하였다. 계시 뇌 모든 액포의 합을 결정이 액포 (도 3d)의 결합 된 영역을 측정 할 때 상당한 연령 증가시키고, 또한이 경우였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54809/54809fig1.jpg" /> 1. 파라핀 직렬 섹션 그림. A) 칼라 방법을 사용하여, 실험 및 제어 파리 한 칼라 상을 나사에 의해 하나의 샘플과 같이 처리 될 수있다. 눈이없는 사인 oculis 파리는 방향 (화살표)을 위해 삽입됩니다. 칼라의 플라이 헤드의 방향을 나타내는 B) 회로도. C)이 이미지에서 다른 비행 헤드에서 섹션은 슬라이드의 왼쪽에서 오른쪽으로 지향하고 있습니다. 슬라이드 위에서 아래로, 동일한 플라이 헤드로부터 시리얼 섹션을 볼 수 있습니다. 이 경우, 사인 oculis 플라이는 위치 세 (화살표)에 삽입 하였다. 섹션은 이상 씻어 형광 눈 안료로 염색<html> 절단 후 섹션. A = 5mm과 C = 0.5 mm의 스케일 바. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54809/54809fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54809/54809fig2.jpg" /> 스위스 치즈 돌연변이 2에 진보적 인 신경 퇴행 그림. 7 기념일 (A), 14 기념일 (B) 21-기념일 (C) 이전 SWS &#39;1 파리에서 파라핀 머리 부. 화살촉은 노화와 개발 액포를 가리 킵니다. 연령 - 관련 퇴행성 액포의 수를 카운트하고 그들의 결합 영역 (D)를 측정함으로써 정량한다. 주사 전자 현미경 분석 파리의 번호가 표시됩니다. 스케일 바는 25 μm의 =. *** p &lt;0.001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54809/54809fig3.jpg" /> 그림 3. 신경 퇴행은 나이가 발생합니다. 10 기념일 (A), 30 기념일 (B) 60-기념일 (C) 이전 야생형 초파리로부터 파라핀 머리 부. 화살촉은 세 파리에서 개발 한 공포를 가리 킵니다. 연령 - 관련 퇴행성 액포의 수를 카운트하고 그들의 결합 영역 (D)를 측정함으로써 정량한다. 주사 전자 현미경 분석 파리의 번호가 표시됩니다. 스케일 바는 25 μm의 =. *** p &lt;0.001. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54809/54809fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. &lt;</a>가 /&gt;

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Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

초파리 널리 신경 퇴행을 연구하기위한 모델 시스템으로 사용된다. 이 프로토콜은, 뇌의 공포 형성에 의해 결정된 바와 같이, 정량 할 수있는 변성하는 방법을 설명한다. 또한 인해 하나의 샘플로 처리 및 절편 제어 및 실험 파리에 의해 실험 절차에 효과를 최소화 할 수 있습니다.

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기<em&gt; 초파리</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

10.1K 조회수.  Oregon Health & Sciences University.  초파리 널리 신경 퇴행을 연구하기위한 모델 시스템으로 사용된다. 이 프로토콜은, 뇌의 공포 형성에 의해 결정된 바와 같이, 정량 할 수있는 변성하는 방법을 설명한다. 또한 인해 하나의 샘플로 처리 및 절편 제어 및 실험 파리에 의해 실험 절차에 효과를 최소화 할 수 있습니다. 

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

에 시금 운동력이있는 사람, 학습, 및 메모리 적자 Drosophila</emNeurodegeneration의> 모델

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

연구

신경과학

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

소독멜라노가스터에서 새로운 신경보호 유전자를 식별하기 위한 생체 전방 유전자 스크린

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

유전학

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

발생학

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 뉴런 변성

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

드로소필라 멜라노가스터에서 축사 사망 시축과 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

신경변성과 관련하여 성인 Drosophila에서 시냅스 퇴성을 시각화

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Direct Cryosectioning of Drosophila Heads for Enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression patterns. Traditional methods often involve challenges such as performing complex dissection, maintaining tissue integrity, and visualizing specific expression patterns during high-resolution imaging. We present an optimized protocol that combines cryosectioning with fluorescence staining and immunostaining. This method improves tissue preservation and signal clarity and reduces the need for laborious dissection for Drosophila brain imaging. The method entails rapid dissection, optimal fixation, cryoprotection, and cryosectioning, followed by fluorescent staining and immunostaining. The protocol significantly reduces tissue damage, enhances antibody penetration, and yields sharp, well-defined images. We demonstrate the effectiveness of this approach by visualizing specific neural populations and synaptic proteins with high fidelity. This versatile method allows for the analysis of various protein markers in the adult brain across multiple z-planes and can be adapted for other tissues and model organisms. The protocol provides a reliable and efficient tool for researchers conducting high-quality immunohistochemistry in Drosophila neurobiology studies. This method's detailed visualization facilitates comprehensive analysis of neuroanatomy, pathology, and protein localization, making it particularly valuable for neuroscience research.

This study presents a simplified protocol for tissue processing involving decapitation, fixation, cryosectioning, fluorescence staining, immunostaining, and imaging, which can be extended to confocal and multiphoton imaging. The method maintains efficacy comparable to complex dissections, bypassing the need for advanced motor skills. Quantitative image analysis provides extensive investigative potential.

향상된 뇌 형광 염색 및 면역 염색을 위한 초파리 머리의 직접 동결 절편

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

Drosophila에서 등쪽 종근 신경근 접합부의 구조적 무결성 평가

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기

요약

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에 시금 운동력이있는 사람, 학습, 및 메모리 적자 Drosophila 모델