저자는 영상에서 그녀의 관대 한 지원, 루스 Zelkha, MS 감사합니다. 이 연구는 ME에 임상 과학자 개발 프로그램 상 K12EY021475에 의해 지원되었다, ARD, 국립 안과 연구소, NIH, 그리고 실명을 방지하기 위해 연구에서 무제한 부여에서 핵심 보조금 EY01792에 R01의 EY024349-01A1을 부여합니다. ARD 연구에서 실명 예방에 대한 경력 개발 상을받는 사람입니다.

동물에서 수행 모든 절차는 비전 연구에서 동물 사용을위한 비전 및 안과 문 연구 협회을 준수합니다. 6 개월 된 남성 / 여성 C57BL / 6J 야생형 마우스에 열네 4 ~ 사용 하였다 : 열 부상 모델 쥐와 대조군 4 개의 (unwounded 각막을). 1. 동물 준비 <ol><li> 는 A 100 ㎎ / ㎏의 케타민 복강 내 주사, 5 밀리그램 / kg 자일 라진 혼합물로 마우스를 마취. 마취 효과를 찍은 후, 마취의 깊이를 확인하기 위해 발가락을 꼬집어; 동물은 반응하지 않아야합니다. </li><li> 이전 각막 손상의 유무를 확인하기 위해 실험을 실시하기 전에 슬릿 램프 아래에서 눈을 검사한다. </li><li> 눈 상에 1 % 염산 tetracaine에 방울을 주입. 60 후 - 90 초, 감각의 부재를 확인하기 위해 각막 반사를 테스트합니다. Proparacaine 염산염 0.5 %를 대신 사용할 수있다. </li><li> 하면 각막 감각의 손실이특정 부드럽게 눈과 눈 주위의 머리에 5 % 포비돈 - 요오드 한 방울을 배치합니다. 1 분 후, 드롭 닦아 또는 공구 팁과 간섭 모발을 방지하기 위해 눈 주위의 머리에 확산. </li></ol> 2. 각막 상피를 연마 <ol><li> 수술 장갑과 가운을 착용 할 것. 멸균 회전 버 멸균 핀셋 : 필요한 도구를 준비합니다. 더 나은 제어를 위해, 구부러진 핀셋을 사용합니다. 절차 동안 멸균 시트에 도구를 놓습니다. </li><li> 절곡 핀셋을 사용하여, 비강 측으로부터 덮개를 잡아 부드럽게 눈 proptosing 의해 눈을 안정화. 너무 많은 압력을 사용하지 마십시오. </li><li> 수술 현미경 배로 멸균 회전 숫돌을 사용 윤부 주변 360 면도. 라운드 당 6 초 - 5의 속도로 윤부 주위에 이동합니다. 주 : 버가 하나의 고정 속도를 가지고있다. 그러나, 기존의 속도로 회전하는 상기 &quot;최종 너트&quot;완전 체결한다. </li><li> 회전 버와 윤부하는 윤부에서 전체 각막 상피를 제거합니다. 더 나은 결과를 위해, 원형 방식으로 도구를 이동하고 각막 표면에 다소 평행의 팁의 측면에서 작동하도록 유지. 다시 칫솔질하지 않음으로써 상피 세포가 이미 제거 된 영역을 기질을 손상하지 않도록주의하십시오. 눈에 어떤 압력을 가하지 마십시오. 필요에 따라 브러쉬를 청소합니다. </li><li> 각막에 멸균 인산 완충 생리 식염수 방울을 주입하고 부드럽고 깨끗한 티슈로 모든 분리 된 상피 시트를 닦아. </li><li> 어떤 경우 나머지 상피 면도. </li><li> 수술하는 동안 마우스 꼬리에주의를 기울이십시오. 참고 : 움직임이 발생하면, 마취 깊이가 퇴색하고 추가 주입이 필요합니다. 차 주입 볼륨의 3 분의 2로 한 세 번째는 충분합니다. 마취 약물 치료와 동물을 과다 복용하지 마십시오. </li><li> 또 다른 눈에 사용하기 전에 모든 도구를 소독. </li></ol> 3. 확인 완료 상피 제거 <ol><li> 각막에 1 ㎎ / ㎖ 플루 오레 신 나트륨 한 방울을 적용합니다. 30 초 후 각막을 청소하고 상피 세포의 완전한 제거를 확인하기 위해 코발트 블루 필터를 현미경으로 검사합니다. 참고 : 상피 결손과 각막 영역이 녹색으로 가시화된다. </li></ol> 4. 후 작업 관리 <ol><li> 가열 담요에 동물을 넣고 복구 아래에있는 동안 (그 새장에, 예를 들면) 안전한 장소에 보관합니다. 의식이있는 사람의 회사에서 의식이없는 동물을 보관하지 마십시오. </li><li> 1 % 에리스로 마이신 안과 연고를 적용합니다. 이것은 또한 눈의 건조를 방지 할 수 있습니다. 응용 프로그램을 일주일 동안 항생제 매일 계속합니다. </li><li> kg 프레 노르 핀 피하 절차 후 다시 12 시간 후 / 0.1 mg을 주입한다. 이틀 동안 두 번 하루에 주사를 계속합니다. </li><li> 마취에서 완전히 회복 될 때까지 45 분 - 30 동물을 관찰한다. 노트: 복부 표면에 호흡 근육의 가벼운 운동은 복구 아래에있는 동안 동물의 건강을 나타냅니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Afsharkhamseh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+limbal+stem+cell+deficiency+after+mechanical+and+thermal+injuries+in+mice.">Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice.</a> Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).</li><li>Dor&#224;, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+the+adult+mouse+corneal+epithelium+supports+the+limbal+epithelial+stem+cell+hypothesis+with+intermittent+periods+of+stem+cell+quiescence.">Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).</li><li>Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+and+transplantation+of+human+limbal+stem+cells.">The culture and transplantation of human limbal stem cells.</a> J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+stem+cells:+characterization,+culture+and+transplantation.">Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation.</a> Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).</li><li>He, H., Yiu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+therapy+for+treating+limbal+stem+cells+deficiency:+A+review+of+different+strategies.">Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies.</a> Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).</li><li>Amirjamshidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+fibroblast+conditioned+media:+a+non-invasive+treatment+for+limbal+stem+cell+deficiency.">Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency.</a> Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).</li><li>Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+outcome+following+transplantation+of+ex+vivo+expanded+limbal+epithelium+on+amniotic+membrane+for+total+limbal+deficiency+in+rabbits.">Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+chemically+burned+rat+corneal+surface+by+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells.">Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).</li><li>Bu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+activated+omental+cells+on+rat+limbal+corneal+alkali+injury.">Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.</a> Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).</li><li>Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+corneal+stem-cell+transplantation+in+rabbits+with+severe+ocular+alkali+burns.">Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns.</a> J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride.">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li><li>Huang, A. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+wound+healing+in+the+absence+of+limbal+epithelium.">Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).</li><li>Liu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea-specific+expression+of+K12+keratin+during+mouse+development.">Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development.</a> Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).</li><li>Nakatsu, M. N., Gonz&#225;lez, S., Mei, H., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+limbal+mesenchymal+cells+support+the+growth+of+human+corneal+epithelial+stem/progenitor+cells.">Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+goblet+cells+and+their+niche:+implications+for+corneal+stem+cell+deficiency.">Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).</li><li>McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

이 문서는 LSCD의 마우스 모델을 만들 수있는 재생 가능한 비교적 간단한 기술에 대해 설명합니다. 주목할 가치가이 모델의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 먼저, 화학 11, 12를 사용하는 모델과는 달리, 부상 주로 하부 각막 기질 또는 다른 인공 구조물을 최소화 손상 표면 상피 (및 기저막)를 포함한다. 따라서, 절차가 복잡하고 어려워 윤부 줄기 세포를 대상으로하는 간섭의 결과를 평가할 수있는 양으로 만 한정 염증 및 흉터있다. 리 등의 알에 의해 흥미로운 최근 연구. 수술, 화학 치료법의 다른 조합과 상기 회전 숫돌의 사용을 비교 (10)는 또한 안전하고 토끼 LSCD을 만드는 더 효과적 버어 알았다. 두번째 모델은 적어도 최대 세 달 1 안정적인 것으로 보인다. 이 모델 생성의 사용을 포함회전 버, 마우스 상처 연구를 수행하는 사람들에게뿐만 아니라, 각막 작업 임상의에게 친숙한 악기. 무딘 주걱을 사용을 통해 그 장점은 부상이 더 균일하고 1 재현 할 것입니다. 더 윤부 줄기 세포의 파괴, 윤부 영역 회 처리 하였다. 마우스 눈에 근무 경험을 바탕으로, 두 개 이상의 라운드의 치료는 종종 윤부 혈관을 abrades 출혈이 발생합니다. 경우에, 기술은 다른 동물들에 사용되며,이 단계는 각막 상피의 두께에 따라 수정 될 수있다. 본 연구에서는 0.5 mm 버 팁과 전동 공구를 사용 하였다; 다른 형상 및 크기의 버어 팁도 가능하며 각막 사양에 눈 크기에 따라 대신에 사용될 수있다. 리 등. 10 지속적으로 토끼의 각막과 각막 윤부 상피를 제거하기 적합하도록 2.5 mm 버를보고했다. 최적를 얻으려면결과 윤부 각막 상피는 원형 방식으로 면도하고, 버어의 측면을 사용 하였다. 공구 팁 방해 동물의 머리를 방지하기 위해, 포비돈 - 요오드 드롭 대신 닦아 존재의, 눈 주위의 머리에 확산되었다. 이 천공의 원인이 될 수 도구는, 한 자리에 정적으로 운영되어서는 안된다. 출혈이 발생할 수 있습니다 매우 느린 속도로 윤부를 처리하는 단계; 라운드 당 거의 6 sec의 속도가 C57BL / 6J 마우스의 눈에 적합하다. 이보다 염증과 기질의 혼탁을 유발하므로 다시 닦고 노출 된 기질을 방지하는 것이 중요합니다. 상피 연마하면서 압력이 눈에 적용되지 않아야한다. 절차 후, 각막은 완전한 상피 제거 확인하기 위해 형광 염료로 염색했다. 동물, 복구 중에 안구 건조를 방지하는 것이 중요하다. 제한이 방법은 줄기 세포를 100 % 제거 할 수있다. 또한 다소 운영자 의존과 협력을 제공하는 연습이 필요nsistent 결과. 각막 상피 ​​표현형을 연구 할 때, 전체 마운트 염색이 모델의 결과를 평가하는 가장 좋은 방법입니다. 이 단면에만 각각의 특정 부분에 대한 정보를주고있는 반면 전체 각막 상피는 한번 평가 될 수 있기 때문이다. 이 제어 기술은 다른 동물에서 아마 마우스에 LSCD을 유도하고 있습니다. 그것은 LSCD의 적절한 모델 소설 치료를 연구하고 질병의 병태 생리의 넓은 측면을 발견하기를 제공합니다. 약간의 변형으로, 그것뿐만 아니라 각막 창상 치유, 혈관 및 림프관을 연구에 유용 할 수있다.

각막 상피 ​​세포는 각막의 명확성 및 완전성을 유지하기 위해 필요하다. 그것은 지속적으로 각막과 결막의 교차점에서 윤부 - 좁은 영역에 존재하는 상피 줄기 세포에 의해 수명이 다할 때까지 갱신됩니다. 이러한 자기 갱신 윤부 줄기 세포는 모두 일반적으로 부상 한 후, 각막 상피의 재생에 중요한 역할을한다. 이러한 줄기 세포의 일부 또는 전체 고갈 재발 성 각막 미란, 통증, 각막 흉터 및 신생 혈관, 술잔 세포의 모양을 초래할 것이다 치료, 각막 실명을 떠나는 경우. 이 조건은 윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)로 알려져 있고, 특발성 일 수있다; 유전; 나 때문에 화학 물질 또는 열 손상, 장기간 콘택트 렌즈 착용, 만성 염증 1-6에 인수했다. LSCD에 대한 연구는 적절한 동물 모델을 필요로 그뿐만 아니라 모방 인간의 질병이 있지만 최소한으로 재현 및 지속다른 각막과 안구 구조에 손상 마운트. 이 모델은 치료를 평가하는 분자 및 세포 수준에서 질병의 메커니즘을 명확하게하는 것이 필요하다. 회전 숫돌을 사용하여, 하나 앞에 설명한 바와 같이, 하나의 용이 상기의 이점을 제공하며 3 개월 이상 지속 LSCD의 마우스 모델을 개발할 수있다. 이 연구의 목표는 LSCD의 단순한 재현, 지속 가능한 마우스 모델을 제시하는 것입니다. 회전 버 균등 기본 기질 1 부상없이 상피를 제거하는 편리한 도구입니다. 이는 상처 치유 연구 각막 미란 (7, 8)을 유도하기 위해 사용되어왔다. 마우스에 LSCD를 작성하는 저작물을-제시 기술은 이전에보고되지 않았습니다. 이전보다 복원 오와 함께, 덜 유니폼 부상, 특히 윤부 및 더 많은 변수 표현형 (1), (9)에 무딘 주걱 결과와 상피를 긁어 방법을 소개F 정상 각막 상피 1. 무딘 스크레이퍼 달리 회전 버어도 7, 8, 10 등의 상피 기저막을 제거한다. 줄기 세포를 절단 할 수있는 다른보고 된 방법들은 근본적인 안구 구조에 불필요한 손상을 유도 할뿐만 아니라, 심각한 염증 및 이후 각막 혼탁 또는 원인이 아니라, 수산화 나트륨, N- 헵탄 및 염화 벤잘 코늄 등의 화학 물질의 사용을 포함 상피 편평 상피 화생 11-15. 회전 버 이러한 심각한 합병증과 연관되지 않습니다. 수술 단독으로 또는 화학 물질 10, 11, 16를 사용하여, 윤부 상피를 제거, 수행하는 것이 더 어렵다 작은 눈 (마우스 등) 얇은 각막 윤부 상피 세포와 동물에서 최고의 옵션이 아닙니다. 또한, 놀랍게도, limbectomy는 여전히 10 뒤에 윤부 상피의 일부를 남겨 둘 수 있습니다. 아래 설명 된 기술은 신생 혈관의와 LSCD가 발생합니다환자의 전체 LSCD의 프리젠 테이션을 모방하고 3 개월 이상 1 지속 개발 conjunctivalization. 이 마우스에서 LSCD 또는 상처 치유의 병태 생리, 면역학, 잠재적 인 치료를 연구하는 것을 목표로하는 사람들에게 적합하다. 아마도, 일부 수정과,이 절차는 쥐 또는 토끼 (10)에서 수행 할 수 있습니다. 상기 회전 숫돌을 효율적 상피를 제거으로서, 각막 상피는 마모 / 상처와 관련된 모든 치료 또는 분자 생물학 연구에 관한 모든 연구에 이용 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Rumex International Co, Clearwater, FL</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 16-141</td>
			<td style="width:351px;">0.5 mm burr. Also available from other companies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Surgical microscope</td>
			<td style="width:277px;">Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Wild M691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Digital camera</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Thailand</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Nikon FS-2 slit lamp</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Polyclonal anti-CK12 antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz Blotechnology, CA,</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; SC-17101</td>
			<td>1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Monoclonal anti-CK8 antibody</td>
			<td style="width:277px;">TROMA-I-s, Iowa City, IA</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; AB_531826</td>
			<td>1:50 concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)가 고장 나 각막 상피는 결막로 치환 한 후, 윤부 상피 줄기 세포의 상실의 상태이다. 환자는 재발 성 각막 결함, 통증, 염증, 시력의 손실을 겪고 있습니다. 이전 LSCD의 쥐 모델을 설명하고 다른 두 모델에 비교 하였다. 목적은 두 모방 인간 표현형 및 질병의 병태 생리학 연구와 새로운 치료법을 평가하는 것을 가능하게하기에 충분히 긴 지속 LSCD 일관된 마우스 모델을 제조 하였다. 여기서,이 기술은 더 상세하게 설명한다. 회전 버와 전동 도구는 각막 표면의 녹 반지를 제거하거나 환자의 군 날개 침대를 원활하게하기 위해 설계되었습니다. 원하는 LSCD 모델을 만들 수있는 적절한 장치입니다. 그것은으로, 작은 눈에 작업에 적절하게 좋은 팁과 쉽게 사용할 수, 사용하기 쉬운 도구입니다마우스입니다. 그 응용이 눈에 불필요한 외상 방지 종종 화학적 손상 모델의 경우와 같이 그것을 원하지 않는 손상을 초래하지 않는다. 무딘 스크레이퍼 반대로, 상기 기저막과 상피 세포를 제거한다. 이 프로토콜에서, 윤부 영역은 두 번으로 연마 한 후, 전체 각막 윤부 상피에서 윤부를 면도 하였다. 기질 부상을 방지하기 위해주의 상피가 이미 제거 된 후 각막 표면을 브러시하지 않도록주의한다.

이 기술을 수행 한 후 한 달 이내에, 각막의 100 %가 피상적 인 혈관 신생 개발 (그림 1A합니다. 사진 밝은 필드와 코발트 블루 필터에서 슬릿 램프에 연결된 카메라로 촬영했다). 눈의 18/20 (90 %)에서, 혈관 신생이 전체 각막 표면 (도 1A)을 포함했다. 2/20 (10 %)에서, 혈관 신생 3-4 각막 사분면에서 관찰 되었으나, 여전히 각막 중심에 도달했다. LSCD의 발전을 확인하려면, 전체 마운트 면역 염색 1을 수행 하였다. 이 단계는 프로토콜의 일부가 아닌 목표와 관심에 따라 변경 될 수 있습니다. 세 가지 변화는 LSCD의 지표로 간주되었다 : 사이토 케라틴 (CK)의 부재 (12), 정상 각막 상피 세포 17, 18에 해당하는 중간 필라멘트; CK8의 외관, 간단한 상피 마커 <s업&gt; 정상 각막에 존재하지 않는 (20); 각막 표면에 잔 세포의 존재감. 이전 1,9 바와 같은 각막 상피 표현형을 평가하기 위해, CK12 및 CK8 이중 면역 염색은 3 개월 후 상처 전체 마운트 샘플에 대해 수행 하였다. 잔 세포의 존재는 MUC5AC-잔에 의해 평가 된 세포 특이 점액 - 면역 염색 상피 제거 다음, 19 사십오일 15 일. 술잔 세포의 출현은 시간이 감소시킨다. 최상의 결과를 위해, 부상 후에 염색 채 2 개월 수행하는 것이 중요하다. 그들이 전체 마운트 샘플의 각막 부분에 세포 (MUC5AC) 어떤 CK8없는 또는 받침 달린 명시 CK12-성숙한 각막 상피 세포 (17), 각막 표면 -throughout (18)의 특정 마커 있지만, 보통, 손상되지 않은 각막 (그림 1B) . 정상의 눈에 비해, CK12 식 injur 거의 존재하지<html> Y 모델 각막, 그들은 크게 CK8에 대한 긍정적 인 염색을 표시하고 (그림 1B)를 세포 받침 달린있다. 이러한 관찰은 LSCD의 발전을 나타낸다. 면역 염색 결과를 정량화에 관심이있는 경우, 이미지-J는 별도로 동일한 설정 아래에있는 현미경으로 촬영 한 원본, 변경되지 않은 이미지를 20 면역 염색 밀도를 정량화하기 위해 사용합니다. 요약하면, 전체 마운트 샘플의 각막 부분을 선택하는 지역의 통합 밀도와 면적을 측정하고, 배경 (20)에 대한 보정 밀도를 계산한다. CK8 밀도에 CK12의 비율은 이전에 샘플 (1)의 더 큰 수에 제시 하였다. 컨트롤과 비교하여 감소 된 비율 (정상 각막) 각막 표면의 술잔 세포의 모양 LSCD의 발전을 보여준다. 658 / 54658fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 마우스에 LSCD을 만든 후 각막 표현형. 슬릿 램프 검사는 모든 각막 한 달 (0.5 mm A, 스케일 바)에 의해 신생 혈관의 어느 정도를 개발하는 것을 알 수있다. 정상 각막은 모든 각막을 통해 CK12을 표현하고 있지만 CK8 또는 술잔 세포 (MUC5AC)의 결여이다. CK8와 받침 달린 세포가 각막 (200 μm의 B, 스케일 바)에 표시하는 동안 CK12는 LSCD 모델의 부재. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54658/54658fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다.

간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K 조회수.  University of Illinois at Chicago.  다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다. 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

의 마우스 모델 Utero에 이식

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

연구

의학

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

절연 골격근의 묘 - 기계 분석

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

마우스 폐 삽관 법의 간단한 방법

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of microvasculature at the site of inflammation. Parabiotic partners share their circulating antigens and thus are free of adverse immune reaction. First described by Paul Bert in 18641, the parabiosis surgery was refined by Bunster and Meyer in 1933 to improve animal survival2. In the current protocol, two mice are surgically joined following a modification of the Bunster and Meyer technique. Animals are connected through the elbow and knee joints followed by attachment of the skin allowing firm support that prevents strain on the sutured skin. Herein, we describe in detail the parabiotic joining of a ubiquitous GFP expressing mouse to a wild type (WT) mouse. Two weeks after the procedure, the pair is separated and GFP positive cells can be detected by flow cytometric analysis in the blood circulation of the WT mouse. The blood chimerism allows one to examine the contribution of the circulating cells from one animal in the other.

Parabiotic joining of two organisms leads to the development of a shared circulatory system. In this protocol, we describe the surgical steps to form a parabiotic connection between a wild-type mouse and a constitutive GFP-expressing mouse.

마우스의 Parabiosis : 자세한 프로토콜

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

마우스 리브를 절제하는 수술 : 대규모 긴 뼈 수리에 대한 모델

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

간단한 장치는 빠르게 마우스 소장의 전체 마운트를 준비하는 방법

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

정맥 삽입 위치 모델 : 바이 패스 이식 개통을 연구하기위한 적절한 모델

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...