Name: antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads
Uploaded: 2016-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads at JoVE.com

고용량 자기 단백질 A 또는 자기 단백질 G 비즈 상 1. 항체 캡처 <ol><li> 균일 부드러운 흔들림에 의한 자기 구슬을 다시 일시 중지합니다. 구슬을 분취 때 서스펜션 유니폼을 유지합니다. </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 비드 슬러리의 50 μl를 추가합니다. 10 초 동안 자기 스탠드에 배치합니다. 조심스럽게 저장 버퍼를 제거합니다. </li><li> 항체 결합 버퍼의 250 μl를 추가합니다. </li><li> 혼합하고 10 초 동안 자기 스탠드에 배치합니다. 조심스럽게 결합 버퍼를 제거합니다. </li><li> 구슬에 항체의 50 ~ 100 μg의를 포함하는 샘플의 1.0 ML을 추가합니다. 시료는 세포 배지에서 항체 또는 항체를 정제 할 수있다. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 항체 결합 / 세척 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 놓고 바인딩 / 세척 버퍼를 제거합니다. 이 S 반복두 세척 총 TEP. </li><li> 아민 화학 또는 제 3 항에 티올 화학 제를 사용하여 라벨 항체에를 사용하여 라벨 항체에 제 2로 넘어갑니다. </li></ol> 아민 화학을 사용하여 2. 항체 라벨링 <ol><li> 복합체 항체 <ol><li> 구슬에 아민 결합 버퍼의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 색소 1.0 mg의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 100 μL를 첨가하여 10 ㎎ / ㎖의 아민 반응성 형광 염료 (AlexaFluor 532-SE)를 녹인다. 텍싱에 의해 섞는다. 그냥 사용하기 전에이 솔루션을합니다. </li><li> 항체의 100 μg의에 대한 아민 반응성 염료의 2.5 μl를 추가합니다. 참고 : 일반적으로 반응성 염료의 5 ~ 20 몰 과량을 권장합니다. 그러나, 반응성 염료의 양이 반응이 경험적으로 항체 비율과 고유 항체 속성에 원하는 염료에 따라 최적화 할 필요가에 추가. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. 구슬이 suspensio에 남아 있는지 확인엔. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 항체 결합 / 세척 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 배치합니다. 제거하고 결합 / 세척 버퍼를 폐기합니다. 이 세척의 총에 대해이 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 항체 복구 <ol><li> 구슬로 용출 버퍼의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 혼합기를 사용하여 RT에서 5 분 동안 혼합한다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 중화 버퍼의 5 μl를 포함하는 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 용출 샘플 및 전송을 제거합니다. </li><li> 프로세스를 한 번 더 반복 용출 샘플을 풀. </li><li> 항체 농도 정량 염료 투 항체 비율 섹션 4에 기술 된 바와 같이. </li></ol></li></ol> 티올 화학을 사용하여 3. 항체 라벨링 <ol><li> 항체 감소 <ol><li> 250 μl를 추가티올 결합 버퍼와 혼합. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 제거하고 버퍼를 폐기합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 티올 결합 버퍼의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 2.5 mM의 최종 농도로 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가한다. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 버퍼를 폐기합니다. </li><li> 티올 결합 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 제거하고 버퍼를 폐기합니다. 이 세척의 총에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 티올 결합 버퍼의 100 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 복합체 항체 <ol><li> 색소 1.0 mg의 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 / ㎖에서 10 mg의 티올 - 반응성 염료를 녹인다. 텍싱에 의해 섞는다. 그냥 사용하기 전에이 솔루션을합니다. </li><li> 안티의 100 μg의에 대한 티올 - 반응성 염료의 2.5 μl를 추가신체. 참고 : 일반적으로 반응성 염료의 5 ~ 20 몰 과량을 권장합니다. 그러나, 반응성 염료의 양이 반응이 경험적으로 항체 비율과 고유 항체 속성에 원하는 염료에 따라 최적화 할 필요가에 추가. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 상층 액을 제거합니다. </li><li> 티올 결합 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 놓고 버퍼를 제거합니다. 이 세척의 총에 대해이 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 용출 항체 <ol><li> 구슬로 용출 버퍼의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 혼합기를 사용하여 RT에서 5 분 동안 혼합한다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. neut의 5 μl를 포함하는 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 용출 샘플 및 전송을 제거ralization 버퍼입니다. </li><li> 프로세스를 한 번 더 반복 용출 샘플을 풀. </li><li> 항체 농도 정량 염료 투 항체 비율 섹션 4에 기술 된 바와 같이. </li></ol></li></ol> 4. 계산 염료로 항체 비율 <ol><li> 파장 280nm (A280)에서 상기 염료 (AMAX)에 λmax에서 항체 - 염료 접합체의 흡광도를 측정한다. </li><li> 항체 농도를 계산한다 : 항체 농도 (㎎ / ㎖) A280 = - (CF × 최대) / 1.4 여기서 CF (제조업체에서 제공) 염료 = 보정 계수. </li><li> 염료에 대한 항체의 비율을 계산한다 : 염료 - 투 - 항체 비율 (DAR) = (15 × 최대) / Ab의 농도 (㎎ / ㎖) × ε 염료 여기서, ε = 염료의 흡광의 흡광도 최대 염료의 계수 및 항체의 분자량 = 150,000 다. </li></ol>

<ol>
	<li>Colwill, K., Graslund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome.">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).</li><li>Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeled+antigens+and+antibodies:+the+evolution+of+magic+markers+and+magic+bullets.">Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).</li><li>Day, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+modified+antibodies+as+diagnostic+imaging+agents.">Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).</li><li>Cunningham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+flow+cytometry+and+fluorescent+probes+for+flow+cytometry.">Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099 (2014).</li><li>Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-biotin+technology:+improvements+and+innovations+in+chemical+and+biological+applications.">Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).</li><li>Kraeber-Bodere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoconjugates+for+the+treatment+of+cancer.">Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer.</a> Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).</li><li>Leal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+an+emerging+modality+for+the+treatment+of+cancer.">Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).</li><li>Drachman, J. G., Senter, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+the+chemistry+behind+empowering+antibodies+to+fight+cancer.">Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , 380-382 (1996).</li><li>Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+three+different+fluorophore+antibody+conjugation+strategies.">Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).</li><li>Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-labeled+antibodies:+Balancing+functionality+and+degree+of+labeling.">Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling.</a> Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).</li><li>Isa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+system+to+identify+small+molecules+that+induce+internalization+and+degradation+of+HER2.">High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).</li><li>Liao-Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+antibody+internalization+with+novel+monoclonal+antibodies+against+Alexa+fluorophores.">Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores.</a> PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).</li><li>Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+for+Internalizing+Antibodies+by+Homogeneous+Fluorescence+Imaging+of+a+pH-Activated+Probe.">High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe.</a> J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).</li><li>Nath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+plate+based+antibody+internalization+assay+using+pH+sensor+fluorescent+dye.">Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye.</a> J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).</li><li>Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+reproducible+fluorescent+labeling+of+small+amounts+of+antibodies+on+solid+phase.">A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase.</a> J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).</li><li>Strachan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+biotinylation+of+antibodies.">Solid-phase biotinylation of antibodies.</a> J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).</li><li>Dezfouli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead+assisted+labeling+of+antibodies+at+nanogram+scale.">Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale.</a> Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).</li><li>Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-bead+antibody-small+molecule+conjugation+using+high-capacity+magnetic+beads.">On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads.</a> J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).</li><li>Lund, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+variation+in+binding+of+Protein+A+and+Protein+G+to+immunoglobulin+type+G+by+isothermal+titration+calorimetry.">Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry.</a> J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).</li><li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+techniques+for+the+isolation+and+purification+of+proteins+and+peptides.">Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides.</a> Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).</li><li>Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+the+treatment+of+cancer.">Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer.</a> Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).</li><li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+linker+and+conjugation+chemistry+on+antigen+binding,+Fc+receptor+binding+and+thermal+stability+of+model+antibody-drug+conjugates.">Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates.</a> MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).</li></ol>

Authors are employees of Promega Corporation.

이 연구의 목적은 작은 분자의 다양한 낮은 농도에서 세포 배지에서 본 발명의 항체를 라벨 할 수있는 방법을 개발 하였다. 항체 탐색의 초기 단계에서 항체의 다수를 허용 이러한 방법은 작은 분자 표지 및 생물학적 관련성 분석을 이용하여 선별한다. 그러한 분석은 국제화도 유사한 결합 친 화성을 가진 항체 사이에 다를 수 있습니다 수용체 매개 항체 내재화 분석이다. 따라서, 기존의 효소 결합 면역 분석 (ELISA)을 기반으로 검사 이외에 자신의 국제화 특성에 대해 구체적으로 항체를 선별하는 것이 중요하다. 초기 항체 개발 단계에서 항체 레이블을 할 수있는 방법에 대한 주요 요구 사항은 다음과 같습니다 직접 세포 미디어에서 항체 레이블을 할 수있는) 능력; b)는 세포 미디어 항체 농도가 50 ㎍ / ㎖의 경우 예를 들어, 낮은 농도로 존재하는 항체 레이블을 할 수있는 능력; 기음)표지 항체 및 항체 농도의 순도는 다운 스트림 응용 프로그램과 호환되어야합니다; d) 상기 방법은 아민 및 티올 계 화학 결합과 호환되어야한다 e) 상기 방법은 동시에 다수의 샘플들을 처리와 호환되어야한다. 이러한 요구를 고려하면 대용량 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 사용하여 비드상의 항체 표지 및 정제 방법을 개발 하였다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 이러한 비드 낮은 비 특이 적 결합 특성을 갖는 친수성 셀룰로오스 기반으로 고순도의 항체 제조에 결과이다. 비드의 고용량 비즈 소량 효율적 미디어 항체 캔 항체를 포착 할 수 있다는 것을 의미 따라서 항체를 집중하고 작은 볼륨에서 용출 될 수있다. 표 1에서, 10 μL 비드 1.0 ml의 시료로부터 항체 (예상 농도가 50 내지 100 μg의 / ㎖)을 캡처하는 데 사용 된 정착D 표지 항체 200-500 μg의 / ㎖ 사이 농도에서 120 ㎕의 부피로 용출 하였다. 이 농도는 일반적으로 항체 농도가 1.0 ㎍ / ㎖의 10 NG / ㎖ (15, 16)의 범위 셀 기반 국제화 실험과 호환됩니다. 온 - 비드 표식 방법은 아민 및 티올 화학 및 표지 항체 (표 1)의 효율적인 복구를 함께 달성 할 수있는 염료에 대한 항체 비율의 넓은 범위 모두와 호환 가능하다. 실험을 삼중으로 수행하고, 최대 12 개의 시료는 상당히 처리 시간을 단축 직접 병렬로 처리 하였다. 라벨의 처리량은 상기 자성 비드는 19, 22을 사용하여 다른 애플리케이션에 도시 된 바와 같이 로봇 플랫폼을 사용함으로써 증가 될 수있다. 높은 항체 량 시료는 쉽게 복구 항체 및 표지 efficie을 유지하면서 포착 사용 비드의 양을 증가시켜 수용 될 수있다ncy (표 2). 다양한 염료 항체 접합체가 제조 될 수 있다는 것은 염료에 대한 항체의 비율을 최적화 할 필요가 있도록 상기 방법은 또한 다수의 염료와 호환된다. 2-4 항체 비율 염료 11,12 최적 인 것으로 측정 된 ADC를 승인하는 경우에 항체 당 약 3.5의 평균은 23보고되었다. 비드에 접합 화학, 그것은 하류 애플리케이션의 요구 사항에 따라 항체 당 소분자의 최적 수는 조정 비교적 용이하다. 또한, 표지 용 티올 아민 화학 모두는 항원 수용체 결합 것으로, 생체 내에서 안정성을 도시 된 바와 같이 ADC에서 중요한 가장 궁합 옵션을 결정하기 위해 테스트 될 수 있고, 항체의 치료 적 활성은 공액 화학 (24)에 따라 25. 좋은 항체 라벨 및 복구를 달성하기 위해 몇 가지 주요 요소가 있습니다. 소분자 A의 속성항체 비율 항체 복구 및 염료 모두에 필요한 드라이버 재. 작은 소수성 분자, 항체의 비율이 높은 염료 비특이적 비드로 표지 된 항체를 부착하고 상당히 감소 된 항체 복구를 야기한다. 때때로, 염료 및 항체 특성에 따라, 우리는 하나의 구슬이 때문에 다른 것보다 더 잘 작동 할 수 있음을 발견, 최적화 동안 모두 구슬의 테스트는 유용 할 수있다. 단백질 A와 단백질 G는 다른 종의 항체에 대한 적절한 구슬을 선택할 때 고려해야 할 다른 아형, 다른 친 화성 (21)이있다. 예를 들어, 단백질 A는 ​​따라서 단백질 G 비즈 강력하게 권장 마우스의 IgG1 낮은 친 화성을 가지고있다. 티올 화학의 경​​우, DTT 및 TCEP 환원제는 동일하게 작동합니다. DTT하지만 그에 완전히 세척에 의해 제거되어야하는 말레이 미드의 반응을 방해한다. 2.7의 낮은 pH를 용출하는 것이 좋습니다,하지만 2.2의 낮은 pH는 효율적인 녹화 필요할 수 있습니다어떤 경우에는 overy. 낮은 pH에서 변성 수 있습니다 표지 항체 효율적인 복구 및 항체의 기능 사이의 균형은 경험적으로 결정되어야 할 것이다. 또한 화학 표지, 항체 - 항원의 결합 활성 11,23 영향을 미칠 수있는 것으로 알려져있다, 그러므로, 원하는 응용 프로그램을 사용하여 하류 라벨링 후 항체의 기능을 테스트하기 위해 절대적으로 필요하다. 요약하면, 우리는 사전 정제 단계없이 셀 미디어에서 직접 형광 염료와 항체 레이블을하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 활용하고 높은 농도 (10, 11)에서 고순도의 항체를 필요로하는 용액 기반 표식 방법에 비해 상당한 개선이다. 자성 비드의 사용은 비 - 자성 비드 기반 분류 기술 (17, 18) 위에 이점이다 설명서뿐만 아니라 자동 샘플 취급을 가능하게한다. 고용량 BEA의 마지막 사용DS는 구슬의 소량을 사용하여 마이크로 그램의 수백 낮은 마이크로 그램 수준에서 항체 표지 반응의 스케일 업을 허용하고 다른 자기 비드 기반 표시 방법 (19)에서이 방법을 구별합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 형광 염료로 표지 항체를 설명하지만,이 방법은 바이오틴, 세포 독성 약물 및 가능한 효소를 포함하는 다른 라벨로 확장 될 수있다.

작은 분자로 표지 된 항체는 아마도 생물학 1,2-에서 가장 일반적으로 사용되는 시약이다. 형광 염료 및 비오틴 표지 항체는 광범위하게 다른 응용 프로그램 3-6 사이, 세포 계측법 서쪽 오 점, 그리고 면역 흐름, 이미징, 면역에 사용됩니다. 방사성 표지 항체는 3,7 암의 치료를위한 새로운 옵션을 제공하고, 2 개의 ADC를 이미 치료 사용 (8) 승인 된 이미징 및 치료, 세포 독성 약물 (ADC)는 표지 항체에 광범위하게 사용을 찾을 수 있습니다. 자신의 광범위한 사용에도 불구하고, 라벨 항체의 방법은 놀라 울 정도로 변화가 없었다 일반적으로 여러 반응을 포함하고 탈염는 9 ~ 12 단계를했다. 해결 방법은 단 몇 항체가 표시 될 필요가 높은 농도로 고도로 정제 된 형태로 사용할 수있는 경우에 충분한 볼륨에서 매우 잘 작동합니다. 그러나 ADC를 같은 새로운 애플리케이션을 위해 존재하는그들은 예를 들어, 수용체 매개 항체 내재화 13-16에 대한 생물학적 관련 특성에 대한 검사를 할 수 있도록 초기 하이 브리 도마 단계에서 항체 레이블을해야합니다. 하이 브리 도마 단계에서 샘플 볼륨 항체는 낮은 농도로 발현되고 샘플들의 수는 이에 기반 솔루션 라벨링 방법이 적합하지 않다, 큰되어 제한된다. 단순화 전통적인 항체 라벨링 방법의 처리율을 향상시키기 위해 몇 가지 다른 방식은 17, 18을 제안되어있다. 하나의 방법은 표지 및 표지 반응 및 정제 된 단백질의 용출에 이어 항체를 캡처하는 비자 성 단백질을 작은 열 충전 한 화성 비드를 사용하는 것이다. 이 방법은 세포 배지로부터 직접 항체 라벨을 사용할 수 있지만, 컬럼의 사용은 힘든 일 수있다. 자기 비드 기반 방법은 최근 컬럼의 사용을 제거하고 처리량 그러나 때문에 개선이 19보고 된 바있다구슬의 능력을 결합 제한 항체, 항체의 낮은 마이크로 그램 수량 만 나노 그램이 표시 될 수 있습니다. 우리는 최근에 개발 된 고용량에게 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈 (&gt; 인간 IgG / 정착 구슬 ml의 20 mg)을 작은 분자 (20)와 세포 미디어에 존재하는 항체 레이블을 사용합니다. 비드의 고용량은 항체의 마이크로 그램의 수십 내지 수백 편리한 라벨되도록 비드의 신속한 자기 응답 병렬 샘플들의 다수의 취급 및 처리를 단순화한다. 작은 분자에 대한 대용으로 형광 염료를 사용하여, 우리는 방법은 아민과 티올 라벨 화학와 호환되며 라벨이 매우 순수 항체의 높은 회수율을 제공하고 있음을 보여준다. 이 프로토콜 및 첨부 영상 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 이용하여 세포 배지에 존재하는 마우스 항체에 비드 레이블링을 설명한다. 이 프로토콜은네 개의 섹션으로 나누어 : 1 절은 생물학적 시료에서 비드에 항체의 캡처를 설명합니다. 캡쳐 후에, 화학 제를 사용하여, 아민 또는 티올 화학 제를 사용하여 형광 색소와 항체의 표지는 각각 2 항과 제 3 항에 기재되어있다. 마지막으로, (4) 항체 농도의 계산 및 항체 비 염색하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>Magne Protein A Beads</td><td>Promega Corporation</td><td>&amp;nbsp;G8781</td><td></td></tr><tr><td>Magne Protein G Beads</td><td>Promega Corporation&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

형광 염료, 세포 독성 약물, 방사성 추적자 같은 작은 분자 표지 항체는 필수적인 생물 의학 연구 도구, immunodiagnostics 그리고 최근과 같은 치료제이다. 작은 분자 표지 항체에 대한 전통적인 방법은 상대적으로 높은 농도로 항체를 정제 여러 투석 단계를 포함하고 처리량을 제한 필요합니다. 그러나, 항체 약물 결합체 (ADC)는 분야를 포함한 여러 응용 프로그램은, 세포 미디어에서 직접 항체의 라벨을 허용하는 새로운 방법에서 도움이됩니다. 이러한 방법은 항체, 예를 들어, 생물학적 관련 분석법에서 선별 할 수 있으며, ADC는 경우의 수용체 - 매개 된 항체 내재화 분석. 여기서는 직접 세포 배지에서 항체의 적은 양의 표지를 가능하게하는 방법 (온 비드 법)을 설명한다. 이 방법은 항체를 캡처하는 고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 친 화성 구슬을 이용아민 또는 티올 화학 표지 된 항체의 후속 용출을 사용하여 작은 분자로 표지 하였다 셀 매체. 작은 분자에 대한 대용으로 형광 염료를 복용, 우리는 직접 아민과 티올 라벨 화학을 모두 사용하여 셀 미디어에서 세 가지 다른 마우스 항체의 온 - 비드 라벨을 보여줍니다. 단백질 A와 단백질 G 항체의 높은 결합 친화도가 높은 회수율뿐만 아니라 표지 된 항체의 순도를 보장한다. 또한, 자성 비드를 사용하여 여러 샘플 크게 라벨링 스루풋을 향상 수동으로 취급 될 수있다.

고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 사용하는 작은 분자로 항체를 라벨링하는 개략도는도 1에 도시되어있다. 항체 라벨 아민 화학 제를 사용하여, 예컨대, 형광 염료, G 비드 작은 분자로 표지 될 수있는 자기 단백질 캡처 리신 아미노산 또는 항체의 힌지 영역에서 환원 된 티올로 라벨 티올 화학 제를 사용하여 일차 아민. 항체 및 단백질 G 사이의 선호도 라벨 반응 중 항체의 손실을 최소화 21 결과 강하다. 간단한 정제를 비교할 때 이는 형광 염료로 표지 한 후 세 가지 마우스 항체 이소 타입 (표 1)의 효율적인 복구 (50-90%)에 반영된다. (19 이전에보고 된 것과 유사) 효율적인 복구가 쿠마 젤도 알 수있다 (그림 2) 밴드 intensi정제 된 항체의 중쇄 및 경쇄의 관계 및 표지 항체는 쿠마 겔 (도 2)에서와 같이 자기 단백질 G 비드 고순도 항체 결과 낮은 비 - 특이 적 결합 특성을 갖는다. 표 1에보고 된 결과를 반영하고 두 중쇄 및 경쇄는 찬란 (그림 2) 레이블이 표시됩니다. 온 - 비드 라벨은 자기 단백질 A 구슬에서 수행 항체 비율 (표 2) 높은 회복과 좋은 염료의 결과로 여러 형광 염료와 호환 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig1.jpg" /> 형광 분자와 항체의 온 - 비드 표지 그림 1. 도식. (A) 항체 라벨링 티올 화학 제를 사용하여. 항체는 고용량 자기 단백질 A 또는 자기 단백질 G B의 캡처EADS는 DTT 또는 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)와 같은 환원제를 이용하여 사슬 간 이황화 결합의 환원 하였다. 형광 염료를 포함하는 티올 반응 말레이 미드 라벨 ​​항체에 추가됩니다. 표지 된 항체는 낮은 pH 용출에 의해 회수하고 즉시 중화된다. (B) 항체 라벨링 아민 화학 제를 사용하여. 고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈에 촬영 된 항체는 라이신의 주 아민에 항체를 라벨 아민 반응성 형광 염료와 반응한다. 레이블이 항체는 낮은 pH 용출에 의해 용출 즉시 중화된다. 나스, N. 등. (20)에서 적응하는 것은 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54545/54545fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig2.jpg" /> 그림 2. 변성 S세 마우스 IgG의 DS-PAGE 겔의 이미지가 비드 방법을 사용하여 정제 AlexaFluor 532 표지 동형. (A) 아민 반응물 (B) 티올 반응. 티올 - 반응성 염료로 표지 항체의 젤 이미지. 레인 1-6은 표 1에 도시 된 샘플에 대응한다. 젤 먼저 형광 스캐너를 이용하여 이미징 만 AlexaFluor 532 표식 항체 중쇄 및 경쇄를 표시 하였다. 항체는 정제 된 샘플은 표시되지 않습니다. 젤이어​​서 표지 된 항체뿐 아니라 정제 된 항체의 중쇄 및 경쇄를 표시 쿠마시 염색으로 염색 하였다. 나스, N. 등. (20)에서 적응하는 것은 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54545/54545fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td colspan="2"> 아민 반응 </td><td colspan="2"> 티올 반응 </td></tr><tr><td> 잘 </td><td> 이소 </td><td></td><td> 항체 복구 (μg의) </td><td> 항체 비율로 염료 </td><td> 항체 복구 (μg의) </td><td> 항체 비율로 염료 </td></tr><tr><td> 1 </td><td rowspan="2"> 마우스의 IgG1 </td><td> 정화 </td><td> 54.8 ± 1.8 </td><td> 0 </td><td> 49.2 ± 2.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 활용 </td><td> 27.4 ± 3.2 </td><td> 4.2 ± 0.2 </td><td> 46.​​2 ± 3.5 </td><td> 1.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td> 삼 </td><td rowspan="2"> 마우스 IgG2a의 </td><td> 정화 </td><td> 85.9 ± 6.4 </td><td> 0 </td><td> 75.3 ± 8.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> ConjugATION </td><td> 60.7 ± 3.2 </td><td> 4.4 ± 0.1 </td><td> 61.5 ± 7.4 </td><td> 5.5 ± 0.4 </td></tr><tr><td> (5) </td><td rowspan="2"> 마우스의 IgG2b </td><td> 정화 </td><td> 79.9 ± 6.9 </td><td> 0 </td><td> 73.3 ± 1.4 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 활용 </td><td> 66.7 ± 0.5 </td><td> 5.6 ± 0.1 </td><td> 55.7 ± 0.9 </td><td> 5.2 ± 0.5 </td></tr></tbody></table> 표 1 :. 아민 및 티올 화학 물질을 사용하여 직접 세포 미디어에서 세 마우스 IgG 이소 타입의 온 - 비드 라벨 각 샘플의 경우, 1.0 ml의 세포 배지의 분취 한 단지 아민 반응성 AlexaFluor 532 염료에 비드 표지에 사용 된 자기 단백질 G 비드 (50 μL 슬러리) 및 제 분취 액을 사용하여 항체를 정제 하였다. 두 경우 항체 회수율을 산출 하였다 (본문에 설명 된)을표지 반응 동안 항체의 손실을 결정하기 위해 비교 거라고. 항체 비율 염료는 세 항체에 대해 계산 하였다. 모든 반응은 3 중으로 수행 하였다. 나스, N. 등에서 적응. (20) <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> 자기 단백질 G 비즈 </td><td colspan="2"> 자기 단백질 A 구슬 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 항체 복구 (μg의) </td><td> 항체 비율로 염료 </td><td> 항체 복구 (μg의) </td><td> 항체 비율로 염료 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 정화 </td><td> 263.7 ± 10.4 </td><td> 0 </td><td> 269​​.4 ± 5​​.1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> AlexaFluor532 </td><td> 182.9 ± 15.3 </td><td> 5.377; 0.04 </td><td> 189.1 ± 6.9 </td><td> 6.9 ± 0.2 </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> AlexaFluor647 </td><td> 192.5 ± 2.9 </td><td> 3.3 ± 0.1 </td><td> 112.3 ± 11.4 </td><td> 3.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 형광 </td><td> 179.5 ± 5.3 </td><td> 6.8 ± 0.1 </td><td> 201.5 ± 6.5 </td><td> 6.8 ± 0.1 </td></tr></tbody></table> 표 2. 세 가지 티올 - 반응성 형광 염료와 마우스의 IgG2a의 온 비드 레이블링 집중된 셀 미디어 샘플 그 방법을 보여주기 위해 본 실험에 사용 된 항체는 다른 양을 채용 할 수있다. 또한, 컨쥬 게이션 반응은 자기 단백질 G뿐만 아니라 자기 단백질 G 비드 (100 μL 슬러리)를 사용하는 항체의 정제에 사용 된 세포 배지 농축 1.0 ㎖가 자기 단백질 A. 하나의 분취 액을 사용하여 수행 하였다. 세 가지 다른 1.0 ML의 나누어지는들 표지 및 티올 반응성 AlexaFluor 532, AlexaFluor 647 및 형광으로 정제 하였다. (텍스트에 설명 된대로) 및 각종 라벨 반응에 비해 항체 복구는 계산 하였다. 항체 비율 염료는 세 형광 염료에 대해 계산 하였다. 유사 정제 및 표시 자성 단백질 A 비드를 사용하여 수행 하였다. 모든 반응은 3 중으로 수행 하였다. 나스, N. 등에서 적응. &#39;(20) <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 완충기 </td><td> 댓글 / 설명 </td></tr><tr><td> 아민 결합 완충액 (10mM의 중탄산 나트륨 완충액, pH를 8.5) </td><td> 1. 0.084 g 중탄산 나트륨 2. 증류수에 녹인다. pH를 8.5로 조정합니다. 3. 탈 이온수 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr><tr><td> 티올 활용 버퍼 (1 mM의 EDTA, pH가 7과 10 mM의 인산 버퍼입니다.0) </td><td> 1. 0.0378 g 인산 나트륨, 일 염기성, 수화물 2. 0.195 g ​​인산 나트륨, 이염, 수화물 3. 증류수에 녹인다. 4. 1.0 mM의 최종 농도로 EDTA를 추가한다. 5. pH 7로 조정합니다. 6. 탈 이온수 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr><tr><td> 항체 결합 / 세척 완충액 (10 mM의 인산 완충액, pH를 7.0) </td><td> 1. 0.0378 g 인산 나트륨, 일 염기성, 수화물 2. 0.195 g ​​인산 나트륨, 이염, 수화물 3. 증류수에 녹인다. pH 7로 조정합니다. 4. 탈 이온수 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr><tr><td> 용출 완충액 (50 mM의 글리신 완충액, pH를 2.7) </td><td> 1. 0.188 g 글리신 2. 증류수에 녹인다. HCl로 2.7 산도를 조정합니다. 3. 탈 물 50 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr><tr><td> 중화 버퍼 (2 M 트리스 버퍼, 산도 7.5) </td><td> 1. 0.472 g후, Trizma베이스 2. 2.54 g의 후, Trizma 염산염 3. 증류수에 녹인다. pH를 7.5로 조정합니다. 4. 탈 이온수 10 ml의에 최종 볼륨을 조정합니다. </td></tr></tbody></table> 표 3 : 버퍼 조성물에 관한 것이다.

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads at JoVE.com

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

작은 분자와 항체를 라벨에 대한 온 - 비드 방법은 직접 세포 미디어에서 항체의 소량의 라벨 수 있습니다. 이 방법은 아민 및 티올 화학과 호환 가능하며, 병렬로 다수의 시료를 수동 또는 자동 플랫폼을 사용하여 처리 할 수​​있다.

형광 염료와 항체 라벨은 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈를 사용하여

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

antibody-labeling-with-fluorescent-dyes-using-magnetic-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K 조회수.  Promega Corporation.  작은 분자와 항체를 라벨에 대한 온 - 비드 방법은 직접 세포 미디어에서 항체의 소량의 라벨 수 있습니다. 이 방법은 아민 및 티올 화학과 호환 가능하며, 병렬로 다수의 시료를 수동 또는 자동 플랫폼을 사용하여 처리 할 수​​있다. 

비디오: Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is protein conjugation by genetically introducing an unnatural amino acid containing a bioorthogonal functional group. This report describes a detailed protocol for site-specific antibody conjugation. The protocol includes experimental details for the genetic incorporation of an azide-containing amino acid, and the conjugation reaction by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strain-promoted reaction proceeds by simple mixing of the reacting molecules at physiological pH and temperature, and does not require additional reagents such as copper(I) ions and copper-chelating ligands. Therefore, this method would be useful for general protein conjugation and development of antibody drug conjugates (ADCs).

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

연구

생화학

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

검출 실험 프로토콜<em&gt; 시아 노 박테리아</em&gt; 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

환경과학

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

신경과학

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

생물학

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), and so on. To detect and analyze soluble or diffuse protein oligomers or aggregates, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can detect the diffusion speed and brightness of a single particle with a single molecule sensitivity, has been used. However, the proper procedure and know-how for protein aggregation detection have not been widely shared. Here, we show a standard procedure of FCS measurement for diffusion properties of aggregation-prone proteins in cell lysate and live cells: ALS-associated 25 kDa carboxyl-terminal fragment of TAR DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) and superoxide dismutase 1 (SOD1). The representative results show that a part of aggregates of green fluorescent protein (GFP)-tagged TDP25 was slightly included in the soluble fraction of murine neuroblastoma Neuro2a cell lysate. Moreover, GFP-tagged SOD1 carrying ALS-associated mutation shows a slower diffusion in live cells. Accordingly, we here introduce the procedure to detect the protein aggregation via its diffusion property using FCS.

We here introduce a procedure to measure protein oligomers and aggregation in cell lysate and live cells using fluorescence correlation spectroscopy.

형광 상관 분광법을 사용하여 단백질 응집 감지

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

형광 염료와 항체 라벨은 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈를 사용하여

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터