A.C. was supported by a postdoctoral fellowship from the Heart and Stroke Foundation of Canada and the Training Program in Regenerative Medicine (Canadian Institutes of Health Research). F.Y.Y.H. was supported by the Training Program in Regenerative Medicine. This work was funded by a grant from Astellas Pharma Canada. We also would like to thank Dr. Mark Menenghini (University of Toronto) for use of his Axon microarray scanner.

1. 희석 항원 및 생성 항원 마이크로 어레이 <ol><li> 0.2 mg / ml의 최종 농도로 PBS에 희석 항원. 9 핀과 미세 배열 구성과 중복에서 162까지 고유의 항원을 인쇄합니다. 항원 라이브러리로 양성 대조군에서의 IgG 및 IgM의 항원을 포함합니다. 단지 음성 대조군으로 PBS를 포함합니다. </li><li> 384 잘 소스 판에 각 항원의 20 μl를 추가합니다. 프린트 헤드의 설치 미러 그룹의 소스 플레이트에 항원을 추가 (9 핀 인쇄에 사용하는 경우 등, (9)의 그룹이 항원을 준비). </li><li> 배열을 인쇄 할 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 박 및 동결와 커버 소스 판. </li><li> 3 × 1 분 동안 탈 이온수와 초음파 처리 조에서이를 배양하여 고체 미세 배열 핀을 청소합니다. 랙에 배치 핀은 건조 후 마이크로 어레이 프린트 헤드의 핀을 배치합니다. 9 핀, 3 × 3 구성을 사용합니다. </li><li> 프린트 헤드 번호 핀을 설정하여 실행 인쇄 프로그램 미세 배열,슬라이드의 수는 각 슬라이드에, 패드의 번호를 인쇄하고, 각 항원에 대한 복제 지점 수 있습니다. 일반적으로 9 핀, 70 슬라이드, 2 패드 / 슬라이드, 각 항원에 대한 2 복제 지점을 사용합니다. 프로그램 미세 배열은 항원의 다른 그룹 사이에 물에 핀을 초음파 처리합니다. </li><li> 해동 소스 플레이트와 100 × g에서 1 분 후 원심 분리 판. 미세 배열의 지정된 자리에 소스 판을 놓습니다. 인쇄 할 항원의 첫 번째 그룹을 덮고 박의 부분을 제거합니다. </li><li> Arrayer에 표면 및 실행 인쇄 프로그램에 인쇄되지 않은 슬라이드를 정렬합니다. 어레이 시스템의 가습기의 빌드 60 % - 습도 RT에서 인쇄 슬라이드 (55)에 Arrayer에에 설정합니다. </li><li> 항원의 각 그룹은 모든 슬라이드 상에 인쇄 된 후, 미세 배열을 일시. 다만 호일로 인쇄 된 표지 항원 (증발을 방지하기 위해) 및 항원의 다음 그룹에 인쇄 될 발견. 인쇄 프로그램을 계속합니다. </li><li> 모든 항원에 인쇄 한 후, 커버 소스 PL-80 ° C에서 박 및 동결의 새로운 조각을 먹었다. 슬라이드 상자와 진공 밀봉에 인쇄 된 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 다음날를 사용하거나 최대 한 달 후에 할 수있다. </li></ol> 2. 희석 혈청과 항원 마이크로 어레이를 프로빙 <ol><li> 배양 챔버를 사용하여 프레임으로 슬라이드를 놓습니다. 각 배열 표면에 차단 버퍼 (2.5 %의 [권 / 권] 태아 혈청 (FCS), PBS에 트윈 20 0.1 % [의 / 권 권])의 700 μl를 추가합니다. </li><li> 젖은 조직의 조각 밀폐 용기에 프레임과 장소를 통해 접착 필름을 배치합니다. 로커에 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 혈청 샘플 1을 희석 : (100) 버퍼를 차단에서. 대기음 배열에서 솔루션을 차단 및 각 배열 표면에 희석 한 시료 500 μl를 추가합니다. </li><li> 접착 필름으로 덮고 락으로 4 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 버퍼를 차단에서 이차 항체를 희석. 인간 연구의 경우, 0.33 μg의 / ㎖ 및 Cy5에로 Cy3가 표지 된 염소 항 - 인간 IgG 항체가 희석 된 염소 항 - 구호 물자 표지0.25 μg의 / ㎖에 대한 IgM 항체 n은. 마우스 연구를 들면, Cy3에가 ㎖의 0.38 μg의 /에 염소에게 항 - 마우스 IgG 항체를 표지와 Cy5에가 / ㎖ 0.7 μg의에 염소 항 - 마우스 IgM의 항체를 표지 희석. </li><li> 어레이에서 대기음 샘플 및 배열 표면을 세척 완충액 (PBS 중 0.1 % 트윈 20)로 4 회 헹군다. 슬라이드에 버퍼 빠르게 떨어져 가볍게 붓는다. </li><li> 락과 RT에서 각 배열 표면을 씻어 10 분 부화 버퍼를 차단의 700 μl를 추가합니다. 반복 세척 단계를 두 번 더. </li><li> 각 슬라이드 표면에 희석 차 항체의 500 μl를 추가하고 접착 필름 커버. 락과 4 ° C에서 45 분을 품어. </li><li> 대기음 차 항체 슬라이드에서 혼합하고 위의 4 번 헹군다. 워시는 상기 차단 / 희석액 700 ㎕를 3 번​​ 슬라이드. </li><li> PBS에 침지 금속 슬라이드 랙 프레임과 장소에서 슬라이드를 제거합니다. 궤도 흔들림와 실온에서 20 분을 품어. PBS의 새로운 용기에 놓고 다른 20m를 품다진탕한다. </li><li> 탈 이온수 15 초 용기에 넣어 슬라이드 랙. 물이 새 컨테이너에 선반을 놓고 다른 15 초를 품어. </li><li> 건조 슬라이드, RT에서 5 분 220 XG에 원심 분리기와 스핀에서 ELISA 플레이트 어댑터에 장소 슬라이드 랙. </li><li> 스캔 할 준비가 될 때까지 빛을 꽉 상자에 슬라이드를 놓습니다. </li></ol> 3. 스캔 항원 마이크로 어레이 및 데이터 내보내기 <ol><li> 를 Cy3 및 Cy5의 형광 신호를 검출 할 수있는 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 스캔 슬라이드. 스캐너의 광전자 증 배관 (PMT) 레벨을 조정하기 위해, 단지 이차 항체로 프로빙 하였다 슬라이드 사전 스캔. 참고 :이 슬라이드 전체 양 (IgG에와 IgM의)를 포함하여 그것에 인쇄 항원 라이브러리뿐만 아니라 음 (PBS) 컨트롤이 있어야합니다. 프리 스캔 최적 PMT 설정을 찾기 위해 신속하게 사용자를 허용하는 낮은 해상도로 스캔한다. </li><li> PMT를 값을 설정되도록합니다 (Cy3에 채널에서) 인간 IgG 기능과 잡음합니다 (Cy5에 채널)을 IgM의 기능은 비슷한 평균 형광 강도를 뺀 배경 (MFI-B) (일반적으로 40000)가 있습니다. PMT를 레벨은 &quot;하드웨어&quot;버튼을 누름으로써 설정된다. 일단 설정되면, 일정이 PMT 설정을 유지. </li><li> 은 &quot;스캔&quot;버튼을 누름으로써 두 개의 채널에 대한 실험 슬라이드 스캔. 각 스캔 한 후 슬라이드 이미지 (두 채널 모두)를 저장합니다. </li><li> 슬라이드를로드하는 &quot;파일&quot;버튼을 사용하여 마이크로 어레이 소프트웨어로 분석된다. </li><li> &quot;파일&quot;버튼을 이용하여 유전자 배열 목록 (GAL) 파일을로드합니다. 는 GAL 파일 어레이 피처들의 신원을 가진 어레이의 레이아웃을 가진다. </li><li> 배열 기능을 최대한 가깝게 템플릿을 일치하도록 스캔 한 이미지를 통해 배열 템플릿을 놓습니다. </li><li> 은 &quot;정렬&quot;버튼을 눌러 템플릿으로 모든 블록의 기능을 맞 춥니 다. 프로그램은 일반적으로 원형의 기능의 개요를 확인할 수 있지만, 일부 수동 조정이 필요할 수있다. 이러한 조정 기능 모드를 입력 할 수있다. 소프트웨어는 각 항원에 대해 MFI-B를 계산한다. </li><li> 텍스트 파일로 결과를 내보내려면 &quot;파일&quot;버튼을 사용합니다. </li></ol> 마이크로 어레이의 의미 분석 4. 분석 배열 데이터 (SAM) <ol><li> 엑셀로 개별 텍스트 파일을로드하고를 Cy3와 Cy5에 채널 MFI-B가 열을 식별합니다. </li><li> 중복 기능의 평균을 계산합니다. </li><li> 어떤 부정적인 MFI-B의 경우, (10)와 음수 로그베이스 (2)를 계산하여 다음 100 원 MFI-B를 나누고하여 데이터를 변환 대체합니다. </li><li> 이전에 7 설명한 바와 같이 마이크로 어레이 (SAM)의 의미 분석과 로그 변환 된 데이터를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 두 그룹 (예를 들어, 건강한 대조군 대 명), 하나의 그룹 라벨 「1」및 그룹을 이용하여 연구를위한 &quot;2&quot; 의있는 항원의 반응성을 식별하기 위해 SAM의 두 클래스 짝이 분석을 사용하여두 군간 ignificantly 다른 (Q 값 &lt;0.05). </li><li> 프리젠 테이션 8 이미지를 만들기 위해 클러스터링 및 열 맵 생성 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 프로토콜 항원 마이크로 어레이 기술을 이용하여자가 항체의 정량을 허용한다. 항원 마이크로 어레이는자가 항체 선별에 기존의 ELISA에 비해 여러 가지 장점을 제공한다. 우선, 핵산, 단백질, 펩티드, 및 세포 용 해물을 포함하는 다양한 항원에 따라서 다중화자가 항체 스크리닝을 허용 니트로 셀룰로스 - 코팅 된 슬라이드 상에 배치 될 수있다. 항원 나노 리터 각 슬라이드에 발견되기 때문에, 또, 항원의 마이크로 그램의 어레이를 생성 할 필요가있다. 100 샘플 희석 혈청의 5 μL가 1 배열 표면을 조사하는 데 필요한대로 배열은 매우 작은 환자 샘플을 필요로한다. 마지막으로, 배열은 니트로 셀룰로오스에자가 항체 9 검사에서 기존의 ELISA보다 더 민감한 것으로 나타났다 발견했다. 자가 항체에 대한 항원 스크리닝 마이크로 어레이를 사용하는 것 외에도, 상기 배열은 사용 될 수D는 단일 클론 항체의 특이성을 정의하고, 이전에 설명 된 바와 같이 이식 9-12 아닌 HLA 항체의 수준을 측정하는 비 자기 단백질 (예, 바이러스 단백질)에 대한 반응성을 검출한다. 항원 마이크로 어레이는 단일 단백질의 중첩 펩타이드 슬라이드 상에 배열 된 에피토프 맵핑 상세한 실험을 수행 할 수있다. 최근의 연구는 전신성 홍 반성 루푸스 (13)의자가 항체의 표적 인 U1-70K 단백질의 에피토프를 정의하려면이 방법을 사용했다. 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여,의 IgG 및 IgM의 반응성을 검출 혈청 희석액의 넓은 범위에 걸쳐 선형 적이다. 이 연구는 리보솜의 P 항원과 ssDNA를에 알려진 반응성이 전신성 홍 반성 루푸스 환자에서 양성 대조군 혈청을 사용하여 수행 하였다. 17,000 50 IgG의 반응성의 MFI-B에에 해당하는 32,000 : 125 1 : ssDNA를에 IgM의 반응성 1의 혈청 희석에서 선형4000 (및 MFI-B 32000보다 크다)의 IgG 반응성 병합 검출 곡선 : 1 이하 희석액에서 200 32,000 MFI-B에 해당하는 512,000 : 1-4000 : 리보 P는 하나의 혈청 희석액에 선형 더 이상 선형 없습니다. 심장 이식 수혜자와 연구에서 혈청 일상적 1로 희석된다 항원에 대한 MFI-B는 거의이 희석 10,000를 초과하지 100로. 고역가자가 항체와 면역 질환을 가진 환자의 연구를 들어, 환자의 시료자가 항체 반응성의 대부분이 분석의 선형 범위 내에 있도록 상기 희석 될 필요가있다. MFI-B는 환자 그룹간에자가 항체 반응성을 비교하는 것이 유용 할 수 있지만, 또한,자가 항체 수준보다 양적 측정 값으로,이 값을 변환하기 위해 유용 할 수있다. 이것은 표준 곡선을 생성하기 위해 상기 슬라이드 상에 정제의 IgG 및 IgM의 여러 공지 희석 스폿 팅에 의해 달성 될 수있다. 이 곡선을 사용하여, MFI-B는 트랜스 일 수있다각 항원에 대한자가 항체 수준으로 형성. 여기에 제시된 프로토콜,이 패드 니트로 셀룰로스 - 코팅 된 슬라이드를 사용 하였다. 이 슬라이드에서 두 개의 분리 된 혈청 샘플을 탐색 할 수있는 두 개의 동일한 배열은 각 슬라이드에 인쇄됩니다. 이 (예 : 사전 및 사후 처리 등) 같은 환자에서이 샘플 interslide 변동성을 최소화 동일한 슬라이드에 비교 될 수 있습니다. 64 개의 개별 환자 샘플 서른 두 슬라이드 일상적 하루에 동시에 처리된다. 가장 최근의 배열 (162) 항원을 허용, 9 핀 인쇄는 (각 핀 중복 인쇄 (18) 항원과 동일 36 기능 부분 배열을 인쇄) 중복 인쇄합니다. 이 프로토콜에서 생성 된 항원 마이크로 어레이 고체 미세 배열 핀들로 인쇄 하였다. 고체 핀으로 인쇄하면 미세 배열은 각 t 후 소스 판에 딥을 다시해야하기 때문에 퀼 스타일의 핀 인쇄보다 소요 시간이 더있다핀이 상기 슬라이드면 닿 IME. 그들은 (직경이 약 500 μm의) 높은 재현성 거의 원형 배열 기능을 생성 고체 핀을 사용 하였다. 이러한 기능은 쉽게 감지 스캐너 소프트웨어에 의해 설명, 최소한의 수동 조정은 배열 기능을 정량화하는 데 필요한 수 있습니다. 고정 핀은 그들의 높은 점도 퀼 핀 인쇄 어려울 수있는 인쇄 될 세포 용 해물을 허용. 때문에 고체 핀과 관련된 긴 인쇄 번 - 소스 판에 인쇄되지 않는 항원은 증발을 방지하기 위해 호일로 덮여있다 (때로는 10 시간, 11 (70)의 슬라이드를 인쇄하기 위해). 여기에 설명 된 프로토콜이 동일한 슬라이드 표면의 IgG 및 IgM의 반응성을 분리하는 방법을 제공한다. 배열은 서로 다른 형광으로 표지 된 이차 항체의 쌍을 사용하여 두 인간 및 마우스 항체 화면에 최적화되어있다. 이 2 색 접근법은 긴급 세코 식별되고높은 하나의 IgG 또는 IgM의 아이소 타입에 대한 특정 ndary 항체. 사용되는 이차 항체의 IgG 또는 IgM의의 Fc 부분을 인식하고, 서로 가교 반응하지 않는다. IgG에 및 IgM의 신호들을 분리하는 것은 면역 반응에서 이들 항체의 다른 기능을 부여 중요하다. 예를 들어, IgM의 B1은 세포에 의해 높은 수준으로 생산 전형적 초기 면역 반응의 마커이다. 한편, IgG의 클래스 14의 전환의 결과로서 개발 이후 면역 반응의 표지이다. 별도의 IgG 및 IgM의 신호를 검출함으로써, 환자 샘플 IgM의 류마티스 인자를 확인하는 것도 가능하다 (즉, 어레이 상에 발견 된 IgG에 결합 IgM의 면역 글로불린). 항체의 다른 부분을 스폿 팅함으로써 (예를 들어, 팹 비교 된 Fc)는 다른 IgG의 항체 에피토프에 류마티스 성 인자의 결합을 정량 할 수있다. 두 개 이상의 레이저와 스캐너의 가용성과, 추가로 제진 항체의 IgA, IgD의 또는의 IgE 항체의 결합을 식별하는 현재의 이차 항체 쌍에 추가 될 수있다. 이차 항체는 단일 배열에 항원에 결합 된 별도의 IgG 서브 클래스 (의 IgG1, IgG2, Ig​​G3, IgG4를)의 식별을 허용하는 것을 확인 할 수있다. 결론적으로, 항원 마이크로 어레이 기술은 혈청자가 항체의 높은 처리량 특성을 가능하게하는 강력한 기술이다. 이 기술은 고도로 사용자 정의 및 구분합니다. 형광 계 검출 시스템은 인간 및 마우스 모두 연구에 최적화의 IgG 및 IgM의 항체의 동시적인 검출을 가능하게하고있다.

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity1. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies2. Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.
The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion3. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity3 compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays. 
Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Ribosomal P0</td>
			<td style="width:225px;">Diarect</td>
			<td style="width:304px;">14100</td>
			<td style="width:240px;">dilute to 0.2mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human IgG</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>009-000-003</td>
			<td>dilute to 0.2mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human IgM</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>009-000-012</td>
			<td>dilute to 0.2mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse IgG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5381</td>
			<td>dilute to 0.2mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse IgM</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>401601</td>
			<td>dilute to 0.2mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double-stranded DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td>dilute to 0.2mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">single-stranded DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8899</td>
			<td>dilute to 0.2mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microarrayer</td>
			<td>Virtek</td>
			<td>VersArray Chipwriter Pro</td>
			<td>many types of arrayers are suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">solid printing pins</td>
			<td>Arrayit Corporation</td>
			<td>SSP015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">software for robotic microarrayer</td>
			<td>Virtek</td>
			<td>Chipwriter Pro&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FAST slides (2 Pad)</td>
			<td>GVS Northa America</td>
			<td>10485317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FAST frame</td>
			<td>GVS Northa America</td>
			<td>10486001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FAST incubation chambers (2 Pad)</td>
			<td>GVS Northa America</td>
			<td>10486242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384 well plates</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plate sealers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">foil plate covers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3 goat anti-human IgG</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>109-165-096</td>
			<td>use working stock in 50% glyercol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy5 goat anti-human IgM</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>109-175-129</td>
			<td>use working stock in 50% glyercol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>115-165-071</td>
			<td>use working stock in 50% glyercol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy5 goat anti-mouse IgM</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>115-175-075</td>
			<td>use working stock in 50% glyercol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microarray Scanner</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axon 4200A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microarray software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Genepix 6.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clustering software</td>
			<td>eisenlab.org</td>
			<td>Cluster 3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heatmap software</td>
			<td>eisenlab.org</td>
			<td>Treeview 1.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microarray statistical software</td>
			<td>Stanford University</td>
			<td colspan="2">SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of two-color antigen microarrays for the simultaneous detection of igg and igm autoantibodies

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

도 1에 나타낸 바와 같이 항원 로봇 미세 배열로 슬라이드 상에 384 웰 플레이트에 배치되어 인쇄된다. 2는 배양 챔버와 처리 후의 스캔 슬라이드 프레임에 배치 된 슬라이드를 나타낸다. (3) 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 나타낸다. 네가티브 슬라이드은 이차 항체로 프로빙하고, 양성 대조군 슬라이드 전신성 홍 반성 루푸스 환자의 혈청으로 프로브된다. 두 별도로 표지 이차 항체를 이용하여 IgG를 및 IgM의 반응성이 동일한 슬라이드 표면에서 분리 될 수있다. (4)도 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 및 IgG를 다양한 위에 리보솜 P (Ribo를 P)에 대한 항체에 대한 IgM의 항체의 형광 강도를 나타낸다 혈청 희석의 범위. P Ribo에 대해 알려진 반응성 전신성 홍 반성 루푸스 환자에서 실험 양성 대조군 혈청을 사용 하였다. 린이어 반응은 모든 혈청 희석 통해 IgM의 채널 관찰된다. 선형 응답은 약 30,000의 MFI-B까지의 IgG 채널에서 관찰된다. 이 시점 후에, 반응은 포화 시작 Ribo를 P 항체 증가는 MFI-B에 대응하는 증가로 이어지지 않는다. 어레이 인간 혈청 류마티스 인자를 검출하는 방법을도 5도. 이 연구에서, 기록 류마티스 인자 cryoglobulinemic 혈관염 환자에서 혈청 (통상 &lt;11 IU / ㎖) 167 IU / ㎖ (IgG의 대 IgM의 항체)를 사용 하였다. 혼자 차 항체를 사용하여, IgM의 반응성은 배열에 발견 된 IgG에 대해 보이지 않는다. 슬라이드가 류마티스 인자를 가진 환자에서 혈청 프로빙시 반대로 중요한 IgM의 반응성 (약 5000 MFI-B)의 IgG에 대하여 검출된다. 6 마우스 혈청과 함께 사용할 수있는 2 색 항원 마이크로 어레이의 발전을 나타낸다. 이 그림에서, 마우스 대한 IgM 일어레이 상에 발견된다에서만 배열 만 항 마우스 IgG 이차 항체에 의해 검출되는 상 발견되는 항 - 마우스 IgM의 이차 항체와 마우스 IgG에 의해 검출된다. 스캔의 템플릿 격자 7은 정렬 도표 마이크로 어레이 분석 소프트웨어를 이용하여 어레이 이미지. 배열 기능은 그리드 정렬 되었으면 배열 기능이 각 기능에 대한 중간 형광 세기를 뺀 배경을 얻기 위해 분석 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54543/54543fig1.jpg" /> 항원 마이크로 어레이. 항원의 그림 1 세대 먼저 소스 접시에 배치된다. 도면에 도시 된 소스 접시, 항원 헤드 핀의 3 × 3 배열과 일치하는,도 9의 그룹에 배치된다. 소스 플레이트는 로봇 미세 배열에 배치되고, 항원은 슬라이드 상에 발견된다. 이 예에서이 패드 FAST 슬라이드 아칸소동일한 배열을 허용 사용되는 전자는 2 니트로 셀룰로오스 표면에 발견 할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54543/54543fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54543/54543fig2.jpg" /> 항원 마이크로 어레이. 슬라이드 그림 2. 처리 배양 챔버를 사용하여 FAST 프레임에 배치 된 후 이차 항체를 샘플을 추가하고 처리합니다. 항원 반응성 형광 신호를 검출 할 수있는 스캐너로 드러난다. 2 패드 FAST 슬라이드 스캔 한 이미지가 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54543/54543fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54543/54543fig3.jpg" /> &lt;BR /&gt; 그림 3. 인간의 세라와 함께 사용하기위한 2 색 항원 마이크로 어레이 최적화. (A)의 IgG, IgM의 및 IgG의 된 Fc은 이차 항체와 프로브 어레이에서 감지됩니다. 이 세 가지 항원 보조 항체의 특이성을 보여주는 긍정적 인 컨트롤입니다. 적색 형광 (IgM의 채널)은 항 - 인간 IgM의 차 항체의 결합을 나타낸다. 녹색 형광 (IgG의 채널) 항 인간 IgG 이차 항체의 결합을 나타낸다. 의 IgG의 Fc 항원은 과포화로 인해 흰색입니다. (B) 더 많은 반응성은 Ribo를 P 항원에 알려진 반응성이 전신성 홍 반성 루푸스 환자에서 양성 대조군 혈청 프로브 어레이에서 감지됩니다. 상자는 DNA 및 Ribo를 P 항원이 배열 된 위치를 나타낸다. (C) 양성 대조군 혈청에서 형광 농도의 정량 DNA 항원에 대한 항체 반응성의 대부분은 IG의 것으로 밝혀M 동형. (D) 양성 대조군 혈청에서 형광 농도의 정량 Ribo를 P 항원에 대한 항체 반응성의 대부분은 IgG의 이소 타입의 것을 알 수있다. 배열 기능 중복에 발견하고 약 500 μm의 직경입니다 있습니다. 그래프 배열 기능에 대한 평균 ± SD를 표시합니다. dsDNA, 이중 가닥 DNA; ssDNA를, 단일 가닥 DNA; MFI-B, 중간 형광 세기를 뺀 배경; 리보 P는 리보솜 P.는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54543/54543fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54543/54543fig4.jpg" /> 혈청 희석 팩터 대도 4 형광 강도. (A) 혈청 희석액의 넓은 범위 MFI-B이 들어 Ribo에 대해 P. ssDNA를 및 IgM의 IgG에 대해 도시되어있다실험은, Ribo를 P와 ssDNA를 상대로 알려진 IgG의 반응성과 양성 대조군 혈청을 사용 하였다. MFI-B는. 약 65,000의 값으로 포화 MFI-B 데이터 (B) LOG2 변환은 항원 반응성 넓은 범위의 양의 IgG 및 IgM의 채널에서의 선형 반응을 계시한다. 30,000의 MFI-B 동안, IgG의 신호가 포화되기 시작과 선형성을 푼다. 배열 기능 6 복제에 발견되었다. 그래프 배열 기능에 대한 평균 ± SD를 표시합니다. ssDNA를, 단일 가닥 DNA; MFI-B, 중간 형광 세기를 뺀 배경; 리보 P는 리보솜 P.는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54543/54543fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54543/54543fig5.jpg" /> 2 색 항원 마이크로 어레이와 류마티스 인자의 그림 5. 감지. <str옹&gt; (A)의 IgG, IgM의 및 IgG의 된 Fc는 이차 항체와 프로브 어레이에서 감지됩니다. 적색 형광 (IgM의 채널) 항 IgM의 차 항체의 결합을 나타낸다. 녹색 형광 (IgG의 채널) 항 IgG를 이차 항체의 결합을 나타낸다. 의 IgG의 Fc 항원은 과포화로 인해 흰색입니다. 높은 류마티스 인자 cryoglobulinemic 혈관염 환자에서 혈청 프로빙 (B) 배열입니다. IgG의 기능으로 인해 IgG를 고정화하는 환자의 혈청에서 IgM의 결합에 녹색 - 노란색이다. IgM의 기능이 주황색으로 표시되는 흥미롭게도,이 환자는 IgM의 대한의 IgG 항체를 보유하고 있습니다. 환자는 선천성 심장 질환의 역사를 가지고 있으며 IgG의 및 IgM의는 이차 항체와 프로브 어레이의 특징은 이차 항체가없는 것을 알 수의 심장 단백질 트로포 닌 C. (C) 정량 높은 반응성을 가지고 주목 어떤 교차 반응성. (D) 부량환자 혈청 프로브 어레이의의 IgG 및 IgM의 기능 류마티스 인자의 존재를 확인한다. 기능 중복에 발견하고 약 500 μm의 직경입니다 있습니다. 그래프 배열 기능에 대한 평균 ± SD를 표시합니다. MFI-B, 평균 형광 강도를 뺀 배경. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54543/54543fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54543/54543fig6.jpg" /> 2 색의 배열 그림 6. 개발 마우스 혈청 항체 프로필한다. (A) 배열 이차 항체 만 프로브. 붉은 형광은 항 - 마우스 IgM의 이차 항체의 결합을 나타냅니다. 녹색 형광 항 마우스 IgG 이차 항체의 결합을 나타낸다. 어레이 상에 발견 된 마우스의 IgG는 항 각서 의해 검출SE IgG를 이차 항체 만이 항 - 마우스 IgM의 차 항체에 의해 검출된다 발견 된 마우스 IgM의. 이차 항체에 의해 검출 된 배열에 다른 기능은 마우스 IgG를 마우스 IgM의에 대한 포획 항체이다. 히스티딘 태그에 대한 마우스 IgG 단일 클론 항체로 프로브 (B) 배열입니다. 이 배열에서, P Ribo를 항원 (그 태깅 된 단백질을 재조합)는 단지 항 마우스 IgG 이차 항체에 의해 검출되었음을 나타내는 녹색이다. 이는 단일 클론 항체는 IgG의 이소 타입이다 주어진 것으로 예상된다. Ribo를 P 항원은 배열이 혼자 차 항체 (오렌지 박스)와 프로브 때. 검출의 IgG, IgM의의 (C) 정량 및 Ribo를 P는 히스티딘 태그에 대한 마우스 IgG의 모노클로 날 항체로 프로브 어레이에서 기능하지 않습니다. 배열 기능은 여섯 복제에 발견하고 약 500 μm의 직경입니다 있습니다. 그래프 배열 기능에 대한 평균 ± SD를 표시합니다. MFI-B, 메디안 불소강도 마이너스 배경을 escence; 리보 P는 리보솜 P.는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54543/54543fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54543/54543fig7.jpg" /> 배열 이미지 위에 그림 7. 정렬 템플릿 그리드가.이 스크린 샷에서, 여자 파일에서 생성 된 템플릿 그리드는, 이전에 스캔 한 항원 마이크로 어레이에 정렬했다. 이 배열은, 전신성 홍 반성 루푸스, 많은자가 항체 반응성을 가진 혈액 응고 질환이있는 환자로부터의 혈청으로 프로빙 하였다. 녹색 형광의 IgG 항체의 결합을 나타내며, 빨간색 형광 대한 IgM 항체의 결합을 나타냅니다. 고체 핀에 의해 인쇄 기능은 거의 원형 쉽게 마이크로 어레이 소프트웨어 (제품, GenePix)에 의해 설명되어 있습니다. 격자의 정렬이 완료되면 softwar전자 배열의 각 기능에 대한 평균 형광 강도 마이너스 (모두를 Cy3와 Cy5에 채널) 배경을 계산할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54543/54543fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

generation-two-color-antigen-microarrays-for-simultaneous-detection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.7K 조회수.  University Health Network. We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest. 

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...