이 작품은 약 발견과 (각각 P20GM104316 및 P30의 GM110758-01) 국민 건강의 국립 연구소에서 장군 의학 연구소에서 제도 개발 수상에 의해 자금 고급 생체 적합 물질, 퓨 자선 트러스트에서 델라웨어 코 브레 프로그램에 의해 지원되었다 (00026178), 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 상 (DMR-1253906)에 버로우즈 웰컴 기금 (1,006,787), 델라웨어 대학의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) IGERT SBE2 프로그램 (L. Sawicki 씨에 교제). 저자는 공 초점 현미경에 대한 교육과 액세스를 위해 델라웨어 대학의 델라웨어 생명 공학 연구소 BioImaging 센터 감사, 미스 캐서린 윌 에이 비디오 촬영하는 동안 도움 씨 마태 복음 Rehmann 관대 골수, 교수 크리스토퍼 J에서 분리 된 중배엽 줄기 세포를 제공하는 자동 플레이트 리더를 사용합니다. Kloxin 씨 스티븐 마 관대하게 제공하는 포토 마스크, 그리고 교수 윌프레드 첸. </p&gt;

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The authors have nothing to disclose.

여기에 제시된 절차는 티올 - 엔의 클릭 화학에 의해 형성된 하이드로 겔 내에서 세포를 photoencapsulate하는 기술에 대해 설명하고 이후 생화학 적 단서와 젤을 photopattern. 처음 하이드로 겔을 형성하는 광을 이용하여 중합 전에 중합체 용액 내에서 균일하게 혼합하고, 세포 현탁액을 허용한다. 신속한 중합 &quot;잠금&quot;정의 된 몰드의 형상의 겔 및 하이드로 겔 네트워크 내에서 세포를 현탁 캡슐화한다. 젤은 원하는 최종 용도에 따라 여러 가지 형상 (예를 들면, 유리 슬라이드 나 주사기 팁)으로 성형 될 수있다. 광 감쇠가 얇은 시료 내에 한정되어 예를 들어, 유리 슬라이드에 부착 된 하이드로 겔의 3 차원 배양에 캡슐화 된 세포 이미징 애플리케이션에 특히 유용하다. 주사기 금형 단시간에 제조 할 수 많은 샘플을 허용 세포의 빠른 밀봉 사용될 수있다 (유리 슬라이드에 비해이러한 세포 계측법 또는 qPCR에 따라 유동 세포의 다수의 요구 실험에 사용할 수있는 (S)). 그 후,이 젤은 그러한 분화 또는 침공으로 원하는 세포 반응을 유도하는 생화학 적 단서로 패턴 화 될 수있다. (30, 31) 생존 및 대사 활성에 대한 분석은 주어진 자료 시스템 셀 패터닝 상태의 생존을 나타낸다. 신진 대사 활동이 세포 기능에 중합 및 패터닝 조건의 초기 효과를 평가하기 위해 비 분해성 젤에서 3 일까지 (RGKGRK 펩티드 가교)를 모니터링 하였다합니다. 또한, 분해 펩타이드 가교 (GPQGIWGQ) 배합 젤의 후 캡슐은 세포 생존과 문화에 1 주 확산 남아 지원 1, 6 일째 중배엽 줄기 세포의 막 무결성 분석 (라이브 / 죽은 생존 / 세포 독성 염색). 추가 세포주의 생존은 32 것과 유사한 포토 패터닝 조건보고되었다여기에 사용되는 실시간 / 죽은 염색 및 대사 활성 분석을 사용하여 설명 된 하이드로 겔 시스템을 평가할 수있다. 우리는이 재료 시스템과 관련된 프로 시저 (4.2 및 4.3)을 사용하여 세포 생존 문제가 관찰되지 않은 반면, 일부 세포 유형은 유리 라디칼 및 / 또는 광 노출에 민감 할 수있다. 이 경우, 사용자는 아 지드 - 알킨 12 FXIII 31 또는 딜스 - 알더 계 하이드로 겔 형성 화학 비 광 개시 물질 시스템을 쓸 수있다. (33) 손쉬운 기술은 감지하고도 (3.1 및 3.2)을 제시 겔 내에서 생화학 적 단서의 패턴을 정량화한다. 시약은 상업적으로 입수 가능하고 별도의 합성 공정 단계 또는 더 비싼 시약 (예를 들어, 형광 표지 된 펩티드)가 필요 없기 때문에 엘만 (Ellman) 분석법이 특히 중요하다. 엘만 (Ellman) 분석을 정확하게 differe 아래 생화학 단서 자유 티올의 변경을 결정하기 위해 사용될 수있다NT 조건을 포토 패터닝뿐만 아니라 신속하게 패턴을 시각화. 펩티드 결합의 양적 측정으로서, 펩티드 결합 전과 후의 패터닝 티올 관능기 농도를 정량화 직접 엘만 (Ellman) 분석법으로 평가된다. 정량이 유형의 형광 표지 된 펩티드를 사용하여 수행 할 수 있지만, 34 촬상 계 정량 이상의 시간이 걸리는 처리 및 분석 단계가 필요 (예를 들어, 검량선의 형광 표지 된 펩티드 및 생성의 합성 펩티드 농도 형광 관계를 맺기 위해서는 ) 이미지 분석을 사용. 촬상 펩티드 혼입, 엘만 (Ellman) 시약에 직접 샘플에 도포하고 즉시 구상 할 수있다. X 축 및 패턴 시각화, Y 평면에 한정되는 반면,이 기술은 유리 티올기를 함유하는 기질이 패터닝되어있는 경우를 결정하기 위해 간단한 통상적 인 방법으로 사용될 수있다. 은 엘만 (Ellman) 분석법 C 아니라는 것을 유의해야onsidered cytocompatible는 photopatterns 관찰하고 정량화하는데 이용 될 수 있도록하면서, 그것은 세포의 존재하에 수행 할 수 없다. 입체적으로 세포의 존재 패턴을 이미징, 하이드로 겔 매트릭스 내의 형광 펩티드의 결합은 강력하고 널리 사용되는 방법 남아있다. 패턴의 해상도는 Y 축, X 축에서 평가 될 수 있고, Z 평면 공 촛점 현미경을 사용하고, 패터닝 된 영역 또는 비 패턴 영역 내의 셀들이 식별 될 수 있도록이 방법 cytocompatible이다. 함께 찍은, 엘만 (Ellman) 분석 및 이미징 기반 기술은 연구자들이 모두 양적 및 질적 자료 시스템 내에서 생화학 적 단서의 포토 패터닝을 평가하기위한 보완적인 도구입니다. Photoclick 또는 더 넓게 광 개시는 세포의 존재 하에서 하이드로 겔의 형성을위한 화학 및 수정이 많다. 여기에 제시된 성형, 캡슐화, 패터닝 기술은 액세스 제한되지 않습니다전술 한 재료 시스템으로 제한없는 및 그러한 티올 알킨 35 지드 - 알킨, 4 및 기타 티올 - 엔 화학 (예, 티올 넨) 10,13뿐만 아니라와 같은 다른 광 - 기반의 화학 물질에 적용 할 수있다 예컨대, 이르가 큐어 2959, 에오신 Y, 및 캄 포르 퀴논 등의 다른 광개시제. 사용자가 프로 시저 매개 변수를 조정해야 할 수도 있습니다 (예를 들어, 배양 시간, 중합 시간, 세포 밀도는) 조건이 다른 시스템에 대한 cytocompatible 남아 있는지 확인합니다. 패터닝 처리는 하이드로 겔 (2.2.3-2.2.5)로 ALLOC 변성 펩티드 (들)의 확산을 필요로하기 때문에,이 프로세스는 인테그린 - 결합 부분 (예를 들면, 펩타이드 또는 세포 외 기질 단백질의 첨가에 가장 유용 할 수있다 네트워크에 대한 리간드의 부착은 셀 전체 인테그린 활성화에 의해 견인력의 생성에 필요한 하이드로 겔에 단편). 36 주, 생체에 대한 그 수도솔루션 또는 고정 (예를 들면, 성장 인자 또는 사이토 카인)에 유사 활성화, 하이드로 겔에 부분 확산 (~ 1 시간)의 배양 단계는 패터닝 결과를 나선상 이벤트를 신호로 이어질 수 있습니다. 다른 방법은 패터닝 성장 인자 고정화 또는 로컬 격리 확립되었다. 37-39는 또한 패턴 해상도는 노광에 대한 제어에 의해 결정된다. 여기서, 포토 마스크 겔 깊이 통과하여 X 및 Y 평면에 패턴 작성을 허용; 그러나, 겔 내의 생화학 큐 패터닝을보다 공간 제어는 X 방향의 패턴, Y- 및 Z- 평면을 생성하기위한 두 개의 광자 공 초점 현미경의 사용과 같은 방사의 다른 방법으로 달성 될 수있다. 34,40 마지막으로,이 과정에서 사용되는 재료 시스템이 초기에만 생화학 단서로 변형되는 동안, 직교 photoclick 화학은 알테를 허용하도록 사용될 수 있음에 유의해야여기에 제시된 시간에 매트릭스 속성에서 식량. (12) 절차와 기술은 잘 정의 및 시공간으로 제어 특성을 가진 합성 매트릭스를 생성하기위한 현재의 접근 방식에 다양성을 추가 할 수 있습니다. 특히,이 과정에서 사용되는 시약 및 물질의 상업적 유용성은 제어 된 세포 배양에서의 애플리케이션을 위해 하이드로 겔 기반 바이오 물질의 이용에 관심이 연구자의 넓은 범위에서 유용 할 것이다.

클릭 화학은 점점 더 자신의 선택, 효율적으로, 그리고 자주 cytocompatible 반응성으로 인해, 약물 전달, 조직 공학, 제어 세포 배양 등 다양한 생물 의학 응용, 재료의 설계에 사용됩니다. 트리거 빛을 활용 1-3 Photoclick 화학 또는 반응을 개시 (예를 들면, 아 지드 - 알킨, 4- 티올 - 엔, 5, 테트라 졸 알켄 6)는 생체 물질의 형성 또는 수정을 위해 특히 중요하다. 그들은 빛을 발생하는 세포의 존재 생체 재료 특성의 사용자가 직접 제어에 적합. 특히 7, 8 이러한 반응을 온화한 조건과 때의 통제하에 빠른 속도는, 티올 - 엔의 photoclick 화학 물질이 사용되어왔다 없는 견고한 기계적 성질 5,9 함께 포함하지만, 세포 유형의 다양한 밀봉 용 겔 - 기반 생체 물질을 생성또한, 이러한 화학이 주요 측면을 모방하는 생화학 적 단서의 공간적 패턴에 사용 된 t 세포 배양 및 전달을위한 약속, 인간 중간 엽 줄기 세포 (중배엽 줄기 세포), 섬유 아세포, 연골 세포, 췌장 세포, 제한. 10, 11 원시 세포 미세 환경 및 부착, 분화 및 침입는 해당 셀 매트릭스 상호 작용을 촉진한다. 3,12 일반적으로 cytocompatible 조건에서 빠른, 광 개시 중합 아크릴 레이트 또는 노보 넨 ( &#39;엔&#39;)으로 작용 중합체와 반응시킨다. 빛 티올 엔 하이드로 겔, 시스테인 (티올)를 포함하는 펩티드의 건설 (13)이 도구 상자를 확장, 우리는 설정하고자 최소한의 합성 처리를 요구 또는 합성 세포 외 매트릭스 그들의 광범위한 사용을 향해 상업적으로 사용할 수 있었던 새로운 다목적 접근 빌딩 블록과 하이드로 겔 형성 방법에 관한 것이다.[비 분해성 또는 세포 분해 가교를 위해 K를 (세포 부착 [K (ALLOC) GWGRGDS = Pep1Alloc] 또는 둘을 촉진하기 펜던트 하나, 인테그린 결합 그룹 : 14 구체적으로는, 펩티드 (Alloc를) 알릴으로 수정 된이 라이신을 -protected ALLOC) RGKGRKGK (ALLOC) G 또는 KK (ALLOC) GGPQGIWGQGK (ALLOC) K = Pep2Alloc, 각각]. 이러한 순서로, 조건은 네 개의 암 티올 - 개질 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG4SH) 장파장 자외선 (365 nm에서 10 mW의 / cm 2)의 cytocompatible 용량 사용에 신속한 반응 (1-5 분) 확립 된 광개시제 리튬 페닐 -2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate (LAP). 그 결과 하이드로 겔은 주에 대한 세포 배양 조건에서 안정. 셀 기반의 분해 및 리모델링을 활성화하기 위해, 효소 분해성 펩티드 겔 가교 (즉, GPQGIWGQ), (15) 및 모델 차 전지, 인간 중간 엽 줄기 세포 (중배엽 줄기 세포) 내에 설립되어, 두린 캡슐화 및 후 매우 실용적 남아이 행렬에서 g 문화. 또한, 펩티드는 공간적으로 이러한 물질 내에서 패턴 화되어 있고, 중배엽 줄기 세포는 생존과 포토 패터닝 조건에서 대사 활성 상태로 유지됩니다. 다른 펜던트 펩티드 서열이 여기에 도시되지 않은 (예 IKVAV는 YIGSR, GFOGER 등)도 주위의 미세 환경과 추가적인 세포 상호 작용을 조사하기 위해 매트릭스 내에 통합 될 수있다. 이러한 결과는 다양한 종류의 세포에 대한 연구에 3 차원 (3D) 세포 배양 및 전달 이러한 하이드로 겔 계 물질의 도포 직접적인 세포 - 매트릭스 상호 작용을위한 유망한. 여기서, 방법은 세포를 photoencapsulate하고 제안 된 하이드로 겔 시스템 내에서 연속적으로 photopattern 생화학 적 단서 (그림 1)되게됩니다. 관찰하고 이러한 photopatterns을 정량화하는 기술이 입증되어 특히, ⅰ) 엘만 (Ellman) 분석의 양적, 질적 사용이 modifica를 결정하기 위해패턴 화 된 기판과 형광 펩타이드 (AF488Pep1Alloc)의 ⅱ) 보완 질적 사용 내에서 무료 티올의 기 세 가지 차원에서 이러한 패턴을 관찰합니다. 또한, 생존력 분석법 (생균 / 죽은 생존력 / 세포 독성 염색) 및 대사 활성을 측정하기 (MTS 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4- 설포 페닐) 사용자가 하이드로 겔 매트릭스 내의 다른 세포주 photoencapsulation 및 포토 패터닝 cytocompatibility 조건을 결정할 수 있도록 -2H-졸륨)가 제시된다. 프로토콜이 용이 한 광 기반 photoclick 하이드로 젤 시스템 시연되고 있지만, 기술은 세포의 존재 photoencapsulation 포토 패터닝 및 수많은 다른 라디칼 - 개시 하이드로 시스템에 적용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">Custom Peptides</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">4arm PEG Thiol, MW 20k</td>
			<td style="width:161px;">JenKem USA</td>
			<td style="width:123px;">4ARM-SH</td>
			<td style="width:331px;">Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate</td>
			<td style="width:161px;">Colorado Photopolymer Solutions</td>
			<td style="width:123px;">Li-TPO</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">149470</td>
			<td style="width:331px;">Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">682519</td>
			<td style="width:331px;">Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">213225</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">360473</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Flask, Round Bottom, 100 mL</td>
			<td style="width:161px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1506-05</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit</td>
			<td style="width:161px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1402-L-02</td>
			<td style="width:331px;">Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Magnetic Stir Bars</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Magnetic Stirring and Hot Plate</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Vacuum Dessicator</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Deuterium Oxide</td>
			<td style="width:161px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:123px;">16630</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14190-250</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Fungizone</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15290-018</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15400-054</td>
			<td style="width:331px;">Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">1.5 or 2 mL sizes, sterile.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle)</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-823-16H</td>
			<td style="width:331px;">Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-544-1</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">High-Purity Silicone Rubber, 0.010&#34; Thick, 6&#34; x 8&#34; Sheet, 55A Durometer (Gasket)</td>
			<td style="width:161px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:123px;">87315K62</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Ethanol, 200 Proof</td>
			<td style="width:161px;">Decon Labs</td>
			<td style="width:123px;">2701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">RainX, Original</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:123px;">800002243</td>
			<td style="width:331px;">May be purchased from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SL2</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Photomasks</td>
			<td style="width:161px;">Advance Reproductions Corporation</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Photomask Division, different designs may be printed as desired.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">DTNB; Ellman&#39;s Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">PI-22582</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">E6758</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">S318</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Orthophosphoric Acid</td>
			<td style="width:161px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">33266</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Cysteine Hydrochloride Monohydrate</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7880</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">L-3224</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay</td>
			<td style="width:161px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">G3582</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Capable of speeds at 90-110 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Multiwell Plate Reader</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Epifluorescent or Confocal Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Omnicure Exfo Series 2000</td>
			<td style="width:161px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Zeiss Zen Lite Software</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">ImageJ</td>
			<td style="width:161px;">NIH</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-mediated formation and patterning of hydrogels for cell culture applications

클릭 화학은 약물 전달체, 조직 공학, 세포 배양 등 다양한 생체 물질 애플리케이션에 사용하기 위해 연구되었다. 이러한 광 개시 티올 - 엔 - 티올 반응 yne 같은 특정 광 매개 클릭 반응에서는, 소재 특성 통해 시공간 제어 수득 사용자 지향 특성 제어의 높은 수준의 시스템 설계를 허용한다. 제조 및 광 이들 티올 photoclick X의 화학적 성질에 의해 제공되는 기능성에 의해 제공되는 정밀도를 이용하여 겔 - 기반 생체 재료의 변형이 특히 잘 정의 된, 생체 모방 미세 환경 내 세포의 배양을 위해, 관심이 높아지고있다. 여기, 우리는 세포와 티올 엔의 photoclick 반응에 의해 중합 다양한 모듈 형 빌딩 블록을 사용하여 하이드로 겔 매트릭스 내에서 생화학 적 단서 후속 포토 패터닝의 photoencapsulation 방법을 설명합니다. 특히, 방법은 공동으로 제공된다알릴에서 nstructing 하이드로 겔 (Alloc를) -functionalized 펩티드 가교 펜던트 펩티드 잔기 빠르게 리튬 acylphosphinate 광개시제 및 장파장 자외선 (UV) 광의 cytocompatible 투여의 존재 하에서 중합 티올 - 관능 화 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG). 손쉬운 기술은 포토 패터닝을 시각화하고 설명하는 추가 된 펩타이드의 농도를 정량화한다. 또한, 방법은, 캡슐화 세포 특이 적 인간 중간 엽 줄기 세포의 확립 및 생존력과 활성을 측정한다. 형성 및 티올 ALLOC 하이드로 겔의 초기 패터닝 여기에 도시되어 있지만, 이들 기술은 크게 패터닝 기판을 생성하기 위해 다른 광 라디칼 개시 재료 시스템 (예를 들어, 티올 넨, 티올 레이트)의 개수에 적용될 수있다.

설치 및 절차는도 1에 도시되어 세포와 캡슐화 된 세포를 포함하는 후속 photopattern 겔 photoencapsulate하고, 스톡 용액을 제조 한 예는 10 중량 % 겔은 표 1에 제공된다 형성 하였다. 표 1을 사용하여, 단량체의 양 (PEG4SH을 , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) 및 하이드로 겔을 중합하는 데 필요한 광개시제 (LAP)을 계산한다. 이러한 계산을 바탕으로, PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc 및 LAP의 재고 솔루션을 준비하고 함께하고 형성하는 각각 (그림 1A)를 젤, 포토 패터닝을위한 Pep1Alloc없이 혼합. 그 후, 세포를 플레이트에서 수집 계산하고, 캡슐화 (그림 1B) 적절한 양으로 원심 분리된다. 세포 펠렛은 겔 형성 용액 (PBS 펩티드 / 폴리머 / LAP)에서 재현 탁하고, 세포 / 단량체 혼합물은 유리 주사기 몰 전사DS. 세포들은 빛의인가시 하이드로 겔 내에서 (도 1C) (10 mW의 / cm 365 nm에서 2 ~ 5 분)으로 캡슐화된다. (도 1D)을 포토 패터닝 들어 겔 중합 매트릭스 내로 펩티드 및 개시제의 확산을 허용하고, 1 시간 30 분, 30 분 Pep1Alloc 및 LAP에 침지된다. 이 펩티드 함유 겔은 원하는 패턴을 포토 마스크로 덮여 매트릭스 내에서 무료 티올에 펩티드 공역 빛 (1 분)의 두 번째 투여 량에 노출되어있다. 펜던트 사슬은 공유 적절한 세포 - 매트릭스 상호 작용을 촉진하고 체외에서 세포 기능과 운명을 프로빙 방향으로 원시 세포 미세 환경의 주요 기계적 및 생화학 적 특성을 흉내 낸, 빛에 노출 된 지역에서 젤에 연결되어 있습니다. 엘만 (Ellman) 분석은 photopatte 내에서 겔 수정 및 펩타이드 결합을 정량화 할 수있는 손쉬운하고 저렴한 방법을 제공rned 기판. 패턴 및 비 패턴 젤 (즉, 또는 펩티드 수정하지 않고 젤) 엘만 (Ellman) 반응 버퍼 후 중합에 배어있다. 다음으로, 시스테인 표준 및 버퍼에 담가 겔 48 웰 플레이트에 넣고 엘만 (Ellman) 시약 (왼쪽 그림 2A)와 함께 배양한다. 1 시간 30 분 후 샘플의 분취 량을 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 배치하고, 흡광도를 405 nm에서 기록된다. 시스테인으로부터 표준 검량선 (도 2a, 오른쪽) (흡광도 선형 피팅 농도 VS) 플롯하고, 겔의 자유 티올의 금액은 희석 인자에 기초하여 결정될 수있다. 10 중량 %의 겔의 여러 중합 조건에 포토 패터닝이 유리 티올 농도는도 2b에 도시되어있다. (파란색 막대, I = 1 분, II = 5 분) Pep1Alloc없이 1 또는 5 분 동안 중합 젤은 t을 나타내는 통계적으로 유사한 무료 티올 농도가모자 빠른 반응이 발생하고 겔화 1 분 (양측 t 검정, P&gt; 0.05) 내에 완료됩니다. 따라서, 빛에 추가 노출 (2-5분)는 작용기의 추가 전환 발생하지 않습니다. Pep1Alloc없이 1 분간 중합 젤 (30)과 90 분 (3 ㎎ / ㎖) 및 LAP (2.2 mM)을 (녹색 바, II = 30 분, IV = 90 분) Pep1Alloc 적신 빛의 두 번째 투여 량에 노출 1 분. 무료 티올의 감소 (1 분 조건에 대한 60-80%)는 이러한 조건 하에서 펜던트 단서와 젤의 효율적인 변경을 나타냅니다. 높은 변형이 필요한 경우, Pep1Alloc 용액의 증가 된 농도의 펩티드 용액 전환을 제한 할 수있다 희석 이상의 무연 티올로 Pep1Alloc 접근성로서 사용될 수있다; 예를 들어, 우리는 / ㎖ Pep1Alloc 20 mg의 최대 농도는 무료 티올의&gt; 90 % 변환을 생산하는 것으로 나타났습니다. 유일 펩티드의 패턴은 하이드로 겔에 첨가 할 수있다빠르게 엘만 (Ellman) 시약 (5 분 아래 그림 3A)으로 이미지화 될 수있다. 그러나, 패턴의 시각화 시간 (이상 5 분) 겔을 통해 노란색 TNB 2가 음이온의 확산으로 인해 이상 손실됩니다. 영상 해상도 개선 입체적 (X 축, Y 축, Z 평면)과 세포의 존재의 패턴을 관찰, 형광 펩티드 첨가 (AF488Pep1Alloc)가 이용 될 수있다. 그림 (b)의 x 축에서 y 축과 공 초점 현미경으로 촬영 한 이미지 스택의 Z-돌기 패턴 해상도 (μm의 규모)를 보여주는 표시됩니다. 약 (94 ± 2) %와 분해 젤 (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) 내에서 캡슐화 된 중배엽 줄기 세포의 (94 ± 1) %는 빨간색 핵 (몇 죽은 세포로 각각 1, 육일 캡슐화 한 후 실행 가능한 (녹색 세포 기관을) 유지 ) 관찰 (도 4A). 또한, hMSC 포스트 캡슐화 육일 (에서 관찰된다 확산 <st<html> 룽&gt; 그림 4A, 삽입), 세포 개조 및 인테그린 결합 RGDS와 수정이 MMP-분해 행렬과 상호 작용할 수 있음을 나타냅니다. 비 분해성 젤 (Pep2Alloc = RGKGRK)에 캡슐화 된 세포에서 수행 신진 대사 활동 분석 한 3 일 후 캡슐화 (그림 4B) 세포 생존 능력의 두 번째 측정을 제공하고 세포 테스트 다양한 photoencapsulation 및 포토 패터닝 조건에 대한 활성 상태로 유지 있음을 입증 엘만 (Ellman) 분석 (그림 2B). 특히 Pep1Alloc + LAP (상태 III 및 IV)과의 초기 밀봉 (조건 I 및 II)와 함께 30 분 및 90 분 인큐베이션 간 대사 활성의 유의 한 차이는 절차 포토 패터닝의 응용에 적합한 것을 나타내는 없다 캡슐화 된 세포의 존재는 (t 검정, p&gt; 0.05 양측). 2fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 하이드로 겔 내에서 세포를 캡슐화 이후 생화학 큐와 함께 포토 패터닝을위한 설정 (A) 거대 단량체 및 광개시제의 재고 솔루션이 준비되어 혼합 (PEG4SH = 백본, Pep2Alloc = 가교, Pep1Alloc = 펜던트 접착 부분 (RGDS), LAP = 광개시제 ). (B) 세포 캡슐화를 위해 수집됩니다. (C) 세포 (각각 PEG4SH / Pep2Alloc / LAP 또는 PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP)없이 또는 인테그린 결합 펩티드와 로머 솔루션을 혼합하고, 빛에 노출시 캡슐화됩니다. 겔 형성시에 과잉의 티올기를 함유하는 (D) 겔 (여기서, 2 mM의 과량의 티올 형성 PEG4SH / Pep2Alloc / LAP가) 즉 단일 ALLOC 기 (Pep1Alloc로 기능화 펩티드의 후속 첨가하여 생화학 큐 패터닝 될 수 있고, RGDS, IKVAV 등)에 세포 부착을 촉진하기겔의 특정 지역 내에서. 여기, 형광 표지 RGDS와 젤의 패턴이 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> 그림 2. 엘만 (Ellman) 정량 분석법 설정 및 결과 패턴 하이드로 겔의 변형을 평가 (A) 겔 및 시스테인 표준은 엘만 (Ellman) 시약과 함께 48 웰 플레이트에서 배양 하였다. 선형 표준 곡선이 겔 샘플에서 시스테인 농도를 결정하기 위해 도시된다. II = 5 분 중합; III = 30 분 배양 Pep1Alloc와 (B) 초과 무료 티올은 펜던트 ALLOC 펩타이드 (I = 1 분 중합와 패턴에 따라 겔 형성하는 동안 하이드로 겔 내에서 통합되어 소비 IV = 90 분 배양 위스콘신<html> 제 Pep1Alloc; III 및 IV 모두) 중합 1 분 동안 빛 패턴. 표시 데이터 (3 N =) 표준 오차를 나타내는 오차 막대로 평균을 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> 도 3. 엘만 (Ellman) 분석 및 형광 이미지 photopatterned 하이드로 겔을 시각화 (A) 엘만 (Ellman) 시약을 신속 X-의 패턴 (라인) 및 Y 평면 (황색 = 비 패턴 영역 눈금 막대 = 1mm)을 탐지하는데 이용 될 수있다. (B) 형광 펩티드 Y 축, X 축에 패턴을 관찰하기 위해 사용될 수있다, Z 평면 (녹색 패턴 영역 = 200 ㎛의 스케일 바, 10X 물 침지 목적, 예 / 엠 525분의 488 ㎚).large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . 그림 4 : 생존 및 비 분해성 photopatterned 하이드로 겔 내에서 세포의 신진 대사 활동 (A) 예 촛점 Z - 스택 (Z 프로젝션, 10 배 물 침지 목적) 실행 가능한 (녹색, 예 / 엠 525분의 488 ㎚) 및 죽은 중배엽 줄기 세포 (빨강, 예 / 엠 580분의 543 nm의)는 하이드로 겔 내에서 캡슐화 24 시간 후 캡슐화 (스케일 바 = 200 μm의). 육일 캡슐화 (삽입 이미지, 스케일 바 = 50 μm의) 후 이러한 하이드로 겔 내에서 확산 세포. (; II = 5 분 중합 I = 1 분 중합) 및 패터닝 조건 (III = Pep1Alloc 30 분 배양 (B) 세포는 1 3 일 (각각 어둠과 빛 바,) 다양한 중합 후 캡슐화는 대사 활성 ; IV = 90 분 incubatioN Pep1Alloc와; 모두) 중합 1 분 동안 빛 패턴. 표시 데이터 (3 N =) 표준 오차를 나타내는 오차 막대로 평균을 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> 표 1 : 예 설정이 하이드로 겔을 만들기위한 재고 솔루션의 볼륨을 계산하는 파란색 강조 스프레드 시트 내에서 셀 사용자 정의 매개 변수를 표시하는 단계;. 다른 수량은 이러한 설정을 기반으로 계산됩니다. 겔을 만들기 위해 각각의 원액에 대한 최종 볼륨이 주황색으로 강조 표시됩니다. 백혈구는 사용자 정의 파라미터들에 기초하여 최종 부피를 계산하는 데 사용되는 화학식을 포함한다. 2.2 MM의 LAP의 농도가 0.067 중량 %에 해당합니다.

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Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

light-mediated-formation-patterning-hydrogels-for-cell-culture

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.9K 조회수.  University of Delaware. We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented. 

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Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

연구

생체공학

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

세포 네트워크의 창조를위한 플라즈마 리소그래피 표면 Patterning

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...