이 연구는 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금에서 교부 금에 의해 주로 지원 되었다 (G.D. 하 12SDG12050083)는 건강의 국가 학회 (R21HL102773, G.D.에 R01HL118245)와 국립 과학 재단 (CBET 1263455 및 G.D. CBET-1350240).

1. 하이드로 겔 합성에 대 한 자료 준비 PEGDA, 리튬 페 닐-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (무릎), 그리고 fibronectin 무 균 조건 하에서 <ol><li>준비 재고 솔루션 기반 계산 (표 1A).
	<ol><li>밖으로 무게와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 화합물을 디졸브. 일반적으로, PEGDA 솔루션 농도 사이 50 및 200mg/mL (5-20% 무게/볼륨) 작업을 유지 관리 합니다. 살 균을 위한 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 PEGDA 솔루션 플라스틱. 
		참고: PEGDA 솔루션 호 일 빛에서 그들을 보호 하기 위해 배치로 덮여 유지. (권장) 각 실험에 대 한 PEGDA의 신선한 솔루션 준비.</li>
		<li>Reconstitute fibronectin 단백질 분말 제조 업체에 따라 &#39; s 추천. 1 mg/mL, aliquot에서 fibronectin 재고 솔루션을 유지 60 ~ 100 µ L aliquots에 그것을 사용까지-20 ° C에서 그들을 저장 하 고. 몇 시간 동안 4 ° C에서 aliquots를 녹 이십시오 또는 하룻밤 전에 사용. 단백질 주식 살 균 조건에 이미 제공 하지 않으면, 0.22 μ m 주사기 필터를 사용 하 여 살 균에 대 한. 
		참고: Fibronectin 셀 첨부 파일에 사용 됩니다. 다른 ECM 단백질 대용 될 수 있다.</li>
		<li>무릎 밖으로 무게를 재고 솔루션에 대 한 PBS에 녹; 전형적인 재고 농도 25 mg/mL 이다. 용 해와 어떤 문제가 sonicate. 살 균을 위한 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 호 일 포장으로 무릎을 커버 하 고 몇 개월까지 4 ° C에서 그것을 유지. 
		참고: 무릎은 photoinitiator는 광화학에 대 한 사용.</li>
	</ol></li> <li>하이드로 겔 형성에 대 한 살 균 유리 슬라이드 금형을 준비.
	<ol><li>오토 클레이 브는 폴리에스터 시트; 각 젤 형을 위해 필요할. 적어도 2 시간에 대 한 70% 에탄올에서 두 개의 유리 슬라이드와 각 젤 형에 대 한 3 명의 플라스틱 스페이서 (두께 0.5 m m)를 적시십시오 하지만 일반적으로 하룻밤 담가 수 있도록. 사용 하기 10 분 전에 대 한 70% 에탄올에 각 젤 형에 대 한 5 개의 바인더 클립을 담근 다.</li>
		<li>장소 유리 슬라이드, 스페이서, 및 작은 압력가 시트에 바인더 클립 있도록 공기 건조 몇 시간 동안 세포 문화 후드에서.</li>
		<li>유리 슬라이드의 가장자리 주위에 플라스틱 스페이서를 배치 하 여 준비 히드로 금형. 두 번째 유리 슬라이드를 위에 놓습니다. 바인더 클립 위에 긴 양쪽에 2 개 나란히 단단히 스페이서 보안. 
		참고: 경우이 제대로 조립 하지는 젤 솔루션 것입니다 밖으로 누출.</li>
		<li>표면 소독 셀 문화 형 후드 사용 하기 30 분 전에 대 한 자외선. 중간을 통해, 플립 두 표면 노출 형.</li>
	</ol></li></ol> 2. 무료 Thiol 단백질 수정 <ol><li>아민 단백질 (표 1A)에 thiol로 변환 하기 위한 스프레드시트에서 계산을 사용 하 여 재고 솔루션 준비.
	<ol>반응 버퍼 수 있도록 <li>pH 8에 PBS를 조정 하 고 5 mM EDTA를 추가. 피 펫 멸 균에 대 한 0.22 μ m 주사기 필터에 반응 버퍼. 
		참고: EDTA은 중요 하다, 그것은 이황화 결합 형성에서 thiols를 보호. Thiol 그룹 반응 발생에 대 한 그들의 감소 된 모양에서 유지 되어야 합니다.</li>
		<li>2 iminothiolane 밖으로 무게 (Traut &#39; s 시 약) 2 mg/mL (14mm)의 재고 솔루션 농도 대 한 반응 버퍼에 그것을 분해 하 고. 살 균을 위한 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 몇 개월까지 4 ° C에서 재고 솔루션 저장. 
		참고: 2-iminothiolane는 분자 단백질에 솔벤트 노출 무료 아민과 반응 하 고 무료 thiols로 그들을 변환 합니다.</li>
		<li>Reconstitute 0.1와 1 mg/mL 농도에서 반응 버퍼에 단백질. 하지 않는 한 이전 살 균, 살 균에 대 한 0.22 μ m 주사기 필터를 통해이 솔루션을 플라스틱. 
		참고:이 단백질은 하이드로 겔 표면에 무늬 생 화 확 적인 신호 이다. 또한, 단백질 농도 다를 수 있습니다, 높은 농도 이상적 강한 단백질 패턴.</li>
	</ol></li> <li>2 iminothiolane와 단백질 둘 다 재고 솔루션을 함께 혼합 하 여 반응; 표 1B를 사용 하 여 올바른 볼륨 비율. 일반적으로 단백질을 8:1 2 iminothiolane의 어 금 니 비율을 사용 하 여. 
	참고: 큰 단백질 이상 농도 희석, 2-iminothiolane의 높은 어 금 니 비율을 사용 합니다. 제조 업체를 참조 &#39; s 프로토콜 15.</li>
	<li>품 실 온에서 1 h에 대 한 반응. 제조 업체에 따라 나머지 반응에서 thiolated 단백질 제품을 제거 하려면 염 스핀 마이크로-열을 사용 하 여 &#39; s 프로토콜 16. 
	참고:이 수 지의 배제 한계는 5 KDa.</li>
	<li>사용 덮어 &#39; 단백질 당 무료 thiols의 수 양적 측정 분석 결과 s. 제조 업체에 따라 &#39; s 프로토콜 분석 결과 17.</li>
</ol> 3. 하이드로 겔 형성 <ol><li>만들기 젤 전조 솔루션 값에 따라 표 1 c에서 계산. 믹스 함께 PEGDA, fibronectin, 및 무릎 볼륨. 균질 성 해결책을 보장 하지만 거품을 만들지를 적극적으로 솔루션 플라스틱 솔루션은 빛 으로부터 보호 유지.</li>
	<li>플라스틱 젤 전조 솔루션 젤 형의 두 유리 슬라이드 사이 신중 하 게. 일반적으로, 금형에 800 그리고 1000 µ L 사이 볼륨을 추가 합니다. 노출 형 UV 빛을에 젤 솔루션 (파장: 365 nm, 전원: 3-4 mW/cm 2) 1-2 분은 하이드로 겔 형성. 
	참고: 그것은 기능을 패턴화 표면 단백질 제한으로 장기간된 자외선에 하이드로 겔을 노출 하지 마십시오.</li>
	<li>바인더 클립 제거 하 고 부드럽게 두 측면 스페이서에 압력 반대 위치에 적용 하 여 최고의 유리 슬라이드를 제거.</li>
	<li>적절 한 크기의 생 검 펀치를 사용 하 여 하이드로 겔 샘플을 잘라. 복제 역할 및 샘플 제어 젤 사각형에서 여러 hydrogels 퇴근.</li>
</ol> 4. 하이드로 겔 강성 측정 8mm 병렬 플레이트 고분자에 대 한 <ol><li>펀치 hydrogels는 8 개 m m 직경 생 검 펀치. 고분자에 한 하이드로 겔 샘플을 로드 (재료의 표 참조).</li>
	<li>낮은 병렬 플레이트 형상 만들기까지 직경에서 8 m m 즉 젤의 표면 접촉. 0.5 m m 두꺼운 하이드로 겔 샘플 0.5 m m의 간격 거리를 유지.</li>
	<li>0.1% 변형, 0.1 Hz 주파수, 및 37에 5 분에 대 한 수행 시간 스윕 ° C. 평균 G &#39; 각 시간 청소 값. 각 구성의 복제에 대 한 독립적인 hydrogels 실행. 
	참고: G &#39; 값 한다 안정적일 시간 포인트; 그들은, % 변형 및 주파수 스윕 적절 한 선택 하려면 수행 해야 하는 경우 값 14.</li>
</ol> 5. 단백질 패턴 <ol><li>준비 컴퓨터 원조 설계 (CAD) 프로그램을 사용 하 여 포토 마스크에 대 한 원하는 패턴. 고해상도 프린터를 사용 하 여 투명 시트에는 포토 마스크를 인쇄 합니다. 사용 하기 10 분 전에 대 한 70% 에탄올에는 포토 마스크를 담근 다. 사용 하기 전에 셀 문화 후드에 건조 공기를 포토 마스크 허용.</li>
	<li>표면 패턴화 된 하이드로 겔의 표면에 2 단계에서 준비 하는 thiolated 단백질 해결책을 추가 합니다. 플라스틱 thiolated 각 컷 아웃 젤의 표면에 단백질 해결책의 1-2 µ L/c m 2. 
	참고: 그것은 단백질 볼륨;을 최소화 하는 것이 중요 균등 하 게 하이드로 겔 샘플의 전체 표면을 커버 하기에 충분 한 추가.</li>
	<li>신중 하 게는 히드로의 표면에는 포토 마스크를 놓습니다. 포토 마스크 및 하이드로 겔 표면 사이 공기 방울을 허용 하지 않습니다. 부드럽게 눌러 모든 거품을 제거 하는 마스크에 그 형태.</li>
	<li>노출 UV 빛의 두 번째 라운드에 하이드로 겔 (파장: 365 nm, 전원: 3-4 mW/cm 2) 30-60 미에 대 한 
	참고: 패턴을 만들는 강력한 단백질 기능의 상실을 유발 하지 않고 충분 한 UV 빛에 노출 패턴에 중요 하다.</li>
	<li>Hydrogels 제거 하 unreacted 종 고 잘 배지 내의 각 히드로 PBS로 세척. 각 잘;에 젤을 배치할 때 조심 패턴화 된 표면 위로 얼굴 인지 다는 것을 확인 하십시오. 4 ° C에서 PBS에는 젤을 씻어 젤은 4에 적어도 2 주 동안 안정적인 ° c.</li>
</ol> 6. 셀 시드 Hydrogels 준비 <ol><li>뿌리기 전에 37 ° C에서 5-10 분에 대 한 기저 매체에 젤을 품 어. 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs), 성장 인자 없이 EGM 2 매체 사용 하 여. 각 추가 매체의 볼륨을 최소화 히드로 부동 방지 하기 위해 잘. 48-잘 접시 사용 매체의 250 µ L 볼륨.</li>
	<li>스핀 300 x에 접시 내려 g는 hydrogels 우물의 하단에 위치 하 고 부유 하지 3 분. 셀 뿌리기 직전 이렇게.</li>
</ol> 7. Hydrogels에 시드 셀 셀 시드를 위한 <ol><li>사용 표준 살 균 포유류 세포 문화 절차 및 실험 절차. 표준 세포 분리 프로토콜을 사용 하 여 조직 배양 플라스 크에서 HUVECs를 제거 합니다. 살 균 PBS 가진 조직 문화 접시를 세척 하 고 37에서 3-5 분에 대 한 트립 신으로 품 어 ° c.</li>
	<li>초과 셀 매체 또는 트립 신 중 화제 솔루션 trypsinized 세포 현 탁 액을 끄다.</li>
	<li>5 분 신중 하 게는 상쾌한을 제거 하 고 계속 셀 펠 릿 세포 현 탁 액 300 x g에서 원심 분리기에 아래로 회전.</li>
	<li>없는 성장 요인으로 기저 EGM-2에서 셀 펠 릿을 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀 카운팅을 위한.</li>
	<li>추가 75000 셀/cm 2 각 하이드로 겔을 천천히 잘을 방해는 젤 각 센터에 pipetting으로 표면. 위치에서 37 ° c. 셀 문화 인큐베이터에 잘 플레이트 대 한 일, 주기적으로 관찰을 위한 접시 제거.</li>
</ol> 8. Bioactivity의 평가 <ol><li>하룻밤에 37 ° C와 200 rpm에서 궤도 정지에서 파운드 국물에서 문화 E. 콜라이. 대장균 문화 아래로 회전 시키십시오, 가만히 따르다, 그리고 PBS의 최소 볼륨에서 셀 펠 릿을 다시 구성 하기. lysozyme 밖으로 무게 및 재고 솔루션 1 mg/mL에서 reconstitute.</li>
	<li>는 Microcentrifuge 튜브 lysozyme 재고 솔루션의 작은 양 (25 µ L) 플라스틱. 무릎 photoinitiator (0-12 m m)의 다양 한 레벨을 추가 하 고 UV 빛의 1 분 샘플을 노출. 별도 그룹에서 lysozyme 솔루션 랩 (2 mM)의 동일한 금액을 추가 하 고 다양 한 UV 빛 시간 샘플을 노출 (0-4 분). 각 치료에 대 한 복제를 포함.</li>
	<li>추가 동등한 양의 집중된 대장균 0.5 mg/mL의 최종 lysozyme 단백질 농도 대 한 각 lysozyme 샘플 솔루션. 실 온에서 4 h 혼합된 솔루션을 품 어. 
	참고:이 시간 기능 lysozyme lyse 세균성 세포 벽 및 솔루션으로 단백질을 풀어 수 있습니다.</li>
	<li>치료 lysozyme 긍정적인 통제에 대 한 대장균과 인 큐베이 팅을 사용 하 여이 100% 생리 활성 측정을 고려. PBS 부정적인 제어로 혼자와 incubated lysozyme 솔루션을 사용 하 여.</li>
	<li>세포 파편을 제거 하 고 상쾌한을 유지 샘플 아래로 회전 합니다. 척도 lysate 박테리아의 양을 측정 하는 상쾌한 내 단백질의 총 농도를 Bradford 분석 실험을 실행.</li>
	<li>실행 제조 업체에 따라 Bradford 분석 실험 &#39; s 프로토콜 18. 배 부정적인 제어에 비해 단백질 농도 변경 계산.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-effects+of+matrix+low+elasticity+and+aligned+topography+on+stem+cell+neurogenic+differentiation+and+rapid+neurite+outgrowth.">Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth.</a> Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).</li><li>Evans, N. 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저자는 공개 없다.

이 프로토콜에는 생물 학적 응용에 대 한 생리 활성 단백질 패턴을 만들기 위한 방법을 제공 한다. 다른 실험을 위해이 프로토콜에 맞게 만들 수 있는 몇 가지 수정이 있다. 첫째, 셀 첨부 파일 요구 사항을 다른 세포 유형에 대 한 달라질 수 있습니다. 가난한 셀 첨부 파일은 젤을 처음 관찰 된 경우 솔루션 내에 전조 ECM 단백질의 농도 증가 시키는 것이 좋습니다. 다른 ECM 단백질 fibronectin, 콜라겐, laminin, 또는 조합을의 다른 종류를 포함 하 여 대신 사용할 수 있습니다. 각 유형에 새로운 셀, 셀 첨부 히드로 패턴화 이전 최적화 되어야 합니다. 이 프로토콜은 또한 사용자 설계 포토에 대 한 수 있습니다. 원하는 응용 프로그램에 따라, 포토 생산할 수와 함께 다양 한 크기, 모양, 및 전반적인 패턴 기능. 균일 한 동원 정지는 포토 마스크의 부재에서 얻을 수 있습니다.
이 프로토콜에는 특정 제한이 있습니다. 대표 결과에 강조,이 메서드는 각 단계에서 UV 빛의 양을에 민감합니다. 하이드로 겔 형성 단계 과도 후속 표면 bioconjugation에 대 한 사용 가능한 아크릴 그룹을 제한합니다. 따라서이 프로토콜에서 중요 한 단계는 각 단계에 대 한 잘 관리 되는 UV 빛의 노출 시간. 또한,이 프로토콜 성공적인 패턴화 하기 위한 고 농도 단백질 재고를 요구 한다. 단백질의 낮은 농도 가난한 표면 패턴에 발생 합니다. 또한, 개별 패턴만 생산할 수 있는 포토도 제한. 더 복잡 한 패턴 비슷한 방법으로 달성 될 수 있다 그러나 더 고급 방법론을 요구 한다.
이 프로토콜은 기존의 방법에 중요 한 기판 강성과 단백질 패턴을 조정 하기 위한 간단한 방법을 제공 합니다. 하이드로 겔 형성을 위한 아크릴 화학을 사용 하 여 기판 강성 생리 적 범위 내에서 크기 범위에 대 한 수 있습니다. 단순히 솔루션 내에 전조 PEGDA의 농도 조정 하이드로 겔 강성 제어를 제공 합니다. 또한, 클릭 화학 단백질 패턴에 대 한 통해 히드로 기판 및 thiolated 사이 급속 한 활용에 대 한 단백질 수정. 이것은 주요 설계 기능,이 프로토콜을 어떤 단백질 또는 펩 티 드의에 적용 될 수 있습니다.
못 hydrogels 유망 바이오 생물 학적 시스템에 생 화 확 적인 신호를 표시 하기 위한 새로운 플랫폼을 탐구 하는 데 사용할 수 있습니다. 여부 균일 한 표면 동원 정지 또는 공간 특정 패턴, 이러한 기술을 셀 동작을 제어 하 새로운 방법을 제공 합니다. 앞으로 이동, 소재 기술의 발전 셀 동작에 새로운 통찰력을 제공 되며 체 외에 시스템 내 에서 vivo 신호 모티브를 정리 하는 우리의 기능을 추가. 이 줄기 세포 분화 및 발달 제어 실험 시스템 내에서 신호 모델링에 대 한 도움이 될 수 있습니다.

셀 동작에 영향을 주는 많은 자극을 확인 하 고 있습니다. 일반적으로, 일반적인 셀 자란 기법; 세포질 응답 유도 용 해 요소에 의존 그러나,이 접근 방식에는 한계가 있다. 이러한 메서드는 일반적으로 모든 신호 모티브를 정확 하 게 표시 수 없습니다 vivo에서. 이러한 신호 메커니즘 등 분리 된 성장 인자, 세포-세포 신호, 공간 특정 생 화 확 적인 신호입니다. 또한, 기판 강성 셀 동작 및 줄기 세포 분화에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 하 고 일반적인 셀 자란 사례1,2를 사용 하 여 쉽게 조작 하지는. 소재 접근 이러한 신호 메커니즘을 탐험을 시작 하는 새로운 플랫폼을 제공 합니다. 특히, hydrogels 기판 강성3,4, immobilizing 단백질 및 펩 티 드5,6, 튜닝 하 고 공간적으로 특정 패턴7, 을 만들기 위한 우수한 후보자는 8.
Hydrogels 건설 기계 조직 공학 세포 외 기질 (ECM)9,10그들의 생물 및 생 화 확 적인 공통점 때문에 일반적으로 사용 됩니다. 천연 고분자 생체 고 신체의 많은 조직에서 발견 되는 건설 기계에 대 한 일반적인 선택입니다. 천연 고분자를 사용 하 여 기판으로의 한계는 그들은 bioconjugation에 대 한 쉽게 조작된 화학 moieties 부족 이다. 다른 한편으로, 합성 hydrogels 같은 말뚝,으로 우수한 플랫폼 대상된 화학11,12. 또한, 말뚝 hydrogels 세포질 응답을 유도 하지 않습니다 하 고 따라서 생리 건설 기계를 만들기 위한 불활성 등뼈로 사용 됩니다.
만들려면 생리 hydrogels, photopolymerization 그리고 thiol ene 클릭 화학 반응 고용 됩니다. 이 photoreactions는 photoinitiator와 UV 광원을 필요로합니다. Photoinitiators는 UV 빛을 소개 하 고, 채권 양식 기를 휴식. 논문 래 디 칼 개시 반응에 필요 하지만 단백질 bioactivity12,13에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, photoinitiator 및 단백질 bioactivity를 유지 하기 위해 자외선 노출 시간을 최적화 하기 위해 결정적 이다.
이 방법에서는, hydrogels 아크릴-아크릴 체인 성장 photopolymerization 통해 합성 됩니다. 못-빛 (PEGDA) 단위체 분기 폴리머 네트워크는 하이드로 겔의 구조에 대 한 책임을 형성 하기 위하여 서로 함께 반응. 솔루션 내에 젤 선구자 PEGDA 단위체의 농도 기판 강성을 제어 합니다. 때문에 작은 크기는 하이드로 겔의 기 공, fibronectin 같은 ECM 단백질 셀 첨부 파일을 위해 하이드로 겔 내에서 쉽게 통합 될 수 있다. 마지막으로, 이러한 hydrogels 생리 활성 펩 티 드 표면 패턴 또는 단백질 thiol ene 통해 클릭 화학 반응. 여기, 하이드로 겔 시스템 내에서 unreacted 무료 아크릴레이트 단백질 또는 펩 티 드 UV 빛에 노출 되 면에 있는 무료 thiols와 반응 합니다. 단백질 또는 펩 티 드 히드로 표면에 움직일 수 있다, 후는 히드로 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안 bioactivity의 손실 없이. 이 편의성, 유연한 실험 계획 및 연구소 간의 협력에 대 한 가능성을 제공 합니다. 전반적으로,이 플랫폼 biomechanical 및 공간 생 화 확 적인 제어, 서로 독립적으로, 세포질 행동에 영향을 기회에 대 한 수 있습니다.

<table width="1237">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">PEG-diacrylate (PEGDA)</td>
			<td style="width:112px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:223px;">ACRL-PEG-ACRL-3400</td>
			<td style="width:665px;">Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:237px;height:60px;">Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:665px;">Synthesized in lab</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:112px;">Corning</td>
			<td style="width:223px;">356008</td>
			<td style="width:665px;">Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">D8537-500ML</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Photomask</td>
			<td style="width:112px;">FineLine Imaging</td>
			<td style="width:223px;">n/a</td>
			<td style="width:665px;">Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI.</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Binder Clips</td>
			<td style="width:112px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="width:237px;height:52px;">Compact UV Light Source (365nm)</td>
			<td style="width:112px;">UVP</td>
			<td style="width:223px;">UVP-21</td>
			<td style="width:665px;">Other UV light sources can be used, calibration of power is required.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="width:237px;height:57px;">2-iminothiolane (Pierce Traut&#8217;s Reagent)</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Sci.</td>
			<td style="width:223px;">26101</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="width:237px;height:82px;">Ellman&#8217;s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Sci.</td>
			<td style="width:223px;">22582</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="width:237px;height:52px;">human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td style="width:112px;">Lonza</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:665px;">passage number between 6- 10</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="width:237px;height:52px;">EGM-2 Media</td>
			<td style="width:112px;">Lonza</td>
			<td style="width:223px;">CC31-56, CC-3162</td>
			<td style="width:665px;">EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Life Tech</td>
			<td style="width:223px;">25200-056</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Trypsin Neutralizer</td>
			<td style="width:112px;">Life Tech</td>
			<td style="width:223px;">R-002-100</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:112px;">Various Venders</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:112px;">Hausser Sci. Bright-line</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="width:237px;height:51px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:223px;">E6758</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">0.22&#181;m filter</td>
			<td style="width:112px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:223px;">229743</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Glass Microscope Slides</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Sci.</td>
			<td style="width:223px;">12-550C</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Plastic spacers</td>
			<td style="width:112px;">Various Venders</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:665px;">0.5mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:112px;">BICCA</td>
			<td style="width:223px;">2546.70-1</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Bio-shield</td>
			<td style="width:112px;">Bio-shield</td>
			<td style="width:223px;">19-150-0010</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Bradford Reagent&#160;</td>
			<td style="width:112px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Desalting Resin - Sephadex G-25</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:223px;">95016-754</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">Microspin Columns</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Sci.</td>
			<td style="width:223px;">PI69725</td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="width:237px;height:35px;">AR-G2 rehometer</td>
			<td style="width:112px;">TA Instruments</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:665px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patterning bioactive proteins or peptides on hydrogel using photochemistry for biological applications

많은 생물학 자극 셀 동작 및 줄기 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다. 일반 셀 문화 접근 제어 셀 동작에 매체 내의 수용 성 요소에 의존합니다. 그러나, 녹는 추가 특정 매트릭스 바인딩된 성장 인자와 같은 모티프, 신호, 셀 셀 신호, 및 일반적인 영향 세포에는 공간 생 화 확 적인 신호를 모방 수 없습니다. 또한, 기판 강성 같은 매트릭스의 생물 속성 하지 쉽게 조작 되 기존의 셀 경작 관행을 사용 하 여 셀 운명에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이 방법에서는, 우리는 합성 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels 광화학을 사용 하 여에 꽃무늬 생리 활성 단백질을 제공 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 플랫폼 기판 강성 및 공간 생 화 확 적인 신호는 독립적으로 제어할 수 있습니다. 이러한 hydrogels 순수 관련 강성 값의 큰 범위를 얻을 수 있습니다. 또한, 이러한 hydrogels 표면 생리 활성 펩 티 드와 photopatterned 또는 단백질 thiol ene 통해 클릭 화학 반응. 이러한 메서드는 표면 동원 정지 후 단백질 기능을 유지 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 어떤 단백질 또는 펩 티 드의 다양 한 패턴을 만들에 적용할 수 있는 다양 한 프로토콜입니다. 마지막으로, 이러한 생리 hydrogels의 표면에 시드 셀 그들은 공간 특정 신호에 응답 시간이 지남에 모니터링할 수 있습니다.

못 hydrogels의 표면에 생리 패턴을 만들 수 프로토콜은 그림 1에 나와 있습니다. 스프레드시트 볼륨 및 각 재고 솔루션 (테이블 1A)에 대 한 농도 계산 하기 위해 개발 되었다. 단백질은 하이드로 겔의 표면에 움직일 수는 2-iminothiolane (그림 1B)로 수정 됩니다. 이 반응은 표 1B에서 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다. 선구자 히드로 솔루션 10% 무게/볼륨 랩 (그림 1A)와 PEGDA의 준비가 되어 있습니다. 다양 한 전조 PEGDA 농도 원하는 기판 강성 (그림 2A)를 사용할 수 있습니다. Fibronectin 셀 첨부 파일 목적이 전조 솔루션 내에서 포함 되어 있습니다. 철저 하 게 혼합 후,이 솔루션 준비 형으로 pipetted 이며 UV 빛 (그림 1C) 노출. 자외선 빛 노출 최소화 한다; 노출은 하이드로 겔을 생산 하기 위해 충분 해야 합니다. 하이드로 겔 샘플은 밖으로 원하는 잘 플레이트 (그림 1C)에 대 한 적절 한 직경에 구멍 뚫은 것. 표면 패턴화에 대 한 수정 된 단백질 해결책은 히드로의 표면에 pipetted 이며 균일 하 게 확산. 최소한의 볼륨을 사용 해야 합니다; 단백질 볼륨 단지는 히드로의 전체 표면을 커버 하기에 충분 해야 합니다. 미리 디자인 된 포토 마스크는 하이드로 겔 표면;에 직접 배치 됩니다. 기포는 하이드로 겔 마스크와는 피해 야 한다. UV 빛의 두 번째 라운드는 covalently는 히드로에 UV에 노출 된 단백질을 단백 결합 하는 데 사용 됩니다. 하이드로 겔 샘플은 unreacted 단백질을 제거 하 고 고정된 단백질 패턴 (그림 1D) 공개를 씻어 서.
그것은 단백질 있는지 photoinitiator 농도 UV 노출 시간을 최소화 해야 합니다. 지표로 서 lysozyme bioactivity를 사용 하 여, 우리는 발견 무릎 photoinitiator 농도 2 m m (그림 2B) 미만 이어야 한다 UV 노출 시간 미만 2 분그림 2(C)는 단백질을 유지 하기 위해 총 한다 bioactivity 보다 큰 80%입니다.
하이드로 겔 형성 및 단백질 패턴 중 UV 노출 시간 (그림 3) 성공적인 프로토콜을 개발 하기 위한 두 중요 한 매개 변수가 있습니다. 우선, 하이드로 겔 형성 동안 자외선 노출을 최소화 후속 단백질 동원 정지 반응(그림 3)에 대 한 무료 아크릴 기능 그룹을 유지 하기 위해 중요 하다. 2 분 보다 더 오랫동안 자외선에 노출 Hydrogels 고정된 단백질 패턴을 만들 수 없습니다. 또한, 단백질 패턴에 자외선 노출 증가, 더 많은 단백질 (그림 3B) 표면에 반응.
이에 셀 수 있다 경작 하는 마지막으로, 셀 동작을 조작 하는 하이드로 겔 기판 패턴. Hydrogels에 고정된 패턴의 잠재력을 표시, VEGF, 성장 인자, 내 피 세포에 대 한 중요 한 꽃무늬 하 고 기저 EGM 2 매체 (그림 4)를 사용 하 여 표면에 HUVECs를 경작. HUVECs는 VEGF 꽃무늬 못 hydrogels(그림 4)의 표면에 균일 하 게 시드 했다. 시드, 후에 2 일 HUVECs 고정된 VEGF (그림 4B, C)를 포함 된 하이드로 겔의 공간 지역으로 마이그레이션할 관찰 되었다. 이 못 hydrogels 셀 동작에 영향 하는 데 사용 되는 생리 활성 단백질 패턴의 한 예입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55873/55873fig1.jpg"> 
그림 1: 히드로 형성과 단백질 패턴의 도식. (A)와 PEGDA 단위체, photoinitiator, 세포 외 단백질 선구자 히드로 솔루션 셀 첨부 파일에 대 한 준비. (B) 수정 된 단백질 2 iminothiolane 반응 하 여 thiol 그룹을 무료. (C) 전조 솔루션 준비 금형으로 플라스틱 고는 하이드로 겔을 형성 하기 위하여 UV 빛에 노출. 원하는 크기의 하이드로 겔 샘플 펀치. (D) 피 펫, 하이드로 겔의 표면에 단백질 수정된 솔루션, 표면에는 포토 마스크 놓고 UV 빛의 두 번째 라운드에 노출 합니다. 이미징 및 셀 시드 이전 unreacted 종 제거 젤을 씻어. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55873/55873fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55873/55873fig2.jpg"> 
그림 2 : 변조 강성 및 단백질 bioactivity. 하이드로 겔 강성을 변조 하는 솔루션 내에 전조 젤 PEGDA 단위체의 농도 (A) 변화. (B) UV 노출의 1 분 후 단백질 기능을 낮추고 무릎 photoinitiator의 농도 증가. (C) 증가 UV 노출 시간 2 mm 무릎 단백질 기능을 낮춘 다. 모든 오차 막대 복제의 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55873/55873fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55873/55873fig3.jpg"> 
그림 3: 패턴 및 히드로 UV 노출 시간 단백질 패턴에 대 한 최적화. (A) 최소화 자외선 노출 시간 하이드로 겔 형성 표면 패턴화 할 수 있습니다. (B) 증가 UV 노출 시간 표면 패턴화 하기 위한 패턴 강도 증가 합니다. 스케일 바 = 200 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55873/55873fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55873/55873fig4.jpg"> 
그림 4: 내 피 세포는 VEGF 패턴과 응답. (A) 균일 한 HUVECs hydrogels에 시드. (B 와 C) HUVECs VEGF 패턴을 감지 하 고 고정된 VEGF로 마이그레이션할. 이미지는 4 배 및 (C) 10 배 확대 (B)에 뿌리기 후에 2 일을 촬영 했다. 스케일 바 = 500 µ m. HUVEC-Rfp (레드)와 VEGF 488 패턴 (녹색) 528/553 465에서 여기 및 방출 필터와 함께 체포 되었다/495, 각각.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_u href=""></a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_u>pload/55873/55873fig4large.jpg"target ="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55873/55873table1.jpg"> 
표 1: 주식 및 젤 전조 솔루션에 대 한 계산. 빨간색 상자 사용자 정의 값, 분자량, 등 원하는 재고 농도, 그리고 무게를 밖으로 대 중을 나타냅니다. 파란색 상자는 사용자 정의 값에 따라 계산 된 값을 나타냅니다.

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Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

patterning-bioactive-proteins-or-peptides-on-hydrogel-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.1K 조회수.  Rensselaer Polytechnic Institute. 이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .

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Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

광대역 의료 이미징 애플리케이션을위한 초음파의 광 검출기

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

연구

생체공학

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

시투에서 액체에 있는 생물학 어셈블리의 TEM

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

낮은 풍부 단백질을 검출하기위한 플라즈마 또는 소변의 하이드로 겔 나노 입자 수확

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

급속 하 고, 확장 가능한 어셈블리 및 플래시 Nanoprecipitation 통해 다양 한 합성 Nanocarriers에 생리 활성 단백질의 Immunostimulants 로드

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

충돌기 제트의 두 가지 모드를 사용 하 여 패턴 고해상도: 수요와 근처-필드 전기에

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...